目的:探讨一次果糖摄入对健康青年人血液抗氧化能力和肝酶的短期影响。方法:2019年1—6月招募青年健康受试者64例，按随机数字表法分为75 g葡萄糖组、25 g果糖组、50 g果糖组和75 g果糖组，每组16例。各组受试者按分组分别服用相应量的葡萄糖或果糖。服糖前及服糖后30、60、120和180 min检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化物歧化酶（SOD）、C-Jun氨基末端激酶（JNK）、丙二醛（MDA）、8-羟基脱氧鸟嘌呤（8-OHdG）水平，计算服糖后30、60、120和180 min ALT、AST和LDH较服糖前的变化值。结果:50 g果糖组1例、75 g果糖组2例、75 g葡萄糖组1例因服糖后不良反应退出，最终75 g葡萄糖组15例、25 g果糖组16例、50 g果糖组15例和75 g果糖组14例完成研究。25 g果糖组、50 g果糖组和75 g果糖组服糖后ALT和AST增幅明显高于75 g葡萄糖组，差异有统计学意义（ P<0.05）；四组服糖后LDH变化比较差异无统计学意义（ P>0.05）。服糖后180 min受试者工作特征（ROC）曲线分析结果显示，四组ALT、AST和LDH曲线下面积比较差异无统计学意义（ P>0.05）。四组服糖前SOD比较差异无统计学意义（ P>0.05），50 g果糖组和75 g果糖组服糖后60 min SOD及25 g果糖组、50 g果糖组和75 g果糖组服糖后180 min SOD明显低于75 g葡萄糖组[（4.84 ± 1.88）和（4.38 ± 1.12） μg/L比（6.25 ± 1.65） μg/L、（4.46 ± 1.66）、（5.22 ± 1.66）和（3.99 ± 0.96）μg/L比（6.55 ± 1.78）μg/L]，差异有统计学意义（ P<0.05）；四组服糖前后JNK、GPX、MDA和8-OHdG变化比较差异无统计学意义（ P>0.05）。服糖后180 min ROC曲线分析结果显示，75 g果糖组SOD曲线下面积明显小于75 g葡萄糖组（9.06 ± 1.88比12.74 ± 3.15），差异有统计学意义（ P<0.05）；四组GPX、JNK、MDA和8-OH-dG曲线下面积比较差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:一次果糖摄入可导致健康青年人血液抗氧化能力下降，氧化损伤增强，以及肝酶升高。

一些肾结石病是由单基因病所致，其中与嘌呤代谢相关的单基因病主要包括腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)缺乏症、次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HPRT)缺乏症、遗传性黄嘌呤尿症(HX)以及由PRS1、SLC22A12、SLC2A9和ABCG2等基因突变所致病症。这类疾病可导致嘌呤和尿酸代谢异常，进而形成2，8-二羟基腺嘌呤结石、尿酸结石或黄嘌呤结石等。此类疾病临床罕见，不同类型的与嘌呤代谢相关的单基因肾结石病的基因型和表型有其各自特点，且不被广泛认知。目前药物治疗是此类疾病的主要治疗方法。随着基因诊断和治疗技术的进步，不断有新的致病基因和位点被发现，同时随着CRISPR/Cas9等基因编辑技术的逐步应用，与嘌呤代谢相关的单基因肾结石病在未来有望从根本上得到治愈。

目的:探讨高氧环境对氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠肾脏代谢物的影响，了解病理性视网膜血管新生和肾损伤之间的潜在机制。方法:采用随机数字表法将16只健康SPF级C57/B6J新生小鼠随机分为OIR组与正常对照组，每组8只。小鼠自出生后标准饲养至第7天(P7)，OIR组小鼠和母鼠置于(75±2)%的高氧箱中饲养至P12，然后正常饲养；正常对照组一直在正常环境下饲养。各组小鼠在饲养P17时采用二氧化碳安乐死，取视网膜组织铺片并行血管异凝集素(IB4)染色，观察视网膜血管形态、中央无灌注区及病理性新生血管情况；另取小鼠肾组织进行液相色谱－质谱分析，取其对应小鼠的全血进行抗凝处理，通过离心沉淀，获得不含细胞成分的血浆，对血浆进行靶向代谢组学分析。使用代谢组学数据处理软件Progenesis QI v2.3对质谱信息进行解析，用无监督的主成分分析及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)来区分各组间代谢轮廓的总体差异，比较2个组间代谢物的倍数变化。以变量权重值>1且 P<0.05为条件筛选出差异代谢物。基于KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析。 结果:视网膜铺片IB4染色结果显示，P17时正常对照组小鼠视网膜血管分布均匀；OIR组小鼠视网膜周边血管迂曲、紊乱，中央可见大面积无灌注区域形成，在视网膜无灌注区和血管区交界处形成大量新生血管簇，呈强荧光染色。OIR组小鼠视网膜无灌注区相对面积为(25.16±3.50)%，明显大于正常对照组的(0.63±0.30)%，差异有统计学意义( t＝12.07， P<0.001)。OPLS-DA模型参数R2X cum、解释率R2Y cum、和预测率Q2 cum分别为0.578、0.978和0.857，表明OPLS-DA模型具有较好的预测能力。共筛选鉴定到26个主要的差异代谢物，其中上调表达17个，下调表达9个，包括甘油磷脂类化合物[PC 20∶4(5Z，8Z，11Z，14Z)/0∶0、PC 22∶6(4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)/0∶0、PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z，14Z)、PE P-18∶0/20∶4(6E，8Z，11Z，14Z)(5OH[S])]、氨基酸类代谢物(精氨酸、鸟氨酸、哌可酸和羟基赖氨酸)、嘌呤类(鸟嘌呤、次黄嘌呤、羟嘌醇)和脂肪酸类(15-棕榈酸甲酯、2，6，8，12-Tetramethyl-2，4-tridecadien-1-ol)等。差异代谢物主要富集于ABC转运蛋白(L-精氨酸、牛磺酸、肌醇、腺苷、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖、L-谷氨酰胺)、氨酰-tRNA生物合成(L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酰胺)、精氨酸生物合成(L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-谷氨酰胺)等代谢通路。血浆的靶向代谢组学结果显示，差异的氨基酸类代谢产物主要富集于氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成代谢以及ABC转运蛋白等代谢通路。 结论:OIR小鼠的ABC转运蛋白、氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成代谢通路可能参与了肾损伤及早产儿视网膜病变新生血管形成的病理变化过程。

目的:探讨高压氧(HBO)干预对体外培养的正常和缺氧状态人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化损伤的影响。方法:体外培养正常和缺氧状态(200 μmol/L CoCl 2干预)人RPE-19细胞，随机分成对照组(正常对照组和缺氧对照组)和HBO组[正常HBO组(0.15 MPa HBO组，0.20 MPa HBO组，0.25 MPa HBO组)和缺氧HBO组(缺氧+0.15 MPa HBO组，缺氧+0.20 MPa HBO组，缺氧+0.25 MPa HBO组)]。各HBO组在纯氧下分别暴露60、90 min，每隔24 h暴露一次，共暴露2次。以MTT法检测各组RPE细胞的增殖活力；以免疫细胞化学方法检测RPE细胞内8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHdG)的表达量；以Western blotting法检测RPE细胞内人8-羟基鸟嘌呤糖苷酶(hOGG1)的表达量。每组实验均重复3次。 结果:在HBO干预60、90 min后，对于正常RPE细胞，与正常对照组相比，各压力HBO干预组细胞OD 570值均降低( P<0.01)，且随着压力的升高而降低( P<0.05)；细胞内8-OHdG表达量明显增加( P<0.01)，且随着压力的升高而增加( P<0.05)；细胞内hOGGl表达量增加( P<0.01)，且在60min组随着压力的升高而降低( P<0.05)。对于缺氧RPE细胞，与缺氧对照组相比，各压力HBO干预组细胞OD 570值均升高( P<0.01)，且在60 min组随着压力的升高而升高( P<0.01)；细胞内8-OHdG表达量明显降低(60 min P<0.01, 90 min P<0.05)，且60 min组随着压力的升高而降低( P<0.05)；细胞内hOGGl表达量明显增加( P<0.01)，且随着压力的升高而增加(60 min P<0.05, 90 min P<0.01)。 结论:HBO暴露可导致正常RPE细胞的氧化损伤，但可修复缺氧导致的RPE细胞的氧化损伤。

目的:探讨急性低压缺氧对大鼠视网膜DNA的损伤作用及黄芪复方对其保护作用。方法:取雄性清洁级成年SD大鼠72只，按照计算机数字随机分配法随机分为常氧对照组、低氧模型组和黄芪复方灌胃组，每组24只。常氧对照组大鼠在常氧环境下喂养，低氧模型组及黄芪复方灌胃组大鼠置于模拟海拔高度5 km的低压氧舱内喂养，同时黄芪复方灌胃组大鼠每日黄芪复方制剂(0.1 g/kg)灌胃给药1次，低氧模型组大鼠每日灌胃给予等容量生理盐水1次。连续给药7 d后，过量麻醉法处死大鼠，剥离各组大鼠视网膜，采用组织病理学染色法观察各组大鼠视网膜组织形态；采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜DNA损伤标志物p53和DNA损伤修复磷酸化蛋白组蛋白家族2月变异体(γH2AX)的表达；采用实时荧光定量PCR法检测8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶(MTH1)和8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)mRNA表达水平。结果:低氧模型组大鼠视网膜较常氧对照组和黄芪复方灌胃组增厚，其中以神经纤维层及视网膜神经节细胞层增厚明显。低氧模型组大鼠视网膜p53与γH2AX阳性染色程度较常氧对照组和黄芪复方灌胃组增强。低氧模型组视网膜MTH1 mRNA和OGG1 mRNA相对表达量分别为0.573±0.081和0.772±0.136，明显低于常氧对照组的0.846±0.160和1.013±0.168，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。黄芪复方灌胃组视网膜MTH1 mRNA相对表达量为0.748±0.114，明显高于低氧模型组，差异有统计学意义( P<0.05)，而2个组OGG1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义( P＝0.743)。 结论:急性低压缺氧诱导大鼠视网膜DNA损伤，黄芪复方制剂灌胃给药对其有保护作用，其机制可能与调节p53、γH2AX、MTH1以及OGG1的表达有关。

目的:研究子痫前期胎盘中第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homologue-deleted chromosome ten gene，PTEN)、Syncytin-1与母体内皮损伤、滋养细胞损伤的相关性。方法:选择2015年2月至2017年12月在南方医科大学附属小榄医院诊断为子痫前期并分娩的46例患者及同期正常分娩的的80名孕妇，分娩前留取母体外周血并测定内皮损伤标志物的含量，分娩后留取胎盘并测定PTEN、Syncytin-1、细胞凋亡基因的表达量以及氧化应激标志物的含量。结果:子痫前期胎盘组织中PTEN的mRNA表达量显著高于正常胎盘组织( t＝32.797、 P<0.000)，Syncytin-1的mRNA表达量显著低于正常胎盘组织( t＝28.506、 P<0.000)；子痫前期患者母体血液循环中内皮素-1(endothelin-1，ET-1)、可溶性血管内皮生长因子受体-1(soluble fms-like tyrosine kinase receptor 1，sFlt-1)的含量显著高于正常妊娠孕妇( t值分别为39.884、40.243、 P均<0.001)，且与胎盘组织中PTEN的mRNA表达量呈正相关(相关系数分别为0.674、0.596， P分别为0.004、0.007)，与Syncytin-1的mRNA表达量呈负相关(相关系数分别为－0.615、－0.637， P分别为0.009、0.008)，一氧化氮(nitric oxide ，NO)、前列腺素I 2(prostaglandin I2，PGI2)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)、胎盘生长因子(Placental growth factor ，PLGF)的含量显著低于正常妊娠孕妇( t值分别为30.944、27.404、32.827、26.644、 P均<0.001)，且与胎盘组织中PTEN的mRNA表达量呈负相关(相关系数分别为－0.648、－0.592、－0.537、－0.613， P分别为0.006、0.009、0.013、0.007)，与Syncytin-1的mRNA表达量呈正相关(相关系数分别为0.632、0.572、0.537、0.654， P值分别为0.010、0.013、0.015、0.009)；子痫前期胎盘组织中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-reduced oxidase 4，NOX4)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、8-羟基脱氧鸟苷酸(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)的含量以及自杀相关因子(factors associated suicide ，Fas)、Fas配体(fas ligand，FasL)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 ，GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein ，CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteine-containing aspartic acid proteolytic enzymes-3，Caspase-3)的mRNA表达量显著高于正常胎盘组织( t值分别为27.714、27.704、26.786、22.622、27.964、25.496、25.893、30.837、28.975、 P均<0.001)，且与胎盘组织中PTEN的mRNA表达量呈正相关(相关系数分别为0.703、0.651、0.593、0.628、0.449、0.552、0.612、0.569、0.502， P值分别为0.003、0.007、0.004、0.006、0.016、0.010、0.006、0.012、0.018)，gn Syncytin-1的mRNA表达量呈负相关(相关系数分别为－0.615、－0.714、－0.577、－0.548、－0.512、－0.585、－0.619、－0.495、－0.662， P值分别为0.009、0.001、0.013、0.015、0.018、0.011、0.009、0.023、0.003)，Peroxiredoxin-Ⅱ蛋白(PrxⅡ)、PrxⅢ、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)的含量以及B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的mRNA表达量显著低于正常胎盘组织( t值分别为26.115、23.502、21.439、17.194、 P均<0.001)，且与胎盘组织中PTEN的mRNA表达量呈负相关(相关系数分别为－0.713、－0.657、－0.591、－0.642， P值分别为<0.001、0.006、0.009、0.007)，与Syncytin-1的mRNA表达量呈正相关(相关系数分别为0.562、0.711、0.682、0.608， P值分别为0.013、<0.001、0.002、0.008)。 结论:子痫前期胎盘中PTEN的高表达以及Syncytin-1的低表达能够加重母体内皮损伤以及胎盘滋养细胞损伤。

细胞内存在多种类型的RNA分子,在调控细胞进程中各自发挥着重要的作用.RNA修饰是在RNA分子上添加化学基团,修饰基团可以改变RNA稳定性、结构和功能,RNA修饰使RNA的功能和作用具有多样性.在氧化应激条件下,8-羟基鸟嘌呤是一种标志性的RNA氧化修饰形式.RNA的结构与功能都可能会受到8-羟基鸟嘌呤修饰的影响,RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰发生可以通过诱导RNA链断裂、碱基脱落等方式影响RNA的结构与功能.研究表明,RNA中8-羟基鸟嘌呤修饰水平可以作为疾病发展的评估指标.随着RNA修饰研究的深入,对RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰的研究也日益受到重视.本文主要对RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰的生成、RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰的生物学功能、RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰修复调控相关蛋白质分子、8-羟基鸟嘌呤修饰RNA分子检测技术,以及RNA 8-羟基鸟嘌呤与神经性疾病和癌症等疾病的关系研究进展进行综述,旨在为RNA修饰的生物学功能和8-羟基鸟嘌呤修饰RNA在疾病中的潜在作用研究提供思路和启示.

目的:探讨依帕司他(Epa)对放射性肺炎(RP)小鼠线粒体氧化应激损伤的影响及其机制.方法:C57BL/6小鼠随机对照(CON)组、放射(IR)组、IR联合10 mg/kg Epa处理组及IR联合20 mg/kg Epa处理组,每组各16只.采用6MVX线直线加速器全胸单次照射15 Gy建立放射性肺炎模型.照射后连续灌胃给药6～8周.HE染色观察肺组织病理变化.透射电镜观察肺组织线粒体结构.ELISA检测血浆白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及转化生长因子-β1(TGF-β1)的水平.免疫组化检测肺组织醛糖还原酶(AR)的表达.比色法检测肺组织丙二醛(MDA)及4-羟基壬烯醛(4-HNE)含量.制备肺组织单细胞悬液,使用DCFH-DA探针检测细胞内活性氧(ROS)水平.实时定量 PCR 检测 AR、IL-6、TNF-α 和TGF-β1 mRNA 的表达.Western blot 法检测 AR、IL-6、TNF-α、TGF-β1、BAX、Bcl2、Cleaved Caspase-3、8-氧鸟嘌呤 DNA糖基化酶1(OGG1)及沉默信号调节因子3(SIRT3)的蛋白水平.结果:与CON组相比,IR组肺泡水肿,肺泡间隔增厚并伴大量炎症细胞浸润;炎症因子IL-6、TNF-α和TGF-β1的水平明显升高(P＜0.01);Bcl2的表达明显下调而BAX、Cleaved Caspase-3的表达明显上调(P＜0.05,P＜0.01).与IR组相比,Epa连续给药6～8周后,小鼠肺组织炎症损伤明显减轻,炎症因子IL-6、TNF-α和TGF-β1的水平明显降低(P＜0.05,P＜0.01),细胞凋亡程度明显减轻(Bcl2的表达上调而BAX、Cleaved Caspase-3的表达下调).与CON组相比,IR组AR的表达明显升高,ROS、MDA及4-HNE的水平明显增加(P＜0.01),OGG1和SIRT3的表达明显降低(P＜0.01),线粒体损伤明显加剧.而与IR组相比,Epa连续给药6～8周后,IR组AR的表达明显下调(P＜0.05,P＜0.01),ROS、MDA及4-HNE的水平明显降低,OGG1和SIRT3的表达明显增加,线粒体损伤明显减轻(P＜0.05,P＜0.01).结论:Epa对放射性肺炎具有保护作用,其作用可能与其抑制AR的表达,减轻线粒体氧化应激损伤,抑制炎症反应和细胞凋亡有关.

目的 探讨萝卜硫素对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞脂质积聚的影响和作用机制.方法 将细胞分为对照组、ox-LDL组(100μg·mL-1 ox-LDL)、萝卜硫素低剂量组(100 μg·mL-1 ox-LDL+5 μmol·L-1 萝卜硫素)、萝卜硫素高剂量组(100μg·mL-1 ox-LDL±10 μmol·L-1萝卜硫素)、si-OGG1 组(100 μg·mL-1 ox-LDL+10 μmol·L-1 萝卜硫素+转染si-OGG1).以蛋白质印迹法检测各组细胞蛋白表达水平,以酶联免疫吸附测定法检测各组细胞炎性因子及8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)表达水平,以氧化酶法检测细胞内胆固醇水平,以探针法检测活性氧(ROS)水平,以流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果 对照组、ox-LDL组、萝卜硫素低剂量组、萝卜硫素高剂量组、si-OGG1组的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1(OGG1)蛋白相对表达水平分别为 0.80±0.03、0.26±0.02、0.43±0.03、0.68±0.05 和 0.29±0.04,8-OHdG水平分别为(3.02±0.16)、(23.02±1.07)、(18.28±1.40)、(13.05±1.42)和(17.39±1.53)ng·mL-1,总胆固醇含量分别为(0.08±0.01)、(0.39±0.01)、(0.28±0.01)、(0.17±0.02)和(0.30±0.02)mmol·g-1,ROS 水平分别为 1.66±0.10、8.23±0.78、5.41±0.15、3.27±0.24和 7.01±0.41,细胞凋亡率分别为(3.64±0.31)％、(21.72±2.70)％、(16.60±1.18)％、(10.04±0.52)％和(16.07±1.46)％.对照组的上述指标与ox-LDL组比较,萝卜硫素低、高剂量组的上述指标与ox-LDL组比较,si-OGG1组的上述指标与萝卜硫素高剂量组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 萝卜硫素可能通过上调OGG1表达抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质积聚.

目的:观察槲皮素对苯并(a)芘致大鼠生殖损伤的修复作用并探讨其保护机制.方法:将 30 只雄性大鼠按随机数字表法分为溶剂对照组、模型组、槲皮素组,每组10 只.除溶剂对照组外,其余组大鼠连续 30d灌胃给予 80 mg·kg-1 的苯并(a)芘溶液进行染毒诱导生殖功能损伤.从第11 天开始,槲皮素组大鼠灌胃给予100 mg·kg-1的槲皮素溶液,其余组大鼠灌胃给予等体积玉米油,持续20 d.给药完成后,取大鼠睾丸、附睾、精囊腺,并称其质量,计算脏器指数;取右侧附睾制备精子混悬液检测精子密度及总活力;精子染色质结构分析法(sperm chromatin structure assay,SCSA)检测精子DNA碎片率(DNA fragmenta-tion index,DFI);ELISA检测大鼠血清促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、睾酮(testostrone,T)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的水平;HE染色观察睾丸组织病理学变化;采用 Western Blot检测X射线修复交叉互补蛋白1(X-ray repair cross complementing 1,XRCC1)、8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(8-Oxoguanine DNA glycosylase,OGG1)、caspase-3、caspase-9 蛋白表达水平.结果:与溶剂对照组比较,模型组大鼠体质量、睾丸质量、附睾质量、精囊腺质量、睾丸指数、附睾指数、精囊腺指数、精子密度及总活力显著下降,DFI显著升高,FSH、LH、T、SOD、ATP水平明显降低,MDA、NO水平明显升高,XRCC、OGG1 蛋白表达水平显著降低,caspase-3、caspase-9 蛋白表达水平显著升高;与模型组比较,槲皮素组大鼠体质量、睾丸质量、附睾质量、精囊腺质量、睾丸指数、附睾指数、精囊腺指数、精子密度及总活力显著升高,DFI显著下降,FSH、LH、T、SOD、ATP水平明显升高,MDA、NO水平明显降低,XRCC1、OGG1 蛋白表达水平显著升高,caspase-3、caspase-9蛋白表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05).HE染色显示,槲皮素可明显减轻生殖功能损伤大鼠睾丸损伤程度,生精小管边界变清晰,生精上皮厚度明显恢复,生精细胞数量增多,部分管腔内能够见到成熟精子,变性的间质细胞减少.结论:槲皮素能够修复由苯并(a)芘引起的大鼠生殖损伤,其机制可能与激活睾丸组织中碱基切除修复(base excision repair,BER)信号通路及抗氧化应激有关.