紫苏(Perilla frutescens)含有丰富的生物活性物质和营养成分,是严格的短日照植物.目前,对紫苏的研究主要集中在产量和脂肪酸积累等农艺性状,而对紫苏开花进程及花器官形成的研究较少,其分子调控机制尚不明确.FLOWERING LOUC T(FT)是目前公认的感知光周期的关键基因,在花转变中发挥重要作用.PfFT3是FT-like亚家族基因,其在植物开花调控的功能尚待揭示.本研究首先通过亚细胞定位证明PfFT3定位于细胞核和细胞质.之后构建植物表达载体pCAM-BIAI1303-PfFT3,并通过农杆菌介导的花序浸染法转化野生型Col-0和突变体fd-2、fd-3和ft-10拟南芥,以此分别获得稳定遗传的纯合的过表达和回补转基因株系.结果分析表明,PfFT3的过表达能够显著促进拟南芥开花并且能够挽救突变体fd-2、fd-3和ft-10的晚花表型,进一步研究表明,外源PfFT3基因的表达促进下游内源开花基因AtSOC1、AtAP1、AtFUL和AtLFY的表达.综上所述,本研究阐明了 PfFT3在促进开花过程的积极作用,为深入研究PfPEBP基因的功能及紫苏短日照早花优良种质培育奠定基础.

猪苓菌核栽培中种苓质量不稳定是影响猪苓菌核品质和产量的关键问题,该文拟对根癌农杆菌介导的猪苓遗传转化体系进行研究,为通过分子育种从而获得优质种苓提供技术保障.采用根癌农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、受体材料、侵染时间、共培养时间和筛选条件对猪苓遗传转化效率的影响,利用潮霉素抗性标记基因、特异引物PCR以及荧光检测方法筛选并检测转化子.结果表明,根癌农杆菌GV3101菌株可对猪苓菌丝进行遗传转化,菌液浓度A600nm=0.6,受体材料猪苓菌丝,侵染30 min,共培养3 d为最佳侵染条件;9 μg·mL-1潮霉素初筛和13 μg·mL-1潮霉素复筛两步筛选法为最优筛选条件.经潮霉素抗性筛选、特异引物PCR检测和荧光检测分析,结果表明外源基因eGFP已转入猪苓菌丝内整合到基因组中并成功表达,在最优条件下,转化率可达到2.3％,遗传转化周期从大于90 d缩短到小于60 d.该研究建立并优化了根癌农杆菌介导的猪苓菌丝遗传转化体系,为解析猪苓生长发育的分子机制及分子育种奠定基础.

目的:对丝氨酸水解酶家族1（FSH1）蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析。方法:以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为模板，PCR扩增FSH1基因及EGFP基因；同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA，将扩增的EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体；将扩增的FSH1基因及EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体Ptrcp-FSH1-EGFP-Ttrcp。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法，用重组质粒转化犬小孢子菌，使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子（Ptrpc）和终止子（Ttrpc）调控下在犬小孢子菌中整合型表达，利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果:成功构建根癌农杆菌转化系统及犬小孢子菌EGFP表达载体；融合基因FSH1-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜显示FSH1-EGFP融合蛋白的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中。结论:FSH1-EGFP融合蛋白成功定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中，为进一步明确犬小孢子菌FSH1基因的功能及致病机制奠定了基础。

由细粒棘球绦虫（Eg）续绦期幼虫引起的囊型棘球蚴病（CE）是目前我国重点防控的寄生虫病之一。Eg95蛋白是一种公认的疫苗候选分子，研制载体介导的Eg95疫苗是当前CE研究热点之一。本文概述了牛痘病毒、羊口疮病毒、山羊痘病毒、狂犬病毒、鼠伤寒沙门菌、卡介苗、根癌农杆菌和两歧双歧杆菌等载体介导的Eg95疫苗的研制现状，旨在为CE的免疫预防研究提供有价值的资料。

蒙古冰草(Agropyron mongolicum)亦称沙芦草,为禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)冰草属(Agropyron)多年生疏丛型牧草,具有饲用价值高、抗寒耐旱以及耐盐、耐瘠薄、耐风沙等特性,是改良天然草场的适宜草种与挖掘优良耐逆基因资源的重要材料.然而,目前尚未建立蒙古冰草高效遗传转化体系,制约了该物种的基因资源鉴定与遗传改良应用.以蒙农1号蒙古冰草种子为来源的高再生效率的胚性愈伤系#89为外植体,建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介导的蒙古冰草稳定遗传转化体系,转化效率达30％.此外,针对多次继代后蒙古冰草愈伤系再生能力退化的难题,通过在再生培养基中添加1 mg·L-1 ABA或提高蔗糖浓度至45g·L-1,成功将再生能力衰退的蒙古冰草愈伤系再生效率由5％分别提高至35％与42％.研究结果为后续蒙古冰草基因编辑体系建立、基因功能鉴定和新品种培育奠定了重要技术基础.

目的 对艾草Artemisia argyi β-石竹烯合成酶基因(β-caryophyllene synthase,AaCPS)进行全长克隆、亚细胞定位与表达模式分析,为艾草倍半萜生物合成途径中的基因功能解析奠定基础.方法 基于艾草转录组数据筛选注释为CPS的基因,采用PCR方法克隆获得目的基因cDNA的全长,对其编码区进行生物信息分析;构建原核表达载体,转化至大肠杆菌中进行诱导表达;构建绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,利用农杆菌侵染烟草叶片的瞬时表达法进行亚细胞定位分析;运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析不同采收期(4月、5月、6月、7月)AaCPS基因表达模式,HS-SPME-GC-MS测定β-石竹烯含量并进行相关性分析.结果 从艾草中克隆得到的AaCPS基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)为1647 bp,编码548个氨基酸,相对分子质量为63 667 Da,等电点为5.40,含Terpene_synth和Terpene_synth_C保守结构域.系统进化分析显示AaCPS蛋白与同科植物黄花蒿CPS蛋白的亲缘关系最近.SDS-PAGE结果证实在75 000-120 000 Da出现目的蛋白条带(包含28 132 Da的标签蛋白),说明所获基因能够成功表达出蛋白;亚细胞定位显示其编码蛋白位于细胞质中;实时荧光定量PCR结果表明AaCPS基因表达量呈上升趋势,在7月达到最高.HS-SPME-GC-MS结果显示β-石竹烯含量从4月逐渐升高,在6月达到最高,与4-6月AaCPS基因表达量趋势总体一致.结论 通过对AaCPS基因的克隆与分析,为进一步研究该基因在艾草倍半萜物质生物合成途径的功能鉴定奠定基础.

为探究CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建烟草突变体库的可行性,该研究以烤烟品种'红花大金元'为实验材料筛选了 100 个可能参与烟草香气代谢的基因,设计相应的 100 个 sgRNA 并构建了由 100 个CRISPR/Cas9 编辑载体组成的质粒库,获得转基因材料后分析了载体的共转化率、靶向编辑率和脱靶编辑情况.结果表明:(1)通过农杆菌介导 100 个sgRNA的共转化后,在 172 个阳性转化株中检测到了其中的77 个sgRNA,共转化率为 77%.(2)在 77 个携带sgRNA的转基因后代中,69 个sgRNA对目标基因进行了靶向编辑,编辑率为 89.6%.(3)脱靶位点测序检测发现,只有 1 个sgRNA在非目标靶位点产生了脱靶编辑,表明CRISPR/Cas9 基因编辑技术在烟草中的脱靶概率非常低.综上所述,利用CRISPR/Cas9 载体库共转化对烟草基因进行高通量靶向编辑以构建突变体库的方法切实可行,并且该方法有共转化率高、编辑率高和脱靶编辑概率低等特点.

[目的]bHLH转录因子数量众多,能够广泛参与植物的生长发育和逆境胁迫等过程.试验以蒺藜苜蓿R108为材料,克隆MtbHLH25基因并探究其功能,为研究蒺藜苜蓿bHLH转录因子的功能提供帮助.[方法]通过PCR扩增技术从蒺藜苜蓿中克隆MtbHLH25基因和启动子,构建酵母表达载体,并用LiAc转化法转移到Y2H Gold酵母菌株中进行酵母自激活检测,构建亚细胞定位载体,并通过冻融法转入农杆菌EHA105,菌液注射到烟草下表皮细胞后,用SP8激光共聚焦显微镜观察,通过实时荧光定量PCR技术研究MtbHLH25基因的时空表达水平.[结果](1)从蒺藜苜蓿中克隆出MtbHLH25基因和启动子,该基因总长882 bp,共编码293个氨基酸.启动子序列分析表明其包含ABA、MeJA、GA和SA等响应元件.(2)MtbHLH25蛋白与蚕豆和长柔毛野豌豆中bHLH蛋白高度同源.(3)MtbHLH25蛋白定位于细胞核.(4)酵母自激活检测结果显示MtbHLH25蛋白具有自激活活性.(5)MtbHLH25在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花和果实中均有表达,其中在根中表达水平最高;外源SA、MeJA、ABA、GA以及盐胁迫使MtbHLH25基因表达量都呈下降趋势,表明SA、MeJA、ABA、GA以及盐胁迫对MtbHLH25基因表达起负调控作用.干旱胁迫能够显著诱导MtbHLH25基因表达量上调,说明该转录因子在干旱胁迫中起正调控作用.[结论]MtbHLH25基因对盐胁迫敏感,在干旱胁迫中发挥正调控作用;MtbHLH25蛋白具有自激活活性,对下游启动子调控的报告基因具有激活作用.

地黄为我国传统的常用大宗中药材,具有清热凉血、养阴生津之功效.环烯醚萜苷是地黄药材的主要活性成分,环烯醚萜氧化酶是环烯醚萜苷生物合成途径的关键限速酶.该研究基于转录组数据,筛选到 1 条环烯醚萜氧化酶基因RgIO,对其进行了系统的生物信息学、表达特性和亚细胞定位分析.结果表明,RgIO的编码区为 1 536 bp,编码 511 个氨基酸,相对分子质量 58 258.01.RgIO的蛋白序列包含细胞色素P450 氧化酶的保守结构域和基序,与列当科 3 个植物独脚金、黄独脚金和大花胡麻草的同源蛋白序列一致性最高,与长春花CrIO的序列一致性也高达 77.28%.RgIO在地黄的叶中特异性高表达,而且响应茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导,MeJA处理3、6 h,在叶和块根中其表达量分别增加了 3.15、1.3 倍.亚细胞定位结果显示RgIO分布在内质网上.利用根癌农杆菌介导法在地黄叶片中瞬时表达RgIO,梓醇的含量较瞬时表达空载体的对照增加了 0.82倍.该研究为地黄梓醇的分子调控和生物合成提供了关键的靶基因,也为完整解析地黄梓醇的生物合成途径奠定了基础.

该研究旨在通过耐盐能力、产吲哚乙酸(IAA)能力、溶磷能力、产铁载体能力等指标评价一株甘草内生尖孢镰刀菌的体内功能,通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术建立该菌的稳定遗传转化体系,并通过标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的克隆和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色的效率检测转化子的稳定性与染色高效性,筛选出高效稳定的转化子用于回染甘草,评价其对甘草幼苗生长的影响.研究结果表明该菌耐盐性较好,在含 7%氯化钠的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上仍能生长,但生长速度随着PDA培养基中氯化钠含量的增高而减缓;该菌具有产吲哚乙酸的功能,其发酵液中IAA的质量浓度约为 3.32 mg·mL-1.该研究成功构建了该菌的遗传转化体系,且其根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)体系高效而稳定.筛选获得 1株兼具染色高效性和遗传稳定性的转化子,该转化子在甘草植株中的回染率为 76.92%,能够显著提高一月龄甘草幼苗的主根长,促进甘草幼苗根部的生长发育.该研究结果可以为生物菌肥的开发及优质甘草的生长调控奠定基础.