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基于重组酶介导的等温扩增和CRISPR-Cas13a检测幽门螺杆菌的方法的建立
编辑人员丨5天前
目的:开发一种基于重组酶介导的等温扩增(RAA)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白(Cas13a)系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法:选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列,设计RAA-Cas13a 核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA(crRNA)。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对,并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列,构建了RAA-Cas13a核酸检测体系,通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA,评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法同时检测临床菌株,得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对 t检验对两组间的荧光值进行比较, P<0.05为差异有统计学意义。 结果:建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA( t=11.05, P<0.01),且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性,Kappa系数为1。 结论:建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法,可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。
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编辑人员丨5天前
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LiaSR双组分信号转导系统调控变异链球菌耐酸和生物膜形成能力的机制研究
编辑人员丨5天前
目的:探究LiaSR双组分信号转导系统对变异链球菌(Sm)593号(Sm 593)临床株耐酸和生物膜形成的影响及相关机制。方法:以Sm 593及其liaS和liaR基因敲除株为研究菌株,采用全自动生长曲线测定仪检测并绘制pH=5.5环境中各菌株的生长曲线;用菌落计数法检测细菌的适应性耐酸能力;使用Laurdan探针、氢-钾腺苷三磷酸(ATP)酶试剂盒、质子通透性检测实验和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)探究LiaSR双组分信号转导系统介导的耐酸机制。体外构建各菌株的生物膜,通过结晶紫染色法、菌落计数法、SYTOX探针检测法和蒽酮-硫酸法探究各菌株的生物膜总量、活菌数、胞外DNA(eDNA)和胞外多糖含量;采用RT-qPCR法检测胞外多糖合成相关基因的表达情况。结果:pH=5.5环境中,liaS和liaR基因敲除株的生长受到显著抑制( P<0.05)。适应性耐酸曲线显示敲除株与野生株相比,固有耐酸和适应性耐酸能力均显著下降( P<0.05)。对三菌株无预酸化处理20和40 min以及预酸化处理20和40 min后,liaS基因敲除株生存率[(8.98±2.00)%、(0.18±0.07)%、(14.88±8.64)%、(0.82±0.91)%]和liaR基因敲除株生存率[(0.38±0.19)%、(0.34±0.18)%、(7.89±2.02)%、(1.52±0.37)%]均分别显著低于野生株[(32.49±9.75)%、(1.27±0.32)%、(62.76±29.06)%、(8.02±1.25)%](均 P<0.05)。此外,liaS和liaR敲除株膜流动性(0.18±0.04和0.18±0.05)均显著低于野生株(0.08±0.05)(均 P<0.01);不饱和脂肪酸合成基因fabM表达水平(0.52±0.11和0.57±0.05)与野生株(1.04±0.30)相比均显著降低约1/2(均 P<0.001);H +-ATP酶活性(917.06±59.53和469.53±47.65)与野生株(127.00±50.71)相比显著升高7.22和3.70倍(均 P<0.001),且编码H +-ATP酶基因atpD的表达水平(3.39±0.21和1.94±0.17)也较野生株(1.00±0.15)显著升高3.39和1.94倍(均 P<0.01)。liaR基因敲除株的终末pH值(4.76±0.01)显著低于野生株(4.90±0.00),liaS基因敲除株的终末pH值(5.19±0.01)显著高于野生株(均 P<0.001)。liaS和liaR基因敲除株与野生株相比,Sm 593生物膜总量未发生明显变化,生物膜活菌数均显著少于野生株(均 P<0.05),且eDNA含量均显著高于野生株(均 P<0.01)。liaS基因敲除株生物膜水溶性多糖含量与野生株相比显著增加1.88倍( P=0.003)。liaS和liaR基因敲除株胞外多糖合成相关基因gtfD表达水平较野生株显著升高47.43和16.90倍(均 P<0.05),liaS基因敲除株中gtfC基因比野生株显著高表达1.65倍( P=0.014)。 结论:LiaSR双组分信号转导系统通过调控膜不饱和脂肪酸合成和胞膜流动性,参与Sm 593的耐酸过程;LiaR反应调节蛋白还可参与调节膜质子通透性,增强Sm 593的耐酸能力;此双组分信号转导系统可负向调控生物膜胞外基质的产生。
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编辑人员丨5天前
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一例Menkes病患儿的基因变异分析
编辑人员丨5天前
目的:对一例疑诊Menkes病患儿进行临床和遗传学分析。方法:提取患儿及其父母基因组DNA,行家系全外显子测序及多重连接探针扩增技术检测ATP7A基因微重复、缺失,对疑似致病变异行生物信息学分析,并对患儿及其父母行一代测序验证变异位点。结果:在受检者ATP7A基因发现c.1870-13T>G的核苷酸变异,为新发剪切变异。结论:该患儿为ATP7A基因c.1870-13T>G变异而导致Menkes病,家系全外显子测序为表型异质性强的遗传性疾病提供了有力工具。
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编辑人员丨5天前
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黑素瘤相关DNA甲基化位点的初步筛查及异常甲基化谱的构建
编辑人员丨5天前
目的:运用基因芯片技术筛查与黑素瘤相关的DNA异常甲基化位点,初步构建黑素瘤特异性甲基化谱。方法:采用Illumina Human Methylation 450K全基因组甲基化芯片对6例黑素瘤组织及其瘤旁组织标本进行全基因组DNA检测,得出差异DNA甲基化位点。采用Gene Ontology(GO)富集分析及KEGG_Pathway分析了解基因功能。结果:基因芯片检测结果显示,黑素瘤组织与瘤旁组织存在差异甲基化位点,共27 779个,其中16 673个为高甲基化位点,11 106个低甲基化位点。提高筛选条件为 P < 0.01、︳Δβ︳> 0.2,过滤掉所有单核苷酸多态性相关探针、位于XY染色体上的探针以及交叉反应的探针,共筛选得到4 883个差异甲基化位点,其中1 459(30%)个位于启动子区(包括TSS1500、TSS200、5′UTR、1st Exon)。GO富集分析显示,差异甲基化基因参与的生物学过程主要包括细胞生长、分化、黏附、运动迁移、信号转导及转录调控等。KEGG_Pathway分析显示,差异甲基化基因主要参与黏着斑、癌症通路、转化生长因子β信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、黑素生成、趋化因子信号通路、黏合连接、钙信号通路、细胞黏附分子、MAPK信号通路、Wnt信号通路、JAK-STAT信号通路。基于"启动子区高甲基化位点对应的前16个基因、出现甲基化频率最高(CpG位点≥ 7)的基因、具有一定的功能或参与某条信号通路"条件,选出8个基因( KAAG1、 DGKE、 SOCS2、 TFAP2A、 GNMT、 GALNT3、 ANK2、 HOXA9)作为黑素瘤候选生物标志物。 结论:黑素瘤组织存在较多高甲基化基因,8个差异甲基化基因有可能作为黑素瘤的生物标志物。
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编辑人员丨5天前
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一个 POU3F4基因完全缺失变异所致X连锁耳聋2型家系的基因诊断和产前诊断
编辑人员丨5天前
目的:探讨1个双耳极重度感音神经性聋患儿的致病基因变异类型,明确可能的遗传学病因,并对该家系进行产前诊断。方法:应用高通量测序方法对先证者进行415个遗传性耳聋相关基因的序列检测,使用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)方法对测序结果进行验证并对先证者父母和胎儿进行检测。结果:先证者DNA中检测到与X染色体连锁耳聋2型(deafness X-linked 2,DFNX2)相关的 POU3F4基因完全缺失变异,按照美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南进行致病性评级,该变异为致病性变异(PVS1+PM2+PP4),先证者母亲和胎儿均为 POU3F4基因杂合缺失变异携带者,先证者父亲 POU3F4基因拷贝数正常。 结论:POU3F4基因缺失变异是一个基因功能丢失变异,可能为该家系耳聋发生的遗传学病因,可用于指导家系进行产前诊断,胎儿产后听力正常,与产前诊断结果一致。
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编辑人员丨5天前
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Schubert-Bornschein型不完全型先天性静止性夜盲一家系 CACNA1F基因突变分析
编辑人员丨5天前
目的:确定1个Schubert-Bornschein型不完全型先天性静止性夜盲(CSNB)家系的致病基因突变。方法:回顾性临床研究。2021年2月于河南省人民医院经临床、基因检查确诊的一个汉族Schubert-Bornschein型不完全型CSNB家系中1例患者及其父母、兄长纳入研究。详细询问患者病史、家族史并行最佳矫正视力(BCVA)、色觉、眼底彩色照相、全视野视网膜电图(ERG )、频域光相干断层扫描(OCT)检查。采集受试者外周静脉血5 ml,提取全基因组DNA。受检者基因组DNA进行文库构建、聚合全外显子探针进行捕获。对可疑致病突变位点通过Sanger进行验证,并行生物信息学分析确定基因突变位点的致病性。结果:先证者(Ⅱ2)双眼BCVA均为0.4;色觉检查不能辨认红色。眼底检查未见明显异常。双眼黄斑区视网膜厚度轻度变薄。全视野ERG检查,双眼暗适应3.0刺激下ERG b波振幅明显降低,呈负波形。先证者母亲(Ⅰ2)双眼BCVA、色觉、眼底彩色照相、频域OCT检查均正常。全视野ERG检查,双眼各反应振幅轻度降低,暗适应震荡电位振幅明显降低。基因检测结果显示,先证者(Ⅱ2)电压依赖钙离子通道α1F亚基基因( CACNA1F基因)第14号外显子存在c.1761dupC半合子突变。蛋白序列同源性分析结果显示,该位点在多个物种中均高度保守;生物信息学分析结果显示, CACNA1F基因c.1761dupC (pY588fs)其后发生移码突变,在第10位变成终止密码子在蛋白质保守区出现翻译终止。根据美国医学遗传学和基因组学学会标准和指南,该突变判断为可能致病性变异。先证者母亲(Ⅰ2)为该位点突变携带者。先证者父亲、兄长临床及基因检测结果均未见异常。 结论:CACNA1F基因c.1761dupC是该Schubert-Bornschein型不完全型CSNB家系致病的突变位点。
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编辑人员丨5天前
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2010—2021年度国家自然科学基金检验医学领域项目申请与资助情况分析
编辑人员丨5天前
目的:分析国家自然科学基金委员会(简称自然科学基金委)2010—2021年检验医学领域项目整体申请与资助情况。方法:采集2010—2021年自然科学基金委检验医学领域申请与资助数据,重点针对学科内资助项目经费、地域、依托单位分布情况、关键词以及代表性论文进行分类统计,并分析和总结10余年来整体的项目特点。结果:2010—2021年自然科学基金委检验医学领域共收到项目申请7 746项、累计资助1 152项、资助金额共计50 631.7万元。项目申请数由2010年的228项增加至2021年1 184项,项目资助数由2010的36项增加至2021年的137项,项目资助金额也相应地由2010年的1 012.0万元增长至2021年的6 538.0万元,均逐年上升。在检验医学领域(H26)中,分支学科H2605(分子生物学检验)与H2606(检验医学研究新技术与新方法)是受资助数量最多的2个方向,占59.7%(688/1 152)。地域获资助情况中,北京、广东、上海、重庆、浙江和江苏为获资助数较多的前6个地区,占60.2%(695/1 152)。30家依托单位获得检验医学领域826项资助,占总数71.7%(826/1 152)。在检验领域1 152资助项目中,肿瘤(37.1%,427项)、感染类疾病(26.9%,310项)、循环系统疾病(5.3%,61项)、自身免疫疾病(4.3%,49项)、内分泌与代谢性疾病(2.8%,32项)是出现频率较高的疾病类型;蛋白(33.4%,385项)、DNA(19.4%,224项)、RNA(17.3%,199项)、外泌体(6.0%,69项)和细胞(5.9%,68项)是研究较多的标志物;纳米技术(6.0%,69项)、质谱技术(3.0%,34项)、探针技术(1.82%,21项)、电化学技术(1.6%,19项)和二代测序技术(1.6%,18项)是研究较多的检验技术。检验领域10年来在建立参考值范围、鉴定新型疾病标志物、开发检验新技术等方面取得多项突破,形成多个具有特色方向的研究团队。结论:自然科学基金委2010—2021年检验医学资助项目数及金额均显著上升,不同二级代码、地域和依托单位资助情况差异明显,研究范围广泛,多个团队在新型标志物挖掘与检验新技术等方面已取得标志性成果,整体水平有望进一步提升。
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编辑人员丨5天前
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沉默信息调节因子1基因启动子区域单核苷酸多态性与老年退行性心脏瓣膜病的相关性分析
编辑人员丨5天前
目的:探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)基因启动子序列单核苷酸多态性(SNPs)与老年退行性心脏瓣膜病(SDHVD)的相关性。方法:对236例SDHVD组成员(2012年2月至2016年10月济宁医学院附属医院确诊为SDHVD的患者)与285名健康对照组成员(同期于济宁医学院附属医院体检中心体检的健康体检者)的SIRT1基因启动子序列进行统计分析。Sanger测序法检测SIRT1基因启动子序列SNPs;χ 2、Logistic回归对SNPs进行基因型、等位基因分析和相关性分析,Haploview 4.2软件对SNPs进行连锁不平衡分析,SHEsis程序进行单倍型分析,凝胶迁移率变异实验(EMSA)分析SNPs对转录因子与SIRT1基因启动子相结合的影响,Transfac程序预测受多态性影响的与SIRT1基因启动子相结合的转录因子。 结果:rs3740051位点GG基因型与SDHVD的发生具有相关性,校正年龄后,其致SDHVD效应是AA基因型的3.079倍( OR=3.079,95 %CI:1.156~8.201, P=0.024)。SIRT1基因启动子中,5个SNPs位点间呈强连锁不平衡(均D′>0.8),共形成11种 P<0.05的单倍型,其中*A**C、AA**C、*AG*C、AAG*C、AA*AC、*AGAC和AAGAC在SDHVD组中具有更高的频率(均 P<0.05, OR>1,95 %CI不包含1)。EMSA示正常序列探针与核蛋白所孵育出的结合条带较突变序列探针与核蛋白所孵育出的结合条带颜色深。 结论:rs3740051位点GG基因型与SDHVD具有相关性且可能是SDHVD发生的危险性基因型。单倍型AC(跨rs932658和rs2394443)可能是SDHVD发生的危险性单倍型。rs3740051可能通过干扰FOXC蛋白与SIRT1基因启动子的结合影响SDHVD的发生发展。
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编辑人员丨5天前
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基于石墨烯场效应晶体管的病毒核酸检测技术
编辑人员丨5天前
目的:本研究旨在开发一种高灵敏且简便的检测方法,实现对病毒核酸的快速检测。方法:建立了一种基于石墨烯场效应晶体管的新型核酸检测方法。通过在石墨烯传感界面锚定化学小分子,然后修饰上DNA四面体探针,实现了对病毒核酸的检测。通过测试传感器件的转移特性曲线,可将探针与目标物杂交结合的生物信号转化为器件的电学信号,并通过晶体管器件的信号放大作用,实现了对目标分子的高灵敏检测。结果:靶向新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)RNA的 ORF1 ab序列的DNA四面体探针与目标RNA通过碱基互补配对原则进行杂交结合。测试了唾液中不同浓度条件的2019-nCoV的核酸模拟样本,观察到随着目标核酸的浓度增加,晶体管传感器件的狄拉克点产生规律性的向左偏移。在100 μl的待测液,传感器件的最低检测浓度可达0.05拷贝/μl,且响应时间低至5 min。 结论:本研究开发了一种基于石墨烯场效应晶体管检测方法,极大地提高了对病毒核酸的检测灵敏度并缩短了检测时间。
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编辑人员丨5天前
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临床结核病病原体分子生物学诊断年度进展2022
编辑人员丨5天前
结核病仍然是威胁人类健康的全球公共卫生问题,快速准确的病原体检测是实现早期诊断和有效治疗的关键。近年来,结核病的病原学诊断由传统的细菌学诊断向分子诊断扩展。近1年,具有良好诊断性能的Xper MTB/RIF Ultra技术更多被应用于非呼吸道样本的检测,Xpert XDR和二代线性探针技术为MDR-TB的早期快速准确诊断提供了更多依据;基因组测序技术也被更多开发应用于非培养物样本的检测,其检测成本和所需时间已相对降低和减少;更适合初级医疗保健中心开展的Truenat技术被更广泛应用;游离DNA检测及质谱检测等新型结核病检测技术同样不断发展,有望成为结核病及耐药结核病早期快速诊断的重要手段。本文综合2021年10月1日至2022年9月30日国内外结核病病原体分子生物学诊断的重要进展成果,评估分子生物学检测技术的优缺点及应用现状,为临床选择和应用提供重要依据。
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编辑人员丨5天前
