目的:采用不同的流感病毒骨架构建表达分泌荧光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)的重组流感病毒，同时研究其生长特性、遗传稳定性、Gluc表达水平、体外抗流感药物活性。方法:在PR8NA的C端插入猪捷申病毒2A肽(porcine teschovirus-2A autocleavage peptide, P2A)自剪切位点及Gluc编码基因，其余7个质粒分别来源于A/Puerto Rico/8/34(PR8) (H1N1)和A/WSN/1933(WSN) (H1N1)，通过流感病毒反向遗传学8质粒系统拯救重组病毒，分别命名为PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN。检测重组病毒遗传稳定性；对比PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN的荧光强度；检测重组病毒的生长动力学；同时测定PR8NAGluc/WSN荧光强度与半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose，TCID 50)的相关性及对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟的体外抗流感药物活性。 结果:通过反向遗传学成功拯救出以PR8和WSN为骨架表达Gluc的重组病毒。相对于PR8骨架，以WSN为骨架明显提高了Gluc的表达且遗传稳定，复制动力学比野生型稍低。PR8NAGluc/WSN荧光强度与TCID 50有较好的相关性，其对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟具有良好的敏感性。 结论:以WSN为骨架的重组病毒荧光表达强度比PR8骨架高，为高通量筛选抗流感病毒药物及研发流感病毒载体疫苗提供参考。

目的:研究洛沙坦是否可以通过改善淋巴引流抑制卵巢癌裸鼠模型腹水的形成。方法:8周龄雌性裸鼠，随机分3组，每组24只鼠。空白对照组不给予任何处理。另两组给予原位移植SKOV3 IP1-Gluc卵巢癌细胞，根据外周血Gluc水平监测腹腔内肿瘤生长情况，达到1×10 6相对光单位时入组。对照组为卵巢癌无治疗组，22只鼠入组，卵巢癌洛沙坦治疗组23只鼠入组。注射肿瘤后第28天处死，取出腹腔内肿瘤及膈肌，抽吸腹水测量。免疫组化方法检测sirius red、αSMA、Collagen 1，了解细胞外基质胶原蛋白及纤维母细胞含量。用淋巴管造影方法观察膈肌淋巴管形态，腹腔内注射荧光微球观察膈肌及纵膈淋巴结荧光微球分布情况，了解膈肌淋巴管引流功能。 结果:洛沙坦治疗可以明显减少卵巢癌裸鼠模型腹水形成( P<0.05)。洛沙坦治疗组肿瘤内胶原蛋白含量(sirius red阳性区域，Collagen 1含量)及纤维母细胞(αSMA阳性区域)均明显减少(均 P<0.05)。与正常裸鼠比较，卵巢癌无治疗组裸鼠膈肌淋巴管扩张，结构紊乱；洛沙坦治疗组裸鼠膈肌淋巴管形态和分布情况改善，趋于正常化，而淋巴管引流功能也得到明显改善。 结论:洛沙坦可以抑制细胞外基质形成，减少卵巢癌细胞外基质含量，降低固态压力，解除对淋巴管的压迫作用，改善淋巴引流，减少腹水形成，使临床获益。

目的 探究两歧双歧杆菌BD-1(Bifidobacterium bifidum BD-1,BD-1)以2-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyl-lactose,2'-FL)作为唯一碳源时,与葡萄糖相比,其菌体和代谢产物诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌细胞因子的效应,以探索BD-1菌利用母乳低聚糖后免疫调节的菌株特性.方法 (1)菌体部分干预实验:将BD-1活菌接种于不同碳源的改良MRS肉汤培养基中,改良过的MRS肉汤培养基包括以2％2'-FL作为唯一碳源(2'-FL组)和以2％葡萄糖作为唯一碳源(Glu组)的培养基.将接种后的BD-1活菌在厌氧条件下培养24h后,分离各组菌体和培养基上清液.将菌体部分与RAW264.7细胞共同培养,并以肽聚糖(pep-tidoglycan,PGN)为菌体成分对照,同时设置不添加干预物的阴性对照(Ctrl组).(2)菌体代谢产物部分干预实验:将培养基上清液与RAW264.7细胞共同培养,以含有2％2'-FL或葡萄糖但未进行BD-1菌发酵处理的培养基作为实验对照,并设置不添加干预物的培养基与RAW264.7细胞的共培养上清液作为阴性对照(Ctrl组),以PGN与RAW264.7细胞的共培养上清液作为阳性对照(PGN组).培养24h后,提取RAW264.7细胞总RNA,逆转录后采用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10、IL-12、IL-1β的基因表达量;收集各组受试物与RAW264.7细胞的共培养上清液,采用酶联免疫吸附试验检测共培养上清液中上述细胞因子的分泌量.结果 (1)菌体部分干预:与PGN组相比,菌体部分2'-FL组和Glu组的TNF-α、IL-6、IL-10分泌量及基因表达量显著上升(均P＜0.05).与Glu组相比,2'-FL组的IL-6、IL-10分泌量显著下降(均P＜0.05),IL-6、IL-10的基因表达具有下降趋势.(2)菌体代谢产物部分干预:BD-1-2'-FL上清组和BD-1-Glu上清组的TNF-α、IL-6及IL-10分泌水平以及基因表达水平较2'-FL组和Glu组(未进行BD-1菌发酵处理的组别)有显著提高(均P＜0.05),而且2'-FL组中IL-6、IL-10的分泌量较Glu组显著增加(均P＜0.05),IL-6表达水平显著升高(均P＜0.05),IL-10表达水平有升高的趋势.2'-FL组相较于Glu组能产生更多的有机酸和种类更为丰富的糖类物质.结论 利用母乳低聚糖或葡萄糖作为唯一碳源培养BD-1菌体和诱导巨噬细胞分泌细胞因子的特征存在差异.当BD-1以母乳低聚糖为唯一碳源时,与葡萄糖相比,菌体成分呈现出抗炎倾向,在巨噬细胞中表现为IL-6的分泌和基因表达能力下降;而其代谢产物则具有刺激免疫激活的趋势,在巨噬细胞中导致IL-6和IL-10的分泌及基因表达能力上升.

葛根芩连汤由葛根、黄芩、黄连和甘草四味药物组成,具有解表清里的功效,是治疗肠道湿热型下痢的经典名方,目前临床上根据"异病同治"的原则用于治疗2型糖尿病和肥胖等与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)相关的代谢性疾病,但作用机制尚不明确.现代研究证明,葛根芩连汤能够增加肠道内短链脂肪酸产生菌等益生菌,减少致病菌,调节肠道菌群的结构、丰度和代谢产物,修复受损的肠黏膜,保护肠道屏障功能,从而减少脂多糖进入血液循环,抑制其引发的炎症级联反应,起到提高胰岛素敏感性,改善IR,调节糖脂代谢的作用.本文就肠道菌群与IR的关系、葛根芩连汤通过调节肠道菌群治疗IR的基础和临床研究进行综述.

目的:建立以分泌型荧光素酶Gaussia Luciferase(Gluc)为报告基因的Nrf2信号通路的报告系统.方法:以mini-ML和mini-CV为基础转录序列,通过分子克隆方法在其上游分别串联1个、2个、4个和8个抗氧化反应元件(Anti-oxidant response element,ARE),检测不同转录元件下Gluc的活性;同时以CMV启动子驱动的碱性磷酸酶(Alkinane Phosphtase,AP)为内参基因,构建报告质粒.将上述质粒转染到HaCaT细胞,在莱菔硫烷(SF)和特丁基对苯二酚(BHQ)作用的情况下,测定Gluc和AP的活性.结果:转录序列串联的ARE元件越多,Gluc活性越高;以mini-ML为基础转录序列的质粒较mini-CV为基础转录序列的质粒对抗氧化活性的干扰小;以mini-ML为基础转录序列串联8个ARE元件的HaCaT细胞中在SF和BHQ处理6 h、UV辐射后4 h时,Gluc活性最大.结论:本研究成功构建了以Gluc为报告基因的Nrf2报告系统,该系统为UV疾病细胞模型的建立奠定了基础.

该文研究了全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)促进骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导肝祖细胞14-19(hepatic progenitor cell 14-19,HP14-19)成熟分化的作用.重组腺病毒Ad-BMP9和ATRA单独及联合作用诱导肝祖细胞HP14-19成熟分化,荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc表达情况,Real-time PCR检测肝脏相关基因DLK、AFP、ALB和TAT的mRNA水平,Western blot及免疫荧光检测AFP、ALB、CK18和UGTlA蛋白质水平,PAS染色和ICG摄取实验检测成熟分化后的功能.Ad-BMP9组和ATRA组的ALB-Gluc活性较对照组增高,而Ad-BMP9+ATRA组ALB-Gluc活性又显著高于Ad-BMP9组和ATRA组.Ad-BMP9+ATRA组的ALB和TAT mRNA水平以及ALB、CK18和UGTlA蛋白质水平均高于Ad-BMP9组和ATRA组,但肝干细胞标志DLK、AFP的表达均降低(P＜0.05). Ad-BMP9+ATRA组的ICG摄取及PAS染色阳性细胞数显著高于Ad-BMP9组和ATRA组.ATRA和Ad-BMP9均诱导肝祖细胞HP14-19成熟分化,联合作用强于单独作用.

目的:研究胃癌术后四君子汤联合营养支持对应激炎症反应、免疫应答反应的影响.方法:选择本院进行的胃癌根治术病例,随机分为术后接受四君子汤联合肠内营养支持的观察组、接受常规肠内营养支持的对照组.手术前及手术后3天,测定血清中应激炎症反应指标及外周血中免疫应答指标.结果:手术后3天,两组血清中Cor、Gluc、Ins、O2-、CRP、TNF-α、YKL-40、MK、IL-6的含量以及外周血中GATA-3、RORγt、Foxp3表达量表达量高于手术前,血清中HO-1、SOD的含量以及外周血中CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD16+CD56+N K细胞、CD19+B细胞含量、T-bet表达量均低于手术前且观察组患者血清中Cor、Gluc、Ins、O2-、CRP、TNF-α、YKL-40、MK、IL-6的含量以及外周血中GATA-3、RORγt、Foxp3表达量表达量均低于对照组,血清中HO-1、SOD的含量以及外周血中CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD16+CD56+N K 细胞、CD19+B细胞含量、T-bet表达量均高于对照组.结论:胃癌术后四君子汤联合营养支持能够减轻应激炎症反应、增强免疫应答.

该研究探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)体外诱导小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞成熟分化及ATRA对细胞自噬水平的调控作用.应用1 μmol/L ATRA处理小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞,不同时间点进行荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性,Real-time PCR检测肝细胞相关标志基因的表达,吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)及过碘酸–希夫(periodicacid-schiff,PAS)染色检测细胞的成熟功能;透射电镜观察自噬体及细胞连接,ptfLC3质粒转染细胞,激光共聚焦显微镜观察自噬流,Western blot检测自噬相关标志蛋白质水平等综合分析自噬的变化情况.结果显示,与对照组相比,ATRA可显著增强HP14-19细胞ALB-Gluc活性,抑制肝前体细胞标志DLK和AFP的表达,促进成熟肝细胞标志ALB、CK18、TAT和ApoB的表达,ICG及PAS染色阳性细胞数显著增多(P<0.05);透射电镜结果可见ATRA诱导组出现大量自噬体和自噬溶酶体,同时细胞间紧密连接增多,并且自噬相关标志蛋白质Beclin1、LC3-II、RAB7水平增高,P62水平无显著变化,LC3-II/LC3-I的比值明显增加(P<0.05);激光共聚焦显微镜可见ATRA组细胞质内黄色斑点的自噬体及红色斑点的自噬溶酶体均较对照组明显增多,自噬抑制剂3-MA和Baflomycin可抑制ATRA诱导的HP14-19细胞的ICG摄取和糖原合成功能.综上所述,ATRA可能通过调节细胞自噬水平有效诱导小鼠胚胎肝祖细胞的分化成熟.

该研究探讨了胆汁淤积性肝硬化病理微环境来源的细胞因子在胆总管结扎小鼠不同时间点的表达变化,且在体外致力寻找最优的细胞因子组合高效诱导肝脏干细胞HP14-19分化为成熟肝细胞.以Balb/c小鼠胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)模拟胆汁淤积性肝硬化病理微环境;免疫组织化学检测胆总管结扎小鼠肝组织中细胞因子EGF、HGF及TGF-α的表达;以小鼠胚胎肝干细胞HP14-19细胞为研究对象,以不同浓度在不同时间点进行荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性;qRT-PCR、Western blot检测肝细胞相关标志物表达;吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)及过碘酸-希夫(periodicacid-schiff,PAS)染色检测肝细胞的成熟功能.结果显示,小鼠胆总管结扎能成功模拟胆汁淤积性肝硬化,并随结扎时间延长肝硬化程度加重;与对照相比,在EGF(10 ng/mL)、 HGF(20 ng/mL)、TGF-α(20 ng/mL)单独诱导HP14-19细胞能有效增强ALB-Gluc活性(尸<0.05);且在EGF(10 ng/mL)、HGF(20 ng/mL)、TGF-α(20 ng/mL)联合诱导HP14-19细胞时显著增强ALB-Gluc活性(P<0.05);qRT-PCR、Western-blot显示,ALB、CK18表达随时间增加而增加,而AFP表达则相反.ICG摄取及PAS染色阳性细胞数显著增加(P<0.05).因此,胆汁淤积性肝硬化病理微环境来源的细胞因子能有效促进肝脏干细胞肝向分化,将对细胞因子联合肝脏干细胞移植治疗胆汁淤积性肝硬化有一定的指导意义.

为了探讨不同血清浓度诱导培养条件下对体外诱导胚胎肝祖细胞成熟分化的影响.本研究选用含有10％ FBS、5％ FBS、2％ FBS的DMEM/HGF/FGF4肝细胞培养基体外诱导胚胎肝祖细胞的成熟分化,分别于诱导后0d、3d、6d、9d、12 d ALB-GLuc检测细胞白蛋白的合成水平,细胞计数检测细胞的成长曲线.RT-PCR检测肝细胞相关标志DLK、AFP、CK18,免疫荧光检测ALB、UGT1A的表达情况.ICG摄取和尿素氮检测肝细胞成熟功能.诱导后第三天,ALB-GLuc开始增高,于第9天达高峰,2％ FBS组ALB-GLuc读数最高.生长曲线显示低血清浓度下细胞的增殖速度明显慢于高血清浓度.RT-PCR和免疫荧光结果显示诱导后第9天,3个诱导组DLK、AFP表达低于无诱导组,CK18、ALB、UGT1A均高于无诱导组,2％ FBS组差异最显著.3个诱导组的肝细胞ICG摄取能力明显增高,2％FBS组ICG阳性细胞数为(60.2±9.0)％,明显高于5％ FBS (45.0±3.6)％及10％ FBS组(35.2±2.9)％,诱导后肝细胞的尿素合成功能增强,尤其是2％ FBS组.低浓度血清培养条件能更好的诱导胚胎肝祖细胞的体外成熟分化.