目的:探讨长链非编码RNA PRMT5-AS1对电离辐射诱导的肝癌细胞铁死亡的影响。方法:在MHCC-97H细胞中构建PRMT5-AS1过表达模型，在HepG2细胞中构建PRMT5-AS1敲低模型。使用X射线照射，吸收剂量为10 Gy，剂量率为3 Gy/min。采用Western blot和qRT-PCR实验检测基因表达水平。采用台盼蓝染色流式细胞术检测PRMT5-AS1表达对受照肝癌细胞脂质过氧化以及铁死亡的影响。采用CCK-8实验检测PRMT5-AS1表达水平对电离辐射照射后肝癌细胞死亡的影响。双荧光素酶报告实验检测let-7c-5p与PRMT5-AS1和SLC7A11之间结合作用。结果:MHCC-97H细胞中过表达PRMT5-AS1能够显著降低电离辐射引起的细胞死亡(对照组 vs. PRMT5-AS1过表达组：27.57% vs.18.30%， t＝14.94， P<0.05)。HepG2细胞中敲低PRMT5-AS1可显著增加电离辐射引起的细胞死亡(对照组 vs. PRMT5-AS1敲低组：17.26% vs.28.26%， t＝13.63， P<0.05)。过表达PRMT5-AS1能够明显抑制由电离辐射诱导的细胞内脂质活性氧(ROS)水平增加(对照组 vs. PRMT5-AS1过表达组：17.01% vs.12.52%， t＝12.80， P<0.05)，敲低PRMT5-AS1可显著增加电离辐射诱导的脂质ROS水平增加(对照组 vs. PRMT5-AS1敲低组：14.54% vs.17.72%， t＝5.93， P<0.05)。CCK-8实验结果表明，过表达PRMT5-AS1能够显著抑制Erastin诱导的细胞活性降低(对照组 vs. PRMT5-AS1过表达组：87.92% vs.109.06%， t＝2.87， P<0.05)，敲低PRMT5-AS1则促进Erastin抑制细胞活性(对照组 vs. PRMT5-AS1敲低组：82.56% vs.60.58%， t＝38.35， P<0.05)。Western blot和荧光定量PCR结果表明，过表达PRMT5-AS1能够明显提高SLC7A11的蛋白和mRNA水平( t＝26.24， P<0.05)，敲低PRMT5-AS1后SLC7A11的蛋白和mRNA水平均显著降低( t＝5.60， P<0.05)。荧光素酶报告基因实验表明PRMT5-AS1与let-7c-5p之间存在相互作用( t＝9.74， P<0.05)。PRMT5-AS1可以与let-7c-5p形成ceRNA网络，靶向调节SLC7A11。let-7c-5p能够逆转由过表达PRMT5-AS1引起的SLC7A11表达水平增加、脂质ROS水平和细胞死亡减少( t＝3.01、4.11， P<0.05)，而敲低SLC7A11能够逆转PRMT5-AS1引起的脂质ROS抑制和细胞死亡减少( t＝21.35、7.15， P<0.05)。 结论:长链非编码RNA PRMT5-AS1通过PRMT5-AS1/let-7c-5p/SLC7A11轴抑制电离辐射诱导肝癌细胞铁死亡的发生。

Background::Radiation (IR)-induced DNA damage triggers cell cycle arrest and has a suppressive effect on the tumor microenvironment (TME). Wee1, a cell cycle regulator, can eliminate G2/M arrest by phosphorylating cyclin-dependent kinase 1 (CDK1). Meanwhile, programed death-1/programed death ligand-1 (PD-1/PDL-1) blockade is closely related to TME. This study aims to investigate the effects and mechanisms of Wee1 inhibitor AZD1775 and anti-PD-1 antibody (anti-PD-1 Ab) on radiosensitization of hepatoma.Methods::The anti-tumor activity of AZD1775 and IR was determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay on human and mouse hepatoma cells HepG2, Hepa1-6, and H22. The anti-hepatoma mechanism of AZD1775 and IR revealed by flow cytometry and Western blot in vitro. A hepatoma subcutaneous xenograft mice model was constructed on Balb/c mice, which were divided into control group, IR group, AZD1775 group, IR + AZD1775 group, IR + anti-PD-1 Ab group, and the IR + AZD1775 + anti-PD-1 Ab group. Cytotoxic CD8 + T cells in TME were analyzed by flow cytometry. Results::Combining IR with AZD1775 synergistically reduced the viability of hepatoma cells in vitro. AZD1775 exhibited antitumor effects by decreasing CDK1 phosphorylation to reverse the IR-induced G2/M arrest and increasing IR-induced DNA damage. AZD1775 treatment also reduced the proportion of PD-1 +/CD8 + T cells in the spleen of hepatoma subcutaneous xenograft mice. Further studies revealed that AZD1775 and anti-PD-1 Ab could enhance the radiosensitivity of hepatoma by enhancing the levels of interferon γ (IFNγ) + or Ki67 + CD8 T cells and decreasing the levels of CD8 + Tregs cells in the tumor and spleen of the hepatoma mice model, indicating that the improvement of TME was manifested by increasing the cytotoxic factor IFNγ expression, enhancing CD8 + T cells proliferation, and weakening CD8 + T cells depletion. Conclusions::This work suggests that AZD1775 and anti-PD-1 Ab synergistically sensitize hepatoma to radiotherapy by enhancing IR-induced DNA damage and improving cytotoxic CD8 + T cells in TME.

目的:探究格列齐特(Gliclazide，GL)对糖尿病大鼠胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)及胰脏含NOD样受体家族Pyrin域蛋白3(Nod-like receptor family pyrin domain containing protein 3，NLRP3)炎症小体的影响。方法:60只大鼠随机分为对照(Control)组、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)组、GL低剂量(GL low dose，GL-L)组和GL高剂量(GL high dose，GL-H)组，每组15只。采用高糖高脂喂养联合腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导T2DM大鼠模型。便携式血糖监测仪检测大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，腹腔葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance tests，IPGTT)检测血清胰岛素水平，评估胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)；HE染色观察胰脏组织病理损伤；酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清炎性因子白细胞介素(interleukin，IL)-18、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平；免疫组化检测胰脏组织NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteinase-1，Caspase-1)水平；Western blot检测胰脏组织炎性因子NLRP3、ASC、Caspase-1水平。结果:与Control组相比，T2DM组、GL-L组、GL-H组体重、FBG、IPGTT-AUC、胰岛素水平、HOMA-IR水平明显升高，差异有统计学意义( F＝34.48、53.42、47.90、32.89、34.15， P值均<0.05)。HE染色结果显示，GL-L组、GL-H组大鼠较T2DM组炎症程度明显减轻，胰岛细胞形态较规则、胞浆充盈。ELISA结果显示，与Control组相比，T2DM组、GL-L组、GL-H组大鼠血清和胰腺组织炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18水平明显升高，差异有统计学意义( F＝27.02、42.12、35.22、44.02、52.82、42.70， P值均<0.05)；与T2DM组相比，GL-L组、GL-H组大鼠血清和胰腺组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-18水平明显降低，差异有统计学意义[血清：pg/mL：(185.34±19.31)比(141.22±11.24)或(111.36±10.56)，(268.41±16.34)比(175.67±7.16)或(125.67±7.33)，(280.66±18.15)比(197.61±8.55)或(127.43±8.57)；胰腺：(1.10±0.08)比(0.81±0.06)或(0.41±0.04)，(1.12±0.07)比(0.65±0.07)或(0.23±0.03)，(1.11±0.09)比(0.60±0.05)或(0.32±0.03)， P值均<0.05]。免疫组化和Western blot结果显示，与Control组相比，T2DM组、GL-L组、GL-H组大鼠胰腺组织NLRP3、ASC、Caspase-1水平明显升高，差异有统计学意义( F＝37.58、45.37、34.75、44.51、48.54、38.48， P值均<0.05)。选择1 μmol/L胰岛素、48 h作为IR-HepG2细胞模型最佳浓度和作用时间。与Control组相比，IR组、GL-L组、GL-H组细胞葡萄糖消耗量和糖原含量明显降低，差异有统计学意义( F＝17.84、15.58， P值均<0.05)。Western blot结果显示，与Control组相比，IR组、GL-L组、GL-H组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1水平明显升高，差异有统计学意义( F＝47.74、41.21、46.74， P值均<0.05)；与IR组相比，GL-L组、GL-H组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1水平明显降低，差异有统计学意义[(0.85±0.05)比(0.68±0.04)或(0.20±0.04)，(0.60±0.05)比(0.40±0.04)或(0.20±0.03)，(0.93±0.06)比(0.72±0.05)或(0.25±0.03)， P值均<0.05]。 结论:GL能够改善T2DM大鼠IR，抑制胰腺NLRP3炎症小体表达。

目的:探究miR-216a-5p靶向Krüppel样转录因子12（KLF12）对肝癌细胞放射敏感性的影响。方法:实时反转录PCR（RT-qPCR）检测人正常肝细胞L-02，人肝癌细胞Huh7、HepG2、Hep3B、MHCC-97H中miR-216a-5p、KLF12 mRNA水平并比较。采用0、2、4、6、8 Gy X射线照射HepG2细胞2 h，比较不同剂量照射组间的miR-216a-5p、KLF12 mRNA水平。采用质粒转染构建miR-216a-5p和/或KLF12过表达的HepG2细胞，并给予4 Gy X射线照射2 h。相应的分组为miR-NC（对照）组、miR-216a-5p组、miR-216a-5p+NC组、miR-216a-5p+KLF12组、IR+miR-NC组、IR+miR-216a-5p组、IR+miR-216a-5p+NC组、IR+miR-216a-5p+KLF12组，比较分组间的miR-216a-5p、KLF12 mRNA水平。克隆形成实验检测细胞放射敏感性；CCK-8法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD- t检验。 结果:与L-02细胞相比，肝癌细胞系中KLF12 mRNA水平升高，miR-216a-5p水平降低（ P<0.05）。与0 Gy组相比，2、4、6、8 Gy组KLF12 mRNA水平降低，miR-216a-5p水平升高（ P<0.05）。过表达miR-216a-5p或放射处理能够增强细胞放射敏感性和凋亡水平，并降低细胞增殖水平（ P<0.05）；且过表达miR-216a-5p同时放射处理对细胞上述效果更加明显（ P<0.05）。过表达KLF12能部分逆转过表达miR-216a-5p对细胞的上述效果（ P<0.05）。 结论:miR-216a-5p通过调控KLF12降低细胞增殖能力，增强细胞放射敏感性和细胞凋亡。

目的:探究miR-93-5p对HepG2细胞增殖、自噬、葡萄糖消耗以及磷脂酰肌醇3-激酶(phos-phatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路的影响.方法:高浓度葡萄糖诱导构建胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)细胞模型,设计合成miR-93-5p inhibitor和NC,结合自噬抑制剂 3-MA,将细胞分为 Control 组、IR 组、IR+inhibitor NC 组、IR+inhibitor 组、IR+3-MA+inhibitor 组.CCK8法检测各组细胞增殖活力,试剂盒检测各组细胞葡萄糖消耗量和细胞糖原合成情况,Western-Blot法检测细胞自噬基因微管相关蛋白 1 轻链 3(autophagy genes microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)蛋白、PI3K/AKT 通路蛋白(AKT、p-AKT)的表达.结果:与对照组相比,IR组细胞增殖活力、葡萄糖消耗量和细胞糖原合成量、HGF蛋白、LC3-Ⅱ蛋白表达下降(P＜0.01),LC3-Ⅰ蛋白和p-AKT/AKT值表达均增加(P＜0.01).与IR组和IR+in-hibitor NC组相比,IR+inhibitor组细胞增殖活力、葡萄糖消耗量和细胞糖原合成量、HGF蛋白、LC3-Ⅱ蛋白表达增加(P＜0.01),LC3-Ⅰ蛋白和p-AKT/AKT值表达均下降(P＜0.01).与IR+inhibitor组相比,3-MA能逆转miR-93-5p inhibitor的作用.结论:miR-93-5p通过PI3K/AKT通路促进HepG2细胞自噬,进而抑制胰岛素抵抗,缓解糖尿病造成的机体损伤.

目的 探究糖尿病小鼠来源的骨髓间充质干细胞及其旁分泌作用在诱发胰岛素抵抗(IR)中扮演的角色.方法 建立小鼠糖尿病模型,提取并培养骨髓间充质干细胞(BMSC),收集培养上清液(M-BMSC-CS).①细胞实验:将HepG2肝细胞分为正常低糖培养组[用低糖DMEM(5.55 mmol·L-1)进行培养]、M-BMSC-CS实验组(M-BMSC-CS 75 μL)、高糖高脂对照组(给予25 mmol·L-1高糖DMEM+0.25 mmol·L-1棕榈酸).②动物实验:小鼠分为正常小鼠组(腹腔注射等体积0.9％NaCl)和M-BMSC-CS-m组(M-BMSC-CS通过腹腔注射给予正常小鼠,注射剂量0.2 mI/10 g).用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖摄取量,用免疫荧光法检测Glut2蛋白荧光强度,用蛋白质印迹法检测胰岛素信号通路蛋白表达;检测口服葡萄糖耐量(OGTT)和胰岛素耐量(ITT).结果 正常低糖培养组、M-BMSC-CS实验组和高糖高脂对照组的葡萄糖摄取量分别为(2.96±0.05)、(1.64±0.28)和(1.42±0.32)mmol·L-1,葡萄糖转运蛋白 2(Glut2)荧光表达分别为53.21±2.70、30.95±3.39 和 34.96±7.60,磷酸化胰岛素受体底物1-ser307(p-IRS-1ser307)表达蛋白相对水平分别为0.46±0.21、1.09±0.24和0.91±0.16,磷酸化蛋白激酶(p-AKT)蛋白相对表达水平分别为0.94±0.05、0.59±0.06和0.53±0.05,Glut2蛋白表达水平分别为 1.08±0.14、0.58±0.14 和 0.62±0.09;M-BMSC-CS 实验组的上述指标与正常低糖培养组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).正常小鼠组和 M-BMSC-CS-m 组空腹血糖分别为(5.23±0.57)和(9.30±1.14)mmol·L-1,p-AKT蛋白相对表达水平分别为1.27±0.21和0.51±0.19,Glut2蛋白相对表达水平分别为1.17±0.17和0.79±0.09;M-BMSC-CS-m组的上述各指标与正常小鼠组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 糖尿病小鼠来源的BMSC培养上清液在体外引起正常HepG2肝细胞胰岛素抵抗,在体内诱发正常小鼠胰岛素抵抗.

[背景]砷暴露是我国常见的重要环境与职业有害因素,砷暴露所致的胰岛素抵抗(IR)对人群健康危害已引起广泛关注.[目的]基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)/葡萄糖转运蛋白 4(GLUT4)通路探讨砷暴露所致肝脏IR的部分机制,并探讨银杏叶提取物(GBE)对砷暴露所致肝脏IR的作用及其机制.[方法]通过网络药理学预测药物的作用靶点进行分析,并进行体内外实验验证.体内实验:将48只SPF级C57BL/6J雄性小鼠分为对照组、50 mg·L-1 NaAsO2 模型组(NaAsO2)、50 mg·L-1 NaAsO2+10 mg·kg-1 GBE干预组(NaAsO2+GBE)、10 mg·kg-1 GBE共 4组,每组 12只.染毒方式为自由饮用含 50 mg·L-1 NaAsO2 的纯净水,干预方式为每周 1次腹腔注射含 10 mg·kg-1 GBE的生理盐水.染毒 6个月后,进行血糖检测、腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)、胰岛素耐量实验(ITT)等实验,处死小鼠后取血清及肝脏组织,肝脏组织病理切片,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清胰岛素水平、肝脏组织糖原含量及葡萄糖含量,蛋白免疫印记(WB)检测PPARγ及GLUT4蛋白表达.体外实验:使用肝癌细胞(HepG2)细胞,分为对照组、8 μmol·L-1 NaAsO2 组(NaAsO2)、8 μmol·L-1 NaAsO2+200 mg·L-1 GBE干预组(NaAsO2+GBE)、200 mg·L-1 GBE组(GBE),共 4组.ELISA法检测细胞糖原及葡萄糖水平,WB法检测PPARγ及GLUT4蛋白表达.[结果]网络药理学发现GBE和PPARγ具有强烈的结合效应.体内实验中,小鼠的一般指标及血糖相关指标提示,与对照组相比,NaAsO2 组血糖水平升高,而NaAsO2+GBE组小鼠血糖水平低于NaAsO2 组(P＜0.01).病理切片提示,砷暴露组(NaAsO2 组和NaAsO2+GBE组)肝脏结构损伤较重,染色深浅不一,部分肝细胞坏死并有弥漫性红细胞出现.体外实验及体内实验发现,与对照组相比,NaAsO2 组糖原合成的能力及葡萄糖摄取的能力下降,而NaAsO2+GBE组可以改善这个状况,差异有统计学意义(P＜0.01);WB法发现PPARγ表达受到了抑制,细胞膜上的GLUT4水平降低,而这些改变在NaAsO2+GBE组中均有缓解,差异有统计学意义(P＜0.01).[结论]本研究结果提示GBE通过调控PPARγ/GLUT4通路拮抗砷暴露所致的肝脏IR,GBE对砷暴露所致肝脏IR具有一定保护作用,PPARγ可能是砷暴露所致肝脏IR的潜在治疗靶点.

该研究采用超高速离心和蔗糖密度梯度离心分离纯化石榴皮胞外囊泡(pomegranate peel-derived extracellular nanovesicles,PPENs)并对其进行形貌结构表征.体外α-葡萄糖苷酶抑制实验及胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)HepG2细胞模型测试显示,PPENs具有良好的抗糖尿病活性,α-葡萄糖苷酶抑制IC50为(35.3±1.1)μg·mL-1,显著优于阳性药品阿卡波糖(acarbose).PPENs在100μg·mL-1可以显著提高IR细胞的葡萄糖吸收量.通过色谱-质谱联用开展PPENs脂质组、蛋白质组及代谢物分析,对microRNA(miRNA)序列进行鉴定和人类靶基因预测分析.分析结果表明,PPENs含有丰富的脂质和转运蛋白,为PPENs的跨组织运输与分布提供物质基础.京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge-nomes,KEGG)通路富集分析提示,脂质和miRNA可能是PPENs发挥抗糖尿病活性的关键成分.

Objective:Research has shown that celastrol can effectively treat a variety of diseases,yet when passing a certain dosage threshold,celastrol becomes toxic,causing complications such as liver and kidney damage and erythrocytopenia,among others.With this dichotomy in mind,it is extremely important to find ways to preserve celastrol's efficacy while reducing or preventing its toxicity.Methods:In this study,insulin-resistant HepG2(IR-HepG2)cells were prepared using palmitic acid and used for in vitro experiments.IR-HepG2 cells were treated with celastrol alone or in combination with N-acetylcysteine(NAC)or ferrostatin-1(Fer-1)for 12,24 or 48 h,at a range of doses.Cell counting kit-8 assay,Western blotting,quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,glucose consump-tion assessment,and flow cytometry were performed to measure celastrol's cytotoxicity and whether the cell death was linked to ferroptosis.Results:Celastrol treatment increased lipid oxidation and decreased expression of anti-ferroptosis pro-teins in IR-HepG2 cells.Celastrol downregulated glutathione peroxidase 4(GPX4)mRNA.Molecular docking models predicted that solute carrier family 7 member 11(SLC7A11)and GPX4 were covalently bound by celastrol.Importantly,we found for the first time that the application of ferroptosis inhibitors(especially NAC)was able to reduce celastrol's toxicity while preserving its ability to improve insulin sen-sitivity in IR-HepG2 cells.Conclusion:One potential mechanism of celastrol's cytotoxicity is the induction of ferroptosis,which can be alleviated by treatment with ferroptosis inhibitors.These findings provide a new strategy to block celastrol's toxicity while preserving its therapeutic effects.

该文对木本曼陀罗内生真菌Fusarium solani MBM-5(茄腐皮镰刀菌)的次级代谢产物进行了化学及生物活性研究.运用多种色谱方法(如开放ODS柱色谱、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20 凝胶柱色谱及半制备型HPLC等),从F.solani MBM-5培养物的乙酸乙酯萃取物中共分离得到 6 个烯酸类化合物,包括 1 个新化合物和 5 个已知化合物.利用化合物的理化常数和波谱学(UV、IR、NMR、HR-ESI-MS等)方法及Mosher's反应,鉴定了化合物结构,分别为fusaridioic acid E(1)、fusaridioic acid C(2)、fusaridioic acid A(3)、L660282(4)、hymeglusin(5)、hymeglnone(6),其中化合物 1 为新化合物.采用MTT法和Griss法,分别评价了所有化合物对 2 种肿瘤细胞的生长抑制作用,以及对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7 释放NO的影响及其抗炎作用.实验结果表明,化合物 5 对A549 和HepG2 细胞株具有较强的生长抑制活性(IC50 分别为 4.70、13.57 μmol·L-1),并且化合物 1 和 6 可显著抑制LPS诱导RAW264.7 细胞的NO释放量,其IC50 分别为 77.00、70.33 μmol·L-1.