目的:探讨母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）及Rac1/Limk1/Cofilin信号通路在先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HD）中的作用机制。方法:应用qRT-PCR、Westernblot方法检测2018年1月至2021年1月在遵义医科大学附属医院治疗并确诊为HD的30例患儿HD狭窄段、30例移行段组织和14例正常肠管组织中MEG3和Rac1/Limk1/Cofilin表达情况，并通过建立MEG3过表达组、溶剂组、对照组及Rac1、Limk1、Cofilin抑制组细胞模型，观察Rac1、Limk1及Cofilin蛋白表达情况及细胞迁移和增殖能力。结果:狭窄段、移行段MEG3、Limk1和Cofilin的RNA相对表达量较正常肠管组织低（ P<0.05），而移行段与狭窄段比较，差异无统计学意义（ P>0.05）；Rac1的相对表达量比较：正常肠管>移行段>狭窄段，差异有统计学意义（ P<0.05）。狭窄段、移行段Rac1、Limk1和Cofilin蛋白表达水平与正常肠管组织比较均明显降低（ P<0.05），而移行段与狭窄段比较，差异无统计学意义（ P>0.05）。MEG3过表达组MEG3的表达量明显高于对照组及溶剂组（ P<0.05）；MEG3过表达组Rac1、Limk1的相对表达量均明显高于对照组及溶剂组（ P<0.05）；MEG3过表达组Cofilin相对表达量与对照组、溶剂组比较无明显差异（ P>0.05）。MEG3过表达组Rac1和Cofilin蛋白的相对表达量明显高于溶剂组和对照组（ P<0.05），MEG3过表达组Limk1的表达量与对照组比较无明显差异（ P>0.025）；MEG3过表达组细胞的迁移数量明显高于对照组和溶剂组（ P<0.05）。对照组Rac1、Limk1、Cofilin的蛋白表达量明显高于Rac1、Limk1和Cofilin抑制组（ P<0.05），对照组细胞的迁移数量明显高于Rac1、Limk1、Cofilin抑制组（ P<0.05）。 结论:MEG3可通过促进Rac1、Limk1和Cofilin基因表达影响神经嵴细胞的迁移，进而与先天性巨结肠发病有关。

目的:探讨ICG-001对大鼠孤独症样行为及海马锥体神经元树突棘形态发育的影响。方法:健康雌性Wistar大鼠自然受孕，出生子代大鼠依据随机数字表法分为4组：生理盐水对照组、ICG-001对照组、丙戊酸钠(VPA)组和ICG-001处理组。每组12只。运用三箱社交、埋珠、旷场和高架十字迷宫实验检测大鼠社交、重复刻板和焦虑样行为。应用免疫荧光检测大鼠海马CA1区神经特异核蛋白(NeuN)阳性神经元数目。高尔基染色法观察大鼠海马锥体神经元树突棘密度和形态改变。Western blot检测大鼠海马磷酸化LIM激酶1(LIMK1)、肌动蛋白结合蛋白(Cofilin)、纤维状肌动蛋白(F-actin)和脑发育调节蛋白A(Drebrin A)蛋白表达。采用单因素方差分析统计学差异，以 Tukey法进行组间比较。 结果:1．三箱社交行为实验：生理盐水对照组、ICG-001对照组、VPA组和ICG-001处理组与新奇大鼠接触时间分别为(219.42±5.38) s、(218.67±10.12) s、(126.58±5.02) s、(218.58±6.63) s,偏好指数分别为0.43±0.05、0.43±0.04、0.22±0.01、0.42±0.04；与VPA组相比，ICG-001处理组接触时间及偏好指数均显著增加(均 P<0.05)。2.埋珠实验：4组大鼠埋珠数量分别为(9.13±0.52)个、(9.08±0.64)个、(15.13±0.82)个、(9.42±0.86)个；与VPA组相比，ICG-001处理组埋珠数量显著减少( P<0.05)。3.旷场实验：4组大鼠的中央区域停留时间分别为(82.33±1.83) s、(81.32±4.19) s、(45.51±3.02) s、(81.44±3.19) s；与VPA组相比，ICG-001处理组中央区域停留时间明显增加( P<0.05)。4.高架十字迷宫实验：4组大鼠在开臂停留时间分别为(107.75±7.23) s、(106.08±7.50) s、(63.42±1.91) s、(106.67±7.07) s；与VPA组相比，ICG-001处理组在开臂停留时间显著增加( P<0.05)。5.免疫荧光实验：4组大鼠海马CA1区NeuN阳性神经元数量分别为(41.83±1.17)×10 4/μm 2、(41.00±0.77)×10 4/μm 2、(27.17±0.95)×10 4/μm 2、(40.00±0.90)×10 4/μm 2；与VPA组相比，ICG-001处理组NeuN阳性神经元数量明显较多( P<0.05)。6.高尔基染色实验：4组大鼠海马CA1区锥体细胞树突棘密度分别为(0.74±0.04)个/μm、(0.73±0.03)个/μm、(0.49±0.03)个/μm、(0.70±0.02)个/μm，其中蘑菇型顶树突棘所占百分比(0.49±0.02)%、(0.49±0.02)%、(0.33±0.02)%、(0.43±0.02)%，瘦长型顶树突棘所占百分比(0.27±0.02)%、(0.26±0.02)%、(0.34±0.01)%、(0.26±0.01)%。与VPA组相比，ICG-001处理组海马CA1区锥体细胞顶树突棘密度明显增加( P<0.05)，蘑菇型树突棘增多和瘦长型顶树突棘减少(均 P<0.05)。7.Western blot实验：4组大鼠海马磷酸化LIMK1/LIMK1比值分别为100.33±2.30、99.34±2.28、57.76±4.10、99.13±1.90，磷酸化Cofilin/Cofilin比值分别为100.18±2.43、100.18±1.70、57.12±1.88、99.53±1.69，F-actin/球状肌动蛋白(G-actin)比值分别为100.07±0.86、99.99±1.72、51.19±1.23、99.28±3.17，Drebrin A蛋白相对表达量分别为100.79±1.19、100.12±2.04、52.86±3.26、99.97±2.44；与VPA组相比，ICG-001处理组显著上调了海马中磷酸化LIMK1、Cofilin、F-actin和Drebrin A表达(均 P<0.05)。 结论:ICG-001可能通过调控LIMK1/Cofilin信号通路，促进F-actin形成和上调Drebrin A表达，增强树突棘形态发育，进而改善大鼠孤独症样行为。

目的:探讨二烯丙基二硫(DADS)对人胃癌MGC803细胞侵袭与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)的影响及其机制.方法:体内外实验分为MGC803细胞组与DADS处理组.MTT、划痕实验与侵袭实验检测DADS对增殖、迁移与侵袭的影响.Western Blot检测LIMK1-Cofilin1通路与EMT相关蛋白表达.相差显微镜观察MGC803细胞形态改变.裸鼠实验检测DADS对移植瘤的作用.结果:MTT显示,DADS可呈时间依赖性抑制MGC803细胞增殖(P＜0.05).划痕实验显示,DADS组细胞迁移距离(59.9±1.9)μm较MGC803组(127.1±2.0)μm明显缩短(P＜0.01).侵袭实验显示,DADS 组穿膜细胞(30.0±2.6)个较MGC803组(48.3±2.5)个明显减少(P＜0.01).Western Blot显示,DADS作用6 h、12 h、24 h、48 h 后,MGC803细胞LIMK1、p-LIMK1与p-Cofilin1(P＜0.001),Vimentin(P＜0.001)与MMP-9(P＜0.001)分别呈时间依赖性下调,而E-cadherin(P=0.001)与TIMP-3明显上调(P＜0.001).相差显微镜显示,DADS处理后,纤维母细胞样细胞减少,异型性显著降低.裸鼠实验显示,DADS组移植瘤较MGC803细胞组生长缓慢(P＜0.05),DADS组移植瘤重量较MGC803细胞组降低,抑瘤率为60.19％(P＜0.001),Ki-67、Vimentin、Snail和CD34阳性表达均降低,E-cadherin表达增加.结论:DADS可通过LIMK1-Cofilin1通路体内外抑制MGC803细胞侵袭与EMT.

目的 探究JNK、LIMK2抑制剂对海绵体神经损伤大鼠勃起功能的影响及其作用机制.方法 选取72只成年健康雄性Wistar大鼠为研究样本,均建立阴茎海绵体神经损伤模型,随机分为4组(对照组、JNK组、LIMK2组、联合组),每组18只,分别给予安慰剂、JNK抑制剂、LIMK2抑制剂及JNK抑制剂+LIMK2抑制剂,观察各组大鼠勃起功能、LOX-1、NOX、NO、ET-1表达、p-c-Jun阳性凋亡细胞量、p-LIMK2阳性成纤维细胞量,以及Bax、Bcl-2、Caspase-3、eNOS、c-Jun、Cofilin蛋白相对表达.结果 JNK、LIMK2、联合组最大ICP/MAP、AUC/MAP显著高于对照组,联合组显著高于JNK、LIMK2组(P＜0.05);JNK、LIMK2、联合组NO水平显著高于对照组,联合组显著高于JNK、LIMK2组(P＜0.05);JNK、LIMK2、联合组LOX-1、NOX、ET-1水平显著低于对照组,联合组显著低于JNK、LIMK2组(P＜0.05);JNK、LIMK2、联合组p-c-Jun阳性凋亡细胞量、p-LIMK2阳性成纤维细胞量显著低于对照组,联合组显著低于JNK、LIMK2组(P＜0.05);JNK、LIMK2、联合组Bcl-2、eNOS蛋白相对表达量显著高于对照组,联合组显著高于JNK、LIMK2组(P＜0.05);JNK、LIMK2、联合组Bax、Caspase-3蛋白相对表达量显著低于对照组,联合组显著低于JNK、LIMK2组(P＜0.05);JNK、LIMK2组、联合组c-Jun、Cofilin蛋白相对表达量显著低于对照组,联合组显著低于JNK、LIMK2组(P＜0.05).结论 联合抑制JNK和LIMK2可以通过调节海绵体神经损伤大鼠c-Jun/Bcl-2/Bax和LIMK2/Cofilin通路抑制其海绵体细胞凋亡和纤维化来改善勃起功能.目前,鉴于RP后阴茎康复的局限性,JNK和LIMK2的特异性抑制或可作为海绵体神经损伤诱导的勃起功能障碍患者的特异性治疗靶点之一.

目的 研究清开灵注射液诱发类过敏反应的作用及其机制.方法 采用BALB/c小鼠和BN大鼠,观察给予清开灵注射液后小鼠皮肤血管渗透性以及大鼠平均动脉血压等类过敏指标的变化;利用RBL-2H3大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞,观察清开灵注射液作用后磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活性以及Racl、PAK1、LIMK1和人肌动蛋白素(Cofilin)蛋白含量的变化.结果 5 mL·kg-1清开灵注射液即可引起小鼠以血管通透性增高为主要表现的较为轻微的类过敏反应,而7.5 mL·kg-1和15 mL·kg-1清开灵注射液均可引起较为严重的类过敏反应,其反应呈剂量依赖性;另外,5,7.5和15mL·kg-l清开灵注射液可在一定时间范围内剂量依赖性地引起大鼠平均动脉血压降低.清开灵注射液体外可诱导RBL-2H3细胞发生类过敏反应,PI3K激酶活性增加,Rac1、PAK1、LIMK1和Cofilin蛋白含量增高,且具有剂量依赖性.结论 小鼠和大鼠体内类过敏反应检查法和RBL-2H3细胞中PI3K激酶及Rac1、PAK1、LIMK1、Cofilin蛋白含量检查法可作为类过敏反应检查方法.初步认定清开灵注射液诱导类过敏反应的发生可能是基于PI3K-Racl细胞运动信号转导通路.

异常的肌动蛋白与切丝蛋白棒状小体(Cofilin-rods)是除了Aβ噬斑及Tau神经纤维缠结外,阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的另一个显著病理特征.目前,在基于Aβ噬斑进行的药物开发尚未成功的情况下,Rac1/PAK/LIMK1/Cofilin的研究引起人们广泛的关注.因此,研究神经切丝蛋白(Cofilin)通路与微丝骨架(F-actin)动态周转的调控关系,可进一步揭示AD的病理机制及发现新的药物靶点.

目的 探讨缺氧加重淀粉样β蛋白(Aβ)对神经细胞毒性作用的通路. 方法 体外培养入神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞),细胞分为对照组、Aβ干预组、缺氧组、Aβ干预十缺氧组,采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测细胞中p21激活激酶1(PAK1)、LIM激酶(LIMK1)、cofilin mRNA表达水平,用免疫印迹(Western blot)检测细胞中PAK1、LIMK1、磷酸化LIMK1 (P-LIMK1)、cofilin、磷酸化cofilin(P-cofilin)蛋白表达水平. 结果 Aβ处理后,SH-SY5Y细胞的活力减少;与对照组比较,10μmol/L Aβ干预SH-SY5Y细胞24 h后,PAK1、LIMK1、P-LIMK1、P-cofilin蛋白表达量减少(均P＜0.05),PAK1和LIMK1的mRNA表达减少(P＜0.05),cofilin蛋白和mRNA表达差异无统计学意义.10 μmol/L Aβ+2％氧气干预条件下处理SH-SY5Y细胞24 h后,与Aβ干预组比较,PAK1、LIMK1、P-LIMK1、P-cofilin蛋白表达量减少(均P＜0.05),PAK1和LIMK1的mRNA表达减少,且差异有统计学意义(均P＜0.05),cofilin蛋白和mRNA表达差异无统计学意义. 结论 Aβ可能通过抑制PAK1的活性来减少P-LIMK1,进而导致eofilin磷酸化减少,去磷酸化cofilin形成增多,导致神经元的损伤,缺氧通过该通路加重Aβ对神经细胞的毒性作用.

目的 研究microRNA-433(miR-433)对人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖及迁移的作用.方法 采用实时聚合酶链反应(real-time PCR)检测miR-433在A549、NCI-H1299、NCI-H358以及人肺成纤维细胞系HFL1中的表达.不同浓度miR-433 mimic转染A549细胞,选取最佳浓度进行后续实验;MTT法检测细胞增殖情况;Transwel检测细胞迁移情况;双荧光素酶报告基因法检测miR-433与p21活化激酶4(PAK4)的靶向关系;Western blotting检测PAK4、单丝氨酸蛋白激酶1(LIMK1)、磷酸化单丝氨酸蛋白激酶1(p-LIMK1)、丝切蛋白(Cofilin)和磷酸化丝切蛋白(p-Cofilin)的表达.结果 与HFL1比较,miR-433在3种NSCLC中的表达均降低.过表达miR-43348 h后,A549细胞增殖和迁移能力降低,差异有统计学意义(P<0.05).双荧光素酶报告基因法证明PAK4为miR-433的靶向调节基因,且PAK4在3种NSCLC中的表达均上升.过表达miR-433后细胞中PAK4、p-LIMK1、p-Cofilin的表达均降低,与mimic control组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 miR-433能通过靶向下调PAK4的表达,抑制LIMK1/Cofilin信号通路,抑制A549细胞的增殖及迁移.

目的:观察温针灸对膝骨关节炎(KOA)大鼠软骨细胞骨架蛋白Rho相关蛋白激酶(ROCK)/单丝氨酸蛋白激酶1(LIMK1)/丝切蛋白(Cofilin)的影响,探讨针灸防治KOA的作用机制.方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组、艾灸组和温针灸组,每组24只.采用右膝关节腔注射4％木瓜蛋白酶制备KOA大鼠模型.针刺组、艾灸组和温针灸组于造模第1天开始,取右侧“内膝眼”“外膝眼”和“足三里”穴,分别采用针刺、艾灸和温针灸治疗,20 min/次,1次/d,共治疗21d.采用游标卡尺测量右膝关节宽度,排水法检测大鼠右侧足部体积,采用蛋白免疫印迹法检测右侧膝关节软骨组织ROCK、LIMK1和磷酸化LIMK1(p-LIMK1)、Cofilin、磷酸化Cofilin(p-Cofilin)蛋白表达水平.结果:与正常组比较,模型组大鼠右膝关节宽度增加(P＜0.05),第6天起右侧足部体积增大(P＜0.01),Markin评分升高(P＜0.05),右侧膝关节软骨组织ROCK、p-LIMK1和p-Cofilin蛋白表达水平升高(P＜0.01).与模型组比较,针刺组、艾灸组和温针灸组大鼠右膝关节宽度降低(P＜0.05),第12天起右侧足部体积减小(P＜0.05),Markin评分降低(P＜0.05),右侧膝关节软骨组织ROCK、p-LIMK1和p-Cofilin蛋白表达水平降低(P＜0.05).与针刺组和艾灸组比较,温针灸组大鼠右膝关节宽度降低(P＜0.05),第15天起右侧足部体积减小(P＜0.05),Markin评分降低(P＜0.05),右侧膝关节软骨组织ROCK、p-LIMK1和p-Cofilin蛋白表达水平降低更明显(P＜0.05).结论:相对于针刺和艾灸,温针灸更能有效调节KOA大鼠关节炎性损伤状况,其机制可能与降低软骨组织骨架蛋白ROCK、p-LIMK1和p-Cofilin蛋白表达有关.

目的 了解LIM激酶(LIMK)与结直肠癌的关系,为结直肠癌的转移、侵袭及靶向治疗提供研究依据.方法 复习近年来国内外关于LIMK的结构功能以及其与结直肠癌关系研究进展的相关文献并加以综述.结果 LIMK及其主要通路ROCK/LIMK/cofilin及PAK/LIMK/cofilin上下游因子均参与了肿瘤细胞周期进展、肿瘤细胞侵袭、迁移、增殖等多种细胞生物学行为,如p21活化蛋白激酶4(PAK4)通过PAK4/LIMK 1/cofilin信号通路参与细胞骨架动力学调节癌细胞迁移和侵袭,cofilin经过Rho/ROCK/LIMK l/cofilin通路影响肿瘤细胞运动和形态的变化,从而参与肿瘤细胞的侵袭和迁移;两种肿瘤转移相关蛋白MYH9和ACTN4为LIMK1的直接靶标,此三者相互作用可以促进结肠癌进展.LIMK家族的另一成员LIMK2可通过限制上皮间充质转化过程抑制细胞转移的能力,并与β-连环蛋白的核可激活Wnt信号传导途径,从而导致结肠癌进展和转移.二烯丙基二硫可以下调结肠癌细胞SW480中LIMK1的表达,抑制LIMK1/cofilin信号通路,阻碍血管生成和上皮间充质转化,抑制结肠癌的迁移和侵袭,而其他LIMK抑制剂暂未在结直肠癌中得到验证.结论 结直肠癌及其转移的分子机制尚未完全阐明,通过对结直肠癌及其转移机制与LIMK关系的深入研究,可为结直肠癌及转移提供分子靶向治疗突破点,并有助于为探究结直肠癌的诊断、判断复发、预后及转移情况提供更多帮助.