目的:分析北京地区呼吸道感染住院儿童人博卡病毒1型(human bocavirus 1，HBoV1)的流行病学特征，阐明遗传进化特点。方法:采用real-time PCR方法对2017—2019年北京友谊医院呼吸道感染住院患儿的2 848份鼻咽抽吸物样本进行HBoV1核酸检测，结合临床信息进行流行病学分析；利用巢氏PCR方法扩增HBoV1的NP1和VP1基因，分析序列同源性；构建VP1的最大分支可信度树和种群进化图，进行时间进化分析。结果:2 848份样本中检出HBoV1阳性样本90份，感染率为3.16%，5岁以下患儿居多(93.33%，84/90)。HBoV1感染全年可见，10月份病例数最多，检出率为7.23%(18/249)。HBoV1阳性病例多与其他呼吸道病毒混合感染(48.89%，44/90)，临床症状多为咳嗽和发热。巢氏PCR扩增获得NP1区序列55条和VP1序列47条，核酸同源性分别为98.9%~100%和99.1%~100%。HBoV1 VP1时间进化分析显示本研究获得的HBoV1基因序列出现在两个进化分支上，HBoV1种群动态平稳。结论:HBoV1是导致北京地区儿童呼吸道感染的常见病毒之一，其基因进化相对稳定，但仍需持续监测。

目的:探究NPAS2基因在肺腺癌(LUAD)中的表达及其与相关临床参数的关联，分析其对患者总生存期(OS)的影响及在LUAD预后中的预测价值。方法:从癌症基因组图谱数据库(TCGA)中下载LUAD转录组测序及临床资料数据，分析LUAD肿瘤组织与正常肺组织中NPAS2的表达差异。收集LUAD患者肿瘤组织及正常肺组织应用蛋白免疫印迹法(WB)检测NPAS2蛋白表达，并分析TCGA数据库中NPAS2表达与LUAD患者肿瘤分期及OS的关联。通过基因集富集分析(GSEA)挖掘NPAS2潜在的致癌机制。结果:TCGA差异分析显示NPAS2 mRNA在LUAD肿瘤组织1.83(1.01，3.01)中的表达水平高于正常肺组织，0.74(0.49，1.15)，差异有统计学意义( Z＝7.21， P<0.05)；配对分析显示NPAS2 mRNA在LUAD组织1.82(1.37，3.08)中的表达也高于配对的正常肺组织0.76(0.51，1.16)，差异有统计学意义( Z＝5.63， P<0.05)。WB结果显示，NPAS2蛋白在LUAD 0.62(0.40，1.36)中的表达水平高于正常肺组织0.14(0.08，0.58)，差异有统计学意义( Z＝2.71， P<0.05)。在亚组分析中，与T1~2组相比，T3~4组中NPAS2 mRNA高表达的比例更高1.81(1.01，2.92)比2.10(1.29，3.71)( Z＝2.12， P<0.05)；在预后分析中，NPAS2高表达组患者的预后相对较差，与NPAS2 mRNA低表达组比较差异有统计学意义( χ2＝9.66， P<0.05)，Kaplan-Meier plotter数据库显示NPAS2 mRNA高表达LUAD患者预后更差( HR＝2.19， P<0.05)，Cox比例风险模型进行多因素分析表明更高的TNM分期( HR＝2.12， P<0.05)及NPAS2 mRNA高表达( HR＝1.21， P<0.05)预后更差，与NPAS2低表达患者相比，NPAS2高表达患者OS更短( P<0.05)；GSEA基因富集结果显示NPAS2高表达时，肿瘤、小细胞肺癌、细胞外基质受体相互作用、凋亡、白细胞跨内皮迁移、ERBB等通路相关基因显著富集。 结论:NPAS2在LUAD中高表达，并与肿瘤局部浸润和OS相关，可以作为LUAD独立的预后预测因子。

目的:探索可能影响肾脏衰老的相关基因，并验证时钟基因 Arntl在衰老肾脏中的表达变化。 方法:通过全转录组测序鉴定C57BL/6雄性24月龄小鼠（衰老组）和3月龄小鼠（年轻组）的差异表达基因，并通过生物信息学方法分析其所富集的生物学通路及关键蛋白。应用实时荧光定量PCR和Western印迹验证Arntl的mRNA及蛋白表达量。结果:（1）全转录组测序结果显示在C57BL/6衰老组小鼠及年轻组小鼠中共筛选出119个显著差异表达基因。差异表达基因主要富集于节律过程、昼夜节律、基因表达的昼夜调控等生物学过程（均 P<0.001）。蛋白质互作网络分析结果显示，Nfil3、Hspa8、Arntl、Hlf、Rorc、Per3、Npas2等是差异表达基因中的关键蛋白。时钟基因 Arntl、 Nfil3、 Npas2、 Per3在衰老组及年轻组小鼠之间的mRNA表达差异（均 P<0.05）与测序结果一致。（2）相较于C57BL/6年轻组小鼠和SAMR1快速老化小鼠，Arntl蛋白表达量在衰老组小鼠和SAMP8快速老化小鼠肾脏组织中均有下降趋势。 结论:时钟基因及其参与的昼夜节律生物学通路可能在肾脏衰老过程中发挥重要作用。Arntl在衰老肾脏中表达量有下降趋势。

目的 探究柴胡Bupleuri Radix不同极性部位对人肝癌SMMC-7721细胞的影响及相关机制.方法 不同极性部位的柴胡作用于SMMC-7221细胞后,采用MTT法考察细胞增殖能力;采用划痕实验考察细胞迁移能力;采用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;采用qRT-PCR及Western blotting检测柴胡低极性部位(LPB)组和中极性部位(MPB)组干预后肝癌细胞与周期阻滞、凋亡及迁移相关的基因与蛋白表达;采用代谢组学技术检测LPB和MPB干预前后肝癌细胞内源性差异物的变化,采用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析LPB和MPB调节的代谢通路.结果 与对照组比较,LPB、MPB能够显著抑制SMMC-7721细胞增殖(P＜0.05、0.01、0.001),LPB能够显著抑制细胞迁移(P＜0.05、0.01).LPB阻滞细胞于G1期和G2期,MPB阻滞细胞于G2期.LPB显著下调肝癌细胞中神经元PAS结构域蛋白 2(neuronal pas domain protein 2,NPAS2)、细胞周期蛋白依赖性激酶 1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)、CDK2、细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、Cyclin E基因表达(P＜0.05),MPB显著下调细胞分裂周期蛋白25B(cell division cycle 25B,CDC25B)、CDK1、Cyclin B1 基因表达(P＜0.05).LPB 显著下调 NPAS2、CDC25A 蛋白表达(P＜0.01),LPB 和 MPB 显著下调 B 淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达(P＜0.01、0.001),上调 Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2associated Xprotein,Bax)、细胞色素 C(cytochrome C,Cyt-C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystein-asparate protease-3,Caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、组织金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)蛋白表达(P＜0.05、0.01、0.001).代谢组学结果显示肝癌的发生与甘油磷脂代谢、鞘磷脂代谢等7种代谢通路的紊乱密切相关.结论 LPB和MPB能够抑制肝癌细胞的增殖,并促进其凋亡,肝癌细胞阻滞于G1期主要与Npas2-CDC25A-CDK2-CyclinE复合物有关,阻滞于G2期主要与CDC25B-CDK1-CyclinB1复合物有关,凋亡主要与Npas2-CDC25A靶点以及激活线粒体凋亡途径相关.此外,LPB和MPB可干预甘油磷脂代谢、鞘磷脂代谢等代谢途径发挥抗肝癌作用.

目的·利用生物信息学方法探索骨关节炎与烟酰胺代谢相关基因之间的关系,找到具有诊断价值和治疗潜力的关键基因.方法·以"Osteoarthritis"为检索词,在GEO数据库中获取GSE12021、GSE55235和GSE55457数据集,将GSE55457作为验证集.去除GSE12021和GSE55235数据集的批次效应后,得到标准化的合并数据集,将其作为训练集,并在训练集中筛选出差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs).在GeneCards数据库和MSigDB数据库中获取所有烟酰胺代谢相关基因(nicotinamide metabolism-related genes,NMRGs).将DEGs与NMRGs取交集,得到烟酰胺代谢相关差异表达基因(nicotinamide metabolism-related differentially expressed genes,NMRDEGs).对训练集进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA),对NMRDEGs进行基因本体(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析.通过LASSO(least absolute shrinkage and selection operator)和支持向量机(support vector machine,SVM)分析筛选出NMRDEGs关键基因,构建骨关节炎诊断模型,并用验证集GSE55457进行验证.通过单样本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)分析免疫细胞的浸润类型.通过DGIdb数据库、ENCORI数据库和CHIPBase数据库对关键基因的mRNA进行相互作用网络和药物小分子预测.通过干扰小RNA(small interfering RNA,siRNA)敲降软骨细胞内NMRDEGs关键基因,用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorogenic quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测关键基因敲降对软骨形成相关基因表达的影响.结果·发现了NAMPT、TIPARP等7个NMRDEGs.GO和KEGG分析富集到核因子κB信号通路和正向调节白细胞介素-1介导的信号通路等.GSEA富集到缺氧诱导因子-1转录因子通路(Hif1 Tfpathway)和多配体蛋白聚糖1(syndecan 1)通路等信号通路.LASSO分析和SVM分析共同筛选得到NPAS2、TIPARP和NAMPT关键基因并构建了骨关节炎诊断模型,验证集检验提示诊断模型诊断效果具有高准确度.ssGSEA免疫浸润分析的结果显示,巨噬细胞等15种免疫细胞存在显著差异(均P<0.05).找到了7个针对关键基因的潜在药物小分子,19种与关键基因相互作用且上游基因与下游基因数量之和大于10的miRNA,19种与关键基因结合且上游基因与下游基因数量之和大于7的转录因子,27个聚类数>19的RNA结合蛋白.RT-qPCR结果显示,关键基因敲降会降低软骨形成相关基因的表达.结论·NPAS2、TIPARP和NAMPT为烟酰胺代谢相关的关键基因,可据此构建骨关节炎诊断模型.

目的 研究芬太尼暴露对斑马鱼幼鱼的心脏和神经毒性及对其发育相关基因表达的影响.方法 将受精后2h(2hpf)内发育良好的斑马鱼胚胎随机分为正常对照组,芬太尼5,10和20 mg·L-1染毒组.使用体视显微镜观察斑马鱼发育中的畸形表型,24,48,72,96和120 hpf统计斑马鱼胚胎或幼鱼的畸形率,120 hpf统计幼鱼的存活率.72,96和120 hpf采用斑马鱼微视行为分析系统记录幼鱼心率,120 hpf分析心包面积和静脉窦与动脉球(SV-BA)距离.120 hpf采用HE染色观察心房心室结构和心肌细胞结构,Image J软件分析新生神经元的面积和密度,荧光定量PCR检测心脏和神经发育相关基因心脏特异性转录因子(nkx2.5)、神经元PAS结构域蛋白4a(npas4a)、心房型利钠肽原B(nnpb)和高迁移率族转录因子9b(sox9b)mRNA表达.结果 芬太尼造成斑马鱼孵化不完全、脊柱弯曲、尾部畸形和心包水肿等发育畸形.与正常对照组相比,芬太尼10和20 mg·L-1组72 hpf幼鱼的畸形率显著增加(P<0.01),芬太尼各浓度组120 hpf幼鱼的存活率无明显变化;72 hpf芬太尼20 mg·L-1组幼鱼的心率显著下降(P<0.01);120 hpf芬太尼各浓度组幼鱼的心率均显著下降(P<0.01),芬太尼20 mg·L-1组斑马鱼幼鱼心包面积和SB-BA距离均显著增加(P<0.01),心房心室明显肿大,心肌细胞层数少且薄;斑马鱼幼鱼头部新生神经元密度和面积显著下降(P<0.05,P<0.01);nkx2.5,npas4a和sox9b mRNA表达下调(P<0.01),nppb mRNA表达上调(P<0.01).结论 斑马鱼胚胎发育期间接触芬太尼导致幼鱼心脏发育畸形和心跳减缓,同时产生新生神经元毒性,可能与影响心脏和神经发育相关基因的表达相关.

中医学早在两千多年前就已经提出了“择时给药”和“因时制宜”的理念.这一理念与现代的时间药理学、时间毒理学、时间治疗学不谋而合.现代时辰药理学研究发现生物钟不仅影响药物的吸收、分布、代谢和排泄,而且还与药物的治疗作用和毒性密切相关.生物钟是生物适应环境周期性变化的一种内在机制,存在于中枢和外周组织以及细胞中.生物钟系统由核心基因(Clock、Bmall和Npas2)、负反馈基因(Cry和Per)、钟控基因和靶基因(Dbp、Rev-Erbα、Rorα、Csnk、Temless等)组成.有研究显示,在分子生物学水平上,中药和中药复方可通过影响生物钟基因发挥治疗作用,因此,中药与生物钟之间存存相关性.文章对此做一综述,以期为中药作用的多靶点提供新思路.

目的 探讨72 h睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)对大鼠肝脏生物钟基因表达水平的影响.方法 将12只大鼠随机分为正常对照组和SD组.SD组大鼠使用SD仪进行SD 72 h后,暴露腹腔取肝,用RT-PCR方法检测大鼠肝组织中生物钟基因mRNA表达水平的变化,并对生物钟基因的蛋白表达产物进行免疫印迹分析.结果 与正常对照组相比,SD组大鼠肝脏生物钟基因clock、npas2、rev-erbα的mRNA表达水平呈显著下调,per1、per2、rorα mRNA表达水平显著升高,而bmal1和cry1 mRNA表达水平无显著变化.与正常对照组相比,72 h SD后肝组织BMAL1、CLOCK、NPAS2、CRY1、REV-ERBα蛋白表达水平显著下调,而PER1、PER2、RORα蛋白表达水平显著升高.结论 72 h SD可同时在转录和翻译水平诱导大鼠肝多种核心生物钟基因的异常表达.

目的 探讨72 h睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)对大鼠脾脏淋巴细胞生物钟基因表达水平的影响.方法 将大鼠随机分为正常对照组和SD组.SD组大鼠使用SD仪进行睡眠剥夺72 h后,取脾脏制备成单细胞悬液,利用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞;分别通过RT-PCR和免疫印迹方法检测大鼠脾淋巴细胞中生物钟基因mRNA和蛋白水平的变化.结果 与正常对照组相比,SD组大鼠脾脏生物钟基因bmal1、clock、per2、rev-erbα的mRNA相对表达水平呈现显著下调,而npas2、per1、rorα、cry1 mRNA相对表达水平无显著变化.与正常对照组相比,72 h SD后脾脏淋巴细胞BMAL1、NPAS2、CRY1、RORα蛋白表达水平显著下调,PER1蛋白表达水平呈升高趋势,而REV-ERBα蛋白表达水平无显著变化.结论 72 h SD应激条件可在转录和翻译水平诱导大鼠脾多种核心生物钟基因表达水平发生异常改变.

目的 采用逍遥散干预慢性应激损伤模型大鼠,观察其海马区神经PAS域蛋白2(neuronal PAS domain protein 2,Npas2)基因的表达及其DNA特定区域甲基化的修饰情况.方法 将90只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、慢性应激模型组和逍遥散治疗组,共3组,每组30只.造模采用Cart多相慢性应激大鼠模型并加以改进,逍遥散治疗组在造模同时每天给予逍遥散2 mL,连续造模21d.采用RT-PCR一步法及免疫组织化学染色法测定各组大鼠海马区Npas2基因及其蛋白表达情况,基因甲基化检测采用Sequenom MassARRAY法.结果 慢性应激损伤大鼠海马Npas2mRNA及其相应蛋白表达有明显变化,与空白对照组和逍遥散治疗组比较差异均有统计学意义,但其mRNA及相应蛋白表达变化趋势不一致,其基因某些特定区域的甲基化程度有升高的趋势(个别位点有统计学差异).逍遥散治疗能够明显逆转慢性应激引起的Npas2mRNA及其相应蛋白的表达变化,相应区域DNA甲基化程度表现出下调趋势(个别位点有统计学差异).结论 Npas2基因参与了慢性应激损伤过程,其表达变化可能与其基因某些特定位点的甲基化修饰变化有关,逍遥散能够逆转这种表达改变,可能是通过调节Npas2基因特定位点的甲基化程度发挥作用.