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GRSF1在小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用:与铁死亡的关系
编辑人员丨1周前
目的:评价富含鸟嘌呤序列的结合因子1(GRSF1)在小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其与铁死亡的关系。方法:清洁级雄性C57BL/6小鼠24只,8~10周龄,体质量20~25 g,采用随机数字表法分为4组( n=6):假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注组(IR组)、脑缺血再灌注+GRSF1过表达组(IR+LV-GRSF1组)、脑缺血再灌注+GRSF1过表达+谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)抑制剂组(IR+LV-GRSF1+RSL3组)。采用大脑中动脉栓塞(MCAO)法制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型。IR+LV-GRSF1组于造模前7 d时侧脑室注射GRSF1过表达慢病毒2 μl;IR+LV-GRSF1+ RSL3组造模前连续2 d腹腔注射GPX4抑制剂RSL3 5 mg/kg。再灌注24 h后TTC法确定脑梗死体积百分比,Nissl染色计数缺血区存活神经元,取缺血区脑组织,RT-qPCR法检测衰老标志物p16、p21及衰老相关分泌表型TNF-α的mRNA表达,ELISA法检测MDA、SOD和谷胱甘肽(GSH)含量,Western blot法检测GRSF1、GPX4、长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)和铁蛋白的表达水平。 结果:与Sham组相比,IR组脑梗死体积百分比升高,存活神经元计数降低,缺血区脑组织p16 mRNA、p21 mRNA及TNF-α mRNA表达上调,SOD和GSH含量降低,MDA含量升高,GRSF1和GPX4表达下调,ACSL4和铁蛋白表达上调( P<0.05);与IR组相比,IR+LV-GRSF1组脑梗死体积百分比降低,存活神经元计数升高,缺血区脑组织p16 mRNA、p21 mRNA及TNF-α mRNA表达下调,SOD和GSH含量升高,MDA含量降低,GRSF1和GPX4表达上调,ACSL4和铁蛋白表达下调( P<0.05);与IR+LV-GRSF1组相比,IR+LV-GRSF1+RSL3组脑梗死体积百分比升高,存活神经元计数降低,缺血区脑组织p16 mRNA、p21 mRNA及TNF-α mRNA表达上调,SOD和GSH含量降低,MDA含量升高,GPX4表达下调,ACSL4和铁蛋白表达上调( P<0.05)。 结论:GRSF1可通过上调GPX4表达,减轻氧化应激,进而抑制铁死亡,参与小鼠脑缺血再灌注损伤的内源性保护机制。
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编辑人员丨1周前
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基于加权基因共表达网络分析筛选儿童神经母细胞瘤中MYCN扩增相关基因
编辑人员丨1周前
目的:通过生物信息学分析探究儿童神经母细胞瘤中与MYCN(N-myc)基因相关的共表达基因。方法:下载TARGET数据库神经母细胞瘤表达数据共179例,WGCNA分析筛选MYCN扩增共表达基因模块;针对目标基因模块个基因行GO、KEGG富集分析筛选MYCN扩增相关基因可能参与生物过程及信号通路;以MYCN扩增状态将神经母细胞瘤表达数据分为扩增组65例、非扩增组114例,行差异表达基因分析;筛选的差异表达基因同MYCN扩增相关基因取交集后运用K-M法行生存分析(log-rank检验),筛选预后相关基因,Logistics回归探究MYCN扩增状态同预后基因的关系。结果:WGCNA分析提示MEgreenyellow模块同MYCN基因扩增状态相关性最强( R=0.46, P<0.05),为共表达基因,包含基因1 216个,富集分析提示MYCN扩增共表达基因多参与RNA相关通路(RNA的转运、剪切、修饰,RNA相关酶的活性等过程);差异表达基因分析显示,MYCN扩增组相较于非扩增组,基因表达上调47个,表达下调123个;WGCNA分析同差异表达基因取交集筛选出22个关键基因,行生存分析显示同预后相关的基因( P<0.05)有12个,其中DDX1与其他关键基因相关性相对较弱,或为神经母细胞瘤独立预后因素。 结论:LINC00839、ATP结合盒亚家族C4(ABCC4)、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP +依赖)2(MTHFD2)、磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)、序列相似性家族13 A(FAM11A)、磷酸丝氨酸转氨酶1 (PSAT1)、假尿苷酸合酶7(PUS7)、DEAD-box解旋酶1(DDX1)、溶质载体有机阴离子转运蛋白家族5A1(SLCO5A1)、Junctophilin 1(JPH1)、溶质载体家族16 1(SLC16A1)、MYCN Opposite Strand(MYCNOS)为神经母细胞瘤中MYCN扩增的共表达基因,与较差的预后相关,是神经母细胞瘤潜在的治疗靶点及预后指标。
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编辑人员丨1周前
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基于CRISPR技术构建发光噬菌体及其在大肠埃希菌鉴定中的应用
编辑人员丨1周前
目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体(HT7),并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg(1~10)和PFN-1000同源重组质粒菌株,并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA(sgRNA);采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)系统联合介导的基因编辑技术,将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区,并成功构建发光噬菌体HT7;通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异;此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中,sgRNA8靶标的切割效率最高,成斑效率为0.18;噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后,PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带,说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率( P<0.001)、一步生长曲线( P=0.001)、感染复数( P=0.031)的生物特性分析中,均有显著差异,裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min,最佳感染复数为0.1;临床样本测试,可识别裂解6株大肠埃希菌,其余菌株均不裂解,4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统,并成功构建发光噬菌体HT7,该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌,且对其他菌株无裂解作用,显示出良好的检测专一性和低检出限。
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编辑人员丨1周前
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杏仁核BDNF-AS在大鼠神经病理性痛形成中的作用
编辑人员丨1周前
目的:评价脑源性神经营养因子反义长链非编码RNA(BDNF-AS)在大鼠神经病理性痛(NP)形成中的作用。方法:清洁级健康雄性SD大鼠,2月龄,体重200~260 g,采用左侧L 5-6脊神经结扎法制备NP模型。实验Ⅰ 取大鼠56只,采用随机数字表法分为3组:假手术组(Sham组, n=8)、NP组( n=24)和BDNF组( n=24)。BDNF组于模型制备后1、3、6、13和20 d时双侧杏仁核注射外源性BDNF,每侧100 pmol。NP组和BDNF组于模型制备后7、14和21 d时随机取8只大鼠、Sham组于假手术模型制备后处死,取脑组织,分离杏仁核,ELISA法检测杏仁核BDNF含量,免疫组化法检测杏仁核BDNF阳性细胞数,实时定量PCR法检测杏仁核BDNF-AS的表达。实验Ⅱ 取大鼠32只,采用随机数字表法分为4组( n=8):假手术组(Sham组)、NP组、BDNF组和siRNA组。于模型制备后1、3、6、13和20 d时,BDNF组和siRNA组双侧杏仁核分别注射外源性BDNF每侧100 pmol或siRNA-BDNF-AS 50 nmol。于模型制备前(T 0)、制备后4 d(T 1)、7 d(T 2)、14 d(T 3)、21 d(T 4)时测定机械缩足反应阈(MWT)与热缩足潜伏期(TWL)。最后1次行为学测试完成后,处死大鼠,取脊髓组织,ELISA法检测脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α含量。 结果:实验Ⅰ 与Sham组比较,NP组模型制备后各时点杏仁核BDNF含量和BDNF阳性细胞数降低,BDNF-AS表达上调( P<0.05);与NP组比较,BDNF组模型制备后各时点杏仁核BDNF含量和BDNF阳性细胞数升高,BDNF-AS表达下调( P<0.05)。实验Ⅱ 与Sham组比较,NP组、BDNF组和siRNA组T 1~4时MWT降低,TWL缩短,脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α含量升高( P<0.05);与NP组比较,BDNF组和siRNA组T 1~4时MWT升高,TWL延长,脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α含量降低( P<0.05)。 结论:大鼠NP发生机制可能与杏仁核BDNF-AS表达上调,抑制BDNF合成,促进脊髓炎症反应有关。
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编辑人员丨1周前
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基于RNA-seq的脓毒症相关性脑病小鼠海马转录组分析及竞争性内源性RNA调控网络的构建
编辑人员丨1周前
目的:采用转录组测序技术(RNA-seq)筛选脓毒症相关性脑病(SAE)小鼠海马差异表达的长链非编码RNA(lncRNA)及mRNA,构建竞争性内源性RNA(ceRNA)调控网络。方法:清洁级健康雄性C57BL/6小鼠10只,6~8周龄,体质量20~25 g,采用随机数字表法分为2组( n=5):假手术组(Sham组)和脓毒症组(Sepsis组)。Sepsis组采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制备小鼠脓毒症模型,Sham组只开腹不进行盲肠结扎和穿孔。分别于术前1 d及术后3 d时行Morris水迷宫实验和条件恐惧实验检测小鼠认知功能。随后Sham组随机处死3只小鼠,Sepsis组处死认知功能测试最差的3只小鼠,取海马组织,通过BGISEQ-500平台行转录组测序,得到差异表达的mRNA和lncRNA,测序结果通过深圳华大基因科技服务有限公司提供的Dr.Tom平台行可视化分析,利用Cytoscape软件构建ceRNA调控网络。 结果:与Sham组比较,Sepsis组逃避潜伏期延长,靶向限停留时间百分比和僵直时间百分比降低( P<0.05)。转录组数据分析共获得差异表达的lncRNA 62个,其中45个lncRNA表达上调,17个lncRNA表达下调;差异表达的mRNA 282个,其中173个mRNA表达上调,109个mRNA表达下调。对差异表达的mRNA进行生物学过程的GO富集分析,结果显示差异表达的mRNA参与了记忆、学习或记忆、炎症应答、衰老相关行为减退的调空、突触可塑性调节等生物学过程;对差异表达的mRNA进行KEGG通路富集分析,结果显示差异表达的mRNA富集于IL-17信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路等。对差异表达的mRNA进行KDA分析,结果示Ch25h、Il6ra、Lcn2、Sgk1、Nr4a3、Osm、Saa3、Ccl7、Sqle、Dhcr24为SAE的关键基因。基于9个lncRNA、28个mRNA和134个miRNA成功构建了SAE小鼠海马的ceRNA调控网络。 结论:RNA-seq结果分析发现Ch25h、Il6ra、Lcn2、Sgk1、Nr4a3、Osm、Saa3、Ccl7、Sqle、Dhcr24 10个mRNA以及Rian、Gm35874、Gm34347等lncRNA是调控小鼠SAE的关键基因;同时成功构建了SAE小鼠海马基于lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络。
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编辑人员丨1周前
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新型冠状病毒标准物质研究进展
编辑人员丨1周前
新型冠状病毒(简称新冠病毒,2019n-CoV)标准物质是具有确定的新冠病毒序列和量值信息的一类足够均匀稳定的物质。国内外新冠病毒相关标准物质主要包括体外转录和基因组RNA标准物质、假病毒和灭活病毒标准物质,以及蛋白质类标准物质。它相当于一把"标尺",可用于新冠病毒检测试剂盒的量值溯源和方法验证、试剂盒性能评价和实验室能力验证,还可作为质控物质保证检测结果的准确性。此外,在确保全球新冠病毒测量的国际等效和国际互认中,新冠病毒标准物质也发挥了重要作用。
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编辑人员丨1周前
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微小RNA-494对促进脊髓损伤后功能恢复和抑制细胞凋亡的研究
编辑人员丨1周前
目的:探讨微小RNA(miRNA,miR)-494在脊髓损伤中的作用及其意义。方法:应用脊髓表面挫伤的方法建立大鼠脊髓损伤模型。分为1个假损伤对照组和5个脊髓损伤组,每组5只大鼠(购自复旦大学实验动物中心)。用miRNA芯片分析脊髓损伤后不同时间miRNA的表达。用agomiR-494鞘内治疗后,评定大鼠运动功能。正态性采用Shapiro-Wilk正态检验,组间差异采用单因素方差分析和双侧 t检验。 结果:与假损伤对照组比较,有14个miRNA上调,有46个miRNA下调2倍,而miR-494是最显著下调的miRNA之一。与单纯SCI组比较,agomiR-494鞘内治疗后的SCI+agomiR-494组,大鼠运动功能明显改善,剩余组织(甲酚紫染色评估)增多,TUNEL阳性细胞减少。agomiR-494对miR-494的上调可促进脊髓损伤后大鼠的功能恢复,减小病变大小并抑制凋亡细胞。脊髓组织中miR-494的表达与第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)的表达呈负相关( r=-0.834, P<0.05)。此外,miR-494通过直接靶向BV-2细胞中的3’端非编码区(3’UTR)来抑制蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径的负调节剂PTEN。 结论:在大鼠脊髓损伤模型中miR-494的过表达通过抑制PTEN的表达来激活Akt/mTOR信号通路,对脊髓损伤具有保护作用。
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编辑人员丨1周前
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DNA甲基转移酶在脓毒症小鼠急性肺损伤中的作用
编辑人员丨1周前
目的:评价DNA甲基转移酶在脓毒症小鼠急性肺损伤中的作用。方法:健康雄性C57BL/6小鼠48只,6~8周龄,体重20~25 g,采用随机数字表法分为4组( n=12):假手术组(Sham组)、假手术+DNA甲基转移酶抑制剂组(Sham+5-Aza组)、脓毒症组(Sepsis组)和脓毒症+DNA甲基转移酶抑制剂组(Sepsis+5-Aza组)。采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制备脓毒症小鼠急性肺损伤模型。于CLP后24 h时处死小鼠取肺组织,提取DNA利用比色法测定全基因组DNA甲基化水平,提取RNA采用实时荧光定量PCR法检测DNA甲基转移酶(DNMTl、DNMT3a、DNMT3b)的mRNA表达,确定肺湿重/干重比值,HE染色观察肺组织病理学结果,采用ELISA法测定IL-6、TNF-α、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、MDA含量、SOD和过氧化氢酶(CAT)活性。 结果:与Sham组比较,Sepsis组和Sepsis+5-Aza组小鼠CLP后24 h时肺组织全基因组甲基化水平升高,DNMT1和DNMT3a的mRNA表达上调,肺组织病理学损伤评分和肺湿重/干重比值升高,IL-6、TNF-α、HMGB1和MDA含量升高,SOD和CAT活性降低( P<0.05),Sham+5-Aza组上述各指标差异无统计学意义( P>0.05);与Sepsis组比较,Sepsis+5-Aza组小鼠肺组织全基因组甲基化水平降低,DNMT1和DNMT3a的mRNA表达下调,肺组织病理学损伤评分、肺湿重/干重比值、IL-6、TNF-α、HMGB1和MDA含量降低,SOD和CAT活性增加( P<0.05)。 结论:DNMT1和DNMT3a介导的DNA高甲基化参与了脓毒症小鼠急性肺损伤的过程。
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编辑人员丨1周前
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表没食子儿茶素没食子酸酯通过抑制凋亡减轻脓毒症肠道损伤的研究
编辑人员丨1周前
目的:观察表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)对脓毒症肠道损伤的作用,并探究对内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)性凋亡的途径是否存在影响。方法:选取60只雄性SD大鼠,根据随机数字表法将其分为5组:假手术组(Sham组)、盲肠结扎穿孔术致脓毒症组(cecal ligation and puncture, CLP组)、脓毒症+EGCG低剂量组(术后腹腔注射EGCG 25 mg/kg,EL组)、脓毒症+EGCG中剂量组(术后腹腔注射EGCG 50 mg/kg,EM组)、脓毒症+EGCG高剂量组(术后腹腔注射EGCG 75 mg/kg,EH组),每组均为12只。造模24 h后处死各组大鼠并收集标本。血清中炎症因子采用酶联免疫吸附试验检测;苏木精伊红染色后,光镜下观察回肠病理学改变,根据Chiu's评分进行评价;肠道组织中紧密连接蛋白-1(CLDN1, Claudin-1)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylated PERK, p-PERK)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(cysteinyl aspartate specific protease-12, Caspase-12)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP-homologous protein antibody, CHOP)的蛋白表达采用蛋白质免疫印迹试验检测;肠道组织中Claudin-1、p-PERK、CHOP、Caspase-12的阳性面积采用免疫组织化学法检测。结果:对比Sham组,CLP组大鼠血清中白介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α水平,Chiu's评分均升高(均 P<0.05);回肠黏膜组织中Claudin-1表达减少,ERS性凋亡相关蛋白p-PERK、CHOP、Caspase-12表达量均增加(均 P<0.05)。与CLP组相比,给予低、中、高剂量EGCG干预后大鼠肠道损伤均有所缓解(均 P<0.05)。EL组血清炎症因子水平、Chiu's评分和小肠组织中ERS性凋亡相关蛋白p-PERK、CHOP、Caspase-12的蛋白表达水平及阳性面积均较CLP组进一步降低,且EM组较EL组、EH组较EM组均进一步降低(均 P<0.05)。EL组小肠组织中Claudin-1蛋白表达水平及阳性面积均较CLP组进一步升高(均 P<0.05),且EM组较EL组、EH组较EM组均进一步升高(均 P<0.05)。 结论:EGCG可能通过抑制ERS性凋亡通路的活化对脓毒症大鼠肠道损伤起到一定的保护作用,且高剂量EGCG疗效更佳。
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编辑人员丨1周前
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缺血预处理对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制
编辑人员丨1周前
目的:探究缺血预处理(IP)对肾脏缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用。方法:将18只购自湖南斯莱克公司的雄性C57BL/6J小鼠完全随机分为假手术组(Sham),缺血再灌注组(I/R)和缺血预处理组(IP)3组,使用肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)和Paller评分来判断肾脏损伤程度,对IRI组和IP组进行转录组测序,对测序结果进行KEGG聚类分析和蛋白相互作用分析,并对结果进行定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证,采用 t检验进行两组间的比较。 结果:IP组损伤低于I/R组,IP组的SCr低于I/R组(141.6±15.38比193.10±10.55, t=6.185, P<0.01)、IP组BUN低于I/R组(39.44±2.44比54.96±6.54, t=4.957, P<0.01),以及Paller评分IP组低于I/R组(27.12±2.28比43.53±3.34, t=9.084, P<0.01)。测序结果示IP组比I/R组有1 560个差异基因,其中863个表达升高,697个降低。KEGG富集通路分析差异最大的为甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢通路,通过RT-qPCR和Western blot对测序结果进行验证,Western blot结果表明IP组氨基酸氨基转移酶(GATM)表达高于I/R组(0.421±0.280比0.186±0.023, t=9.188, P<0.01)。 结论:IP可能通过影响甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路中GATM的表达,进而减轻缺血再灌注损伤。
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编辑人员丨1周前
