目的:从基因学角度研究与探讨1例Rh null血型的形成机制，同时研究其家族成员的Rh血型基因。 方法:通过血型血清学检测泰州市人民医院内科就诊的先证者的Rh血型表型，采用荧光PCR法进行RhCE基因分型，采用桑格法进行RhD、RhCE及RhAG外显子测序，然后分析先证者的Rh null形成机制。作为对比，通过血型血清学检测先证者的姐姐和儿子的Rh血型表型，进行RhCE基因分型和RhD、RhCE、RhAG外显子测序。 结果:先证者的基因型结果为CcDEe，RhAG外显子测序结果为纯合型移码突变，突变位置在Exon 5，核苷酸改变为c.732delC，氨基酸改变为p.Phe245Serfs*16。先证者姐姐的血清学结果、基因分型和RhAG外显子测序结果及突变位置与先证者相同。其子的血清学结果为CCDee，基因型结果为CCDee，RhAG外显子测序结果为杂合型移码突变，与先证者一致。结论:分析发现RhAG基因新的变异位点；此位点使得患者RhAG蛋白表达不完整，进而影响其他Rh抗原在细胞膜上的表达，致血清学结果为Rh null。

采用转录组数据挖掘与实验验证相结合的研究策略,识别表征激素性股骨头坏死(SONFH)痰、瘀、虚证素的标志基因.首先,利用项目组前期临床转录组学检测所得SONFH痰瘀阻络证、经脉痹阻证、肝肾亏虚证共性差异表达基因集,整合差异表达趋势分析与功能挖掘,分别预测出表征痰、瘀、虚证素的候选标志基因集.再利用来源于临床SONFH患者的全血样本、SONFH大鼠的全血和受累股骨头组织样本,采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测上述候选标志基因的表达量;进一步,采用受试者工作特征曲线(ROC)法,客观评价上述候选标志基因的辨证效能.转录组数据分析结果显示,痰证素候选标志基因为超长链脂肪酸延伸酶6(ELOVL6),瘀证素候选标志基因为锚蛋白1(ANK1)、血型糖蛋白A/B(GYPA/B)、Rh相关糖蛋白(RHAG),虚证素候选标志基因为溶质载体家族2(促进葡萄糖转运体)成员1(SLC2A1)、胃口素(STOM).qPCR验证结果显示,与非SONFH组比较,ELOVL6在痰瘀阻络证患者外周血中的表达量最低(P＜0.05);与正常对照组比较,其在SONFH大鼠造模4周外周血和受累股骨头组织中的表达量最低(P＜0.01),且对大鼠造模4周的辨证效能(AUC=0.850,P=0.006)优于其他造模时间点(8、12、16、21 周 AUC 分别为 0.689、0.766、0.588、0.662).与非 SONFH 组比较,ANK1、GYPA、RHAG 均在经脉痹阻证患者外周血中表达最低(P＜0.05);与正常对照组比较,其在SONFH大鼠造模12周外周血和受累股骨头组织中的表达量最低(P＜0.05,P＜0.01),且对大鼠造模 12 周的辨证效能(ANK1:AUC=0.855,P=0.006;GYPA:AUC=0.861,P=0.012;RHAG:AUC=0.854,P=0.009)优于其他造模时间点(4、8、16、21 周,ANK1 的 AUC 分别为 0.630、0.658、0.657、0.585;GYPA 的 AUC 分别为 0.646、0.573、0.691、0.617;RHAG 的 AUC 分别为 0.592、0.511、0.515、0.536).与非 SONFH 组比较,SLC2A1和STOM均在肝肾亏虚证患者外周血中表达量最低(P＜0.05);与正常对照组比较,其在SONFH大鼠造模21周外周血和受累股骨头组织中的表达量最低(P＜0.05,STOM在大鼠外周血中表达量与正常对照组间的差异无统计学意义除外),且SLC2A1对大鼠造模21周的辨证效能(AUC=0.806,P=0.009)优于其他造模时间点(4、8、12、16周AUC分别为0.520、0.580、0.741、0.774),STOM的辨证效能无意义.综上,SONFH中痰证素的标志基因为ELOVL6,瘀证素的标志基因为ANK1、GYPA和RHAG,虚证素的标志基因为SLC2A1,有助于从基因水平揭示SONFH痰、瘀、虚证素的生物学内涵.

目的 研究RhD--缺失型患者的血型血清学及分子生物学,指导临床用血安全.方法 采用患者EDTA-K2 抗凝血,进行Rh血型系统常见抗原的检测及其相关血清学检测,同时提取患者DNA,利用SBT法对其RHCE基因和RHAG基因的外显子 1-10 进行测序.结果 患者血清学检测为O型RhD--,抗体鉴定 10 谱全阳性,RHCE基因测序表现为RHCE?02/RHCE?02,RHAG基因测序表现为 6 号外显子的 808 号位点G＞A和 861 号位点G＞A的突变.结论 当患者Rh血清学表现型缺失,在妊娠和或输血史等相关免疫情况下,可采取自体输血或血浆置换等方式满足患者的急救用血.

目的 通过mRNA异常剪接体外验证实验,即体外微基因剪接系统(minigene splicing assay,MSA),研究中国人群中发现的RHAG突变对于RHAG基因mRNA剪接的影响.方法 通过对KMxD数据库中RHAG基因数据的分析,选择 10 种中国人群中分布频率相对较高的位于RHAG基因剪接位点附近的突变或编码区域的同义突变,构建相应的RHAG外显子野生型及突变型pSplice POLR2G微基因表达质粒.转染HEK-293T细胞,48h后收集细胞提取总RNA,反转录后进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳检测和毛细管电泳检测,根据实验结果判断RHAG基因突变是否会影响相应外显子的正常剪接.结果 2 种RHAG基因剪接位点附近突变(c.158-5delT,c.807+3A＞C)轻微减弱了原剪接位点的剪接效率,其余 8 种突变(c.312G＞A,c.341+3G＞A,c.609C＞T,c.681G＞A,c.861G＞A,c.957T＞A,c.984T＞C和 c.1139-7G＞A)均不影响RHAG基因mRNA的剪接.结论 RHAG基因在剪接方面比较保守,剪接位点附近突变及编码区同义突变较少会引起RHAG基因异常剪接.

目的 分析研究2例D--表型患者的血清学和基因型的特征.方法 采用盐水法鉴定2位患者的ABO、Rh血型;采用盐水法和抗球蛋白法对样本进行抗体筛查和抗体鉴定;测序分析样本的RHCE、RHD及RHAG的外显子序列.结果 2位患者血型均为B型D--,抗体筛查阳性,血清中存在抗-Hro.患者1的RHGE基因型为RHCE-D(3-7)-CE,患者2的RHCE基因型为RHCE-D(3-8)-CE.结论 2例D--表型形成的分子机制与RHCE基因和RHD基因之间的基因重组有关;D--表型易产生抗-Hro.

目的 总结1例罕见Rhnull综合征患者的血型鉴定方法和输血策略,为该类患者的输血和检验积累资料、提供参考.方法 采用血清学试验检测该患者ABO、RhCcDEe血型抗原和血型不规则抗体,家系调查患者3代ABO、RhCcDEe血型抗原,荧光PCR对该患者及其家族中疑似Rhnull者行基因分型和RHD、RHCE、RHAG基因测序;凝胶卡法交叉配血;探讨患者临床输血方案,确保输血安全.结果 患者及其姐姐均为RHAG序列中534G缺失(外显子4)导致的Rhnull regular(调节型),RH基因型均为CCDee,ABO血型均为A型;患者血液与A、RhCCDee的献血者血液交叉配血,主次侧均相合;患者未行输血治疗.结论 Rhnull血型鉴定,血型血清学方法结合家系调查可做出初步判断,分子生物学技术可进一步准确判断.Rhnull血型临床输血在参考《临床输血技术规范》和《特殊情况紧急抢救输血推荐方案》中对RhD抗原阴性患者输血规定和推荐方案基础上,应尽可能对RhCcEe匹配输注,并监测患者输血后血型不规则抗体,尤其是有生育需求的女性.

Rh血型系统(ISBT004)包含RHD和RHCE两个同源连锁基因,分别编码D抗原和CcEe抗原,是最重要的红细胞血型系统之一.RHAG血型系统(ISBT030)由RHAG基因编码Rh相关蛋白RhAG,RhAG蛋白对RhD/CE抗原在红细胞膜上的正确连接定位十分重要[1].RHAG基因变异可导致Rh血型抗原显著减少,称为Rhmod[2].我们通过1例由于RHAG新复合杂合突变导致的Rhmod家系进行血清学与基因检测,并采用生物信息学方法和蛋白结构模型,初步探讨这例新的复合突变导致Rhmod型的分子基础.

目的 收集患者做RHD基因分型检测,(C、c、E和e)表型检测,分析医院64例RhD阴性患者不同RHD基因型和表型的分布特征.方法 用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法对血清学检测为RhD阴性患者RHD基因进行基因分型;用IgM抗-e、抗-c、抗-C与抗-E标准血清鉴定Rh表型.结果 检测发现RHD缺失型42例,以ccee表型(88.1％)为主;RHD1227A 型9例,以 Ccee 表型(77.8％)为主;RHD-CE(3-9)-D2型8例,以 Ccee 表型(75％)为主;RHD-CE(3-10)-D2型1例,为Ccee表型;RHD* 711delC型1例,RHAG位点无效型1例.用此聚合酶链式反应(荧光PCR)法无法判断分型结果2例.结论 医院检测为RhD阴性的患者通过RHD基因型检测表现为多样性,大部分为RHD缺失型,其次为 RHD 1227A 型、RHD-CE(3-9)-D2型、RHD-CE(3-10)-D2型、RHD*711delC 型和 RHAG 位点缺失型.