目的:探讨热休克蛋白90（Hsp90）抑制剂PU-H71联合X射线照射对辐射抗性人宫颈癌细胞的作用。方法:利用生物信息学分析 Hsp90基因在宫颈癌组织和癌旁组织中的表达。通过分次照射法（2 Gy/次，共30次）获得辐射抗性的宫颈癌细胞系HeLa RR和SiHa RR，将细胞分为对照组（二甲基亚砜处理）、单纯照射组、PU-H71组（0.5 μmol/L PU-H71处理）、PU-H71+照射组（0.5 μmol/L PU-H71处理24 h后给予照射）。利用克隆形成法检测细胞存活。细胞处理后1、6、24 h，用免疫荧光法检测γH2AX聚焦点。细胞处理后1、2、6、12、24 h，利用蛋白质印迹法检测Rad51的表达；细胞处理后2 h，检测磷酸化的DNA依赖蛋白激酶催化亚基（p-DNA-PKcs）的蛋白质表达。细胞处理后48 h，流式细胞术检测细胞凋亡。 结果:PU-H71增强了辐射抗性宫颈癌细胞对X射线的敏感性。与单纯照射组相比，PU-H71+照射组HeLa RR和SiHa RR细胞，在10%存活下的辐射增敏比（SER）分别为1.36和1.27，而凋亡率分别提高了约72.1%和63.1%。PU-H71使辐射诱导的γH2AX聚焦点的持续时间延长，抑制了DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）的磷酸化，从而限制非同源末端连接（NHEJ）修复，同时延迟了同源重组修复。结论:PU-H71通过抑制DNA双链断裂修复途径，增加了辐射抗性宫颈癌细胞的辐射敏感性，有望作为一种增强宫颈癌放射治疗疗效的放射增敏剂。

目的:探究miR-375-3p调控结直肠癌细胞放射敏感性的作用和机制。方法:在结直肠癌细胞HCT116及HT29中过表达miR-375-3p，利用CCK-8法检测细胞增殖能力，利用克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，利用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡，利用流式细胞术检测细胞周期分布。过表达miR-375-3p后，检测γ-H2AX foci形成点数量、同源重组(HR)及非同源性末端连接(NHEJ)修复效率，分析miR-375-3p表达对DNA双链断裂(DSBs)以及其修复效率的影响；利用生物信息学预测miR-375-3p在HR修复通路中的下游靶基因，利用双荧光素酶报告基因法进一步验证miR-375-3p表达对靶基因重组蛋白A (RAD51)表达调控作用。最后，利用荧光定量PCR技术检测经 60Co γ射线2、6 Gy照射后HCT116细胞miR-375-3p的表达量；抑制miR-375-3p表达，经0、1、2、4、6 Gy不同剂量照射后，分析miR-375-3p表达变化对结直肠癌细胞HCT116放射敏感性的影响。 结果:过表达miR-375-3p显著抑制了结直肠癌细胞HCT116及HT29的增殖及克隆形成能力，诱发其细胞凋亡、G 1期周期阻滞和DSBs损伤，下调了Rad51表达，显著降低了HR修复效率[miR-375-3p(3.55 ± 0.30)%，miR-nc(1.97 ± 0.15)%； t＝10.055， P<0.05]；双荧光素酶报告基因实验显示miR-375-3p能够靶向Rad51 3′UTR区域结合( t＝5.013， P<0.05)；电离辐射能诱导miR-375-3p表达，抑制其表达显著降低了结直肠癌细胞放射敏感性( t＝6.460、5.619、10.150， P<0.05)。 结论:miR-375-3p能够靶向抑制Rad51表达，下调DSBs的HR修复效率，增强结直肠癌细胞的放射敏感性。

目的:探究SUMO E3连接酶(zinc finger protein 451，ZNF451)介导非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞DNA损伤修复的功能及机制。方法:采用γ射线或依托泊苷处理A549细胞和HeLa细胞，CCK-8法检测细胞增殖活力，蛋白免疫印迹法检测蛋白表达量。DR-GFP质粒系统检测DNA损伤修复水平，免疫荧光法检测蛋白的空间定位。结果:依托泊苷抑制了ZNF451的表达并呈剂量及时间依赖性。30、50、80 μmol/L依托泊苷处理，敲低ZNF451后的A549和HeLa细胞增殖活力显著降低(A549： t ＝ 27.62、25.61、5.32, P<0.01；HeLa： t ＝ 30.77、21.28、4.18， P<0.01)。ZNF451在DNA损伤位点处募集并与γ-H2AX存在胞内共定位和内源性的相互作用，且在30、50、80 μmol/L依托泊苷处理的ZNF451敲低细胞中，γ-H2AX的表达水平显著增加(A549： t ＝ 6.12、10.67、4.68， P<0.01；HeLa： t ＝ 7.94、9.81、15.12， P<0.01)。敲低ZNF451的细胞非同源末端连接(NHEJ)修复效率降低( t ＝ 18.60， P<0.05)。在辐射和依托泊苷处理后，ZNF451与P53结合蛋白1(53BP1)和DNA损伤检查点介质1(MDC1)有明显的共定位。 结论:敲低ZNF451抑制A549和HeLa细胞增殖并诱导DNA损伤水平加剧。ZNF451可以募集至DNA损伤位点，通过与DNA损伤修复因子53BP1/MDC1共定位参与NHEJ修复。

DNA损伤引发细胞启动一系列DNA损伤应答(DNA damage response,DDR),包括DNA损伤修复、细胞周期检查点激活、细胞周期阻滞、各种细胞内信号转导途径的活化和细胞凋亡等.DNA损伤修复(DNA damage repair)是细胞维持基因组稳定性的重要机制,于2015年获得诺贝尔化学奖.DNA损伤修复途径主要包括:碱基切除修复(base-excision repair,BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)、错配修复(mismatch repair,MMR)、同源重组(homologous recombi-nation,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)等,分别在DNA单链断裂(sin-gle-strand break,SSB)或双链断裂(double-strand break,DSB)等损伤修复中发挥重要作用.DNA损伤修复缺陷与肿瘤发生发展密切相关,同时也是肿瘤治疗的重要靶点.DNA损伤修复通路的多聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase,PARP)与乳腺癌易感基因BRCA1/2等存在合成致死(synthetic lethality)作用,使PARP抑制剂(PARP inhibitor,PARPi)成为第一个也是目前唯一上市的肿瘤治疗合成致死靶药.PARPi在卵巢癌及多种实体瘤治疗中疗效良好,使DNA损伤修复及相关DDR通路的合成致死靶药研发成为热点,其他在研靶点主要包括:共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia-mutated protein,ATM)、共济失调毛细血管扩张与 RAD3 相关蛋白(ataxia telangiectasia and Rad3 related protein,ATR)、DNA 依赖性蛋白质激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)、细胞周期检测点激酶 1(checkpoint kinase1,CHK1)、细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2,CHK2)、阻止有丝分裂的蛋白质激酶WEE1等.PARPi与其他DDR靶药、抗血管生成药物及免疫检查点抑制剂的联用,有可能成为克服PARPi耐药、提高疗效的有效手段和发展前景.本文针对DNA损伤修复及相关DDR通路的关键分子和潜在肿瘤治疗靶点进行综述,阐述了 DNA损伤修复相关通路的合成致死靶点研究及在卵巢癌的应用和前景,为基础研究及临床应用提供指导.

目的:探索硫醇乙酰基转移酶MshD对结核分枝杆菌在体外生长、应对压力刺激和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响.方法:利用CRISPR-NHEJ基因编辑技术,构建结核分枝杆菌mshD基因敲除株(ΔmshD株)和回补株(ΔmshD∷mshD株).分别检测H37Rv野生株(WT)、ΔmshD株和ΔmshD∷mshD株在液体培养基和固体培养基中的生长情况,以及外源添加L-半胱氨酸和过氧化氢酶对菌株生长的影响;检测3种菌株对不同刺激剂如H2O2、二硫苏糖醇(DTT)、十二烷基硫酸钠(SDS)的敏感性,以及外源添加过氧化氢酶对压力条件处理后菌株的恢复情况;采用流式细胞术检测SDS处理3种菌株前后菌株的ROS水平.结果:与WT和ΔmshD∷mshD株相比,ΔmshD株在固体平板上的生长较为缓慢,外源添加过氧化氢酶可以恢复其生长趋势;ΔmshD 株应对 DTT[WT(6.96±2.02)％,ΔmshD(0.02±0.00)％,ΔmshD∷mshD(6.64±0.77)％;F=29.700,P＜0.001],H2O2[WT(0.23±0.06)％,ΔmshD(0.01±0.00)％,ΔmshD∷mshD(0.26±0.06)％;F=25.520,P=0.001]和 SDS[WT(0.12±0.03)％,ΔmshD(0.01±0.00)％,ΔmshD∷mshD(0.18±0.04)％;F=19.540,P=0.002]刺激的存活率更低,差异均有统计学意义;外源添加过氧化氢酶可以恢复其存活率.ΔmsshD株自身ROS水平高于 WT(WT:95.100±2.553,ΔmshD:106.000±4.000,Δmsh∷mshD:94.667±3.055;F=11.650,P=0.009),SDS 处理 ΔmshD 株的自身 ROS 水平进一步升高(WT:436.000±8.000,ΔmshD:533.667±4.726,ΔmshD∷mshD:441.333±2.517;F=292.900,P＜0.001),差异均有统计学意义.结论:mshD基因缺失在固体培养基中生长减慢,mshD基因协助结核分枝杆菌抵抗各种应激压力,ΔmshD菌株内源性ROS水平增加.外源添加过氧化氢酶可一定程度恢复mshD基因敲除株生长和存活缺陷.

机体在体内因素如DNA碱基错配、自身不稳定性、机体代谢产生活性氧自由基(ROS)等,体外因素如辐射、化学毒物、药物、病毒和霉菌等作用下,可以造成DNA损伤. DNA损伤有碱基损伤、错配、DNA单链或双链断裂、嘧啶二聚体形成等多种类型. 其中,DNA双链断裂(DSB)是一种非常严重的损伤类型.

目的:探究TMP对乳腺癌BT474 细胞增殖、细胞周期及其调控蛋白表达与DNA双链断裂修复通路的相关性.方法:CCK8 法测定TMP对乳腺癌BT474 细胞的增殖抑制情况;流式细胞术测定TMP对细胞周期的影响;单细胞凝胶电泳测定分析TMP对损伤后细胞DSBs累积情况的影响;Isce-I内切酶系统检测TMP对修复通路活性的影响;Western blotting检测DSBs修复通路相关染色体结合蛋白表达水平变化.结果:TMP通过使细胞阻滞在G1 期呈浓度依赖性抑制BT474 细胞增殖,显著减少体内由Zeocin导致的细胞拖尾DNA含量(P<0.05);TMP显著增加BT474 细胞对RAD52、ERCC1、XRCC4 以及DNA LigⅣ蛋白募集,减少对KU80 蛋白募集,促进了SSA以及NHEJ通路修复活性(P<0.05).结论:TMP通过阻滞BT474 细胞停留在G1 期使其发挥增殖抑制作用的机制之一;TMP通过增强损伤缺口对各个通路的关键染色体结合蛋白募集,促进SSA与NHEJ修复通路活性从而减少DNA损伤.

目的 探讨Akt1增强胶质瘤放、化疗抵抗的机制.方法 通过免疫荧光实验检测正常星形细胞和4种恶性胶质瘤细胞(U87、U251、SF767以及U373)中泛素结合酶E2S(UBE2S)的表达情况;通过Western blot实验检测PTEN基因突变型和野生型胶质瘤细胞中UBE2S的表达差异;构建激活型Akt1载体,分别与UBE2S野生型或T152位点突变型载体共表达,观察PTEN/Akt信号通路对UBE2S的作用,以及UBE2S过表达后对非同源末端连接复合物的影响;采用流式细胞仪检测稳定敲低UBE2S的U87胶质瘤细胞对放、化疗的敏感性.结果 与正常星形细胞相比,胶质瘤细胞高表达UBE2S蛋白;PTEN突变型的胶质瘤细胞UBE2S的表达较野生型更稳定.构建激活型Akt1磷酸化UBE2S的T152位点,可促进UBE2S的稳定表达.UBE2S与Ku70、Ku80相互作用能促进Ku70的表达(P =0.009).免疫印迹结果显示,敲低UBE2S的表达后,Ku70、Ku80和DNA-PKcs的表达量显著降低(P＜0.001).流式细胞检测结果显示,UBE2S敲低可增强胶质瘤对放、化疗的敏感性(P＜0.001).结论 UBE2S在恶性胶质瘤中高表达;Akt1可磷酸化UBE2S的T152位点,从而增强UBE2S的稳定性;敲低UBE2S能降低非同源末端连接复合物介导的DNA修复效率,从而增强胶质瘤细胞对放、化疗的敏感性.

Germline copy number variation (CNV) is considered to be an important form of human genetic polymorphisms.Previous studies have identified amounts of CNVs in human genome by advanced technologies,such as comparative genomic hybridization,single nucleotide genotyping,and high-throughput sequencing.CNV is speculated to be derived from multiple mechanisms,such as nonallelic homologous recombination (NAHR) and nonhomologous end-joining (NHEJ).CNVs cover a much larger genome scale than single nucleotide polymorphisms (SNPs),and may alter gene expression levels by means of gene dosage,gene fusion,gene disruption,and long-range regulation effects,thus affecting individual phenotypes and playing crucial roles in human pathogenesis.The number of studies linking CNVs with common complex diseases has increased dramatically in recent years.Here,we provide a comprehensive review of the current understanding ofgermline CNVs,and summarize the association ofgermline CNVs with the susceptibility to a wide variety of human diseases that were identified in recent years.We also propose potential issues that should be addressed in future studies.

目的 识别鉴定 γ 射线照射细胞外泌体中放射诱导表达的miRNA分子,为揭示放射损伤旁效应机制提供新的线索.方法 60 Coγ 射线照射人支气管上皮细胞BEP2D,超高速离心法分别从2 Gy照射细胞和对照细胞的培养液上清中收集外泌体,用电子显微镜鉴定外泌体,miRNA芯片杂交检测分析外泌体中miRNA表达谱,qRT-PCR方法验证部分miRNA的表达变化,通过TargetScan、miRanda、GO和KEGG等生物信息学技术分析预测靶基因及其相关功能通路.结果BEP2D细胞2 Gy照射后4 h的外泌体中miRNA表达与对照组相比,共鉴定了16个表达水平显著上调的miRNA分子(P<0.05),对其中miR-100-5p、miR-1246、miR-29b-3p、miR-7-5p在外泌体中表达上调通过定量RT-PCR得到进一步的验证.同时,还分析了上述4个miRNA在受照细胞内的表达变化,结果显示除miR-7-5p外其余3个miRNA分子在照射后2 h表达上升,4 h时后均显著降低,而此时外泌体中相应miRNA的表达是显著增加的.生物信息学分析结果表明,这些miRNA可能通过调控细胞粘附、 蛋白磷酸化修饰、mTOR信号通路、 染色质修饰以及DNA损伤的HR和NHEJ修复等信号通路来参与细胞辐射旁效应过程.结论 鉴定了辐射诱导 BEP2D 细胞外泌体中差异表达 miRNAs 分子,这些 miRNA 的靶基因参与细胞重要的生物学过程和功能信号通路,为揭示辐射诱导旁效应的机制提供了新的线索.