目的:建立活的非可培养（VBNC）状态高产乙醇肺炎克雷伯菌的绝对定量方法。方法:诱导高产乙醇肺炎克雷伯菌进入VBNC状态，评价乙醇产量。建立PMA-ddPCR方法通过单拷贝基因来计数高产乙醇肺炎克雷伯菌VBNC状态的活细胞基因拷贝数。进一步在VBNC状态粪便模拟中，评价ddPCR对低浓度样品检测的灵敏度和适应性。结果:对高产乙醇肺炎克雷伯菌梯度稀释液进行定量时ddPCR的检测下限是qPCR的10倍。在低温、低营养状态，高产乙醇肺炎克雷伯菌第45天进入VBNC状态，通过PMA-ddPCR对VBNC状态细胞进行定量结果为（5.46±0.05）log 10 DNA 拷贝数/ml。VBNC状态的乙醇产量为<2.2 mmol/L，复苏后恢复产乙醇能力。VBNC状态粪便模拟样品中ddPCR最低检测下限为3.2 log 10 DNA拷贝数/ml。 结论:建立VBNC状态高产乙醇肺炎克雷伯菌的ddPCR检测方法灵敏度和适应性良好，可用于临床样品中VBNC状态细胞的检测。

目的:微生物是降解磺胺类抗生素(sulfonamides,SAs)的主要驱动者,但在抗生素胁迫下易处于活的非可培养状态(viable but non-culturable,VBNC)而无法筛选得到;利用藤黄微球菌产生的复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)改善VBNC降解菌群的生长繁殖特性,提高废水的抗生素去除效果.方法:以磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine,SMZ)废水为处理对象,利用Rpf蛋白的复苏作用驯化SMZ废水处理系统内活性污泥中潜在的功能降解菌群.结果:当SMZ质量浓度为0.5mg/L时,投加Rpf蛋白后,SMZ的去除率提高了 9.38％;当SMZ质量浓度增加到20 mg/L时,SMZ的去除率提高了 17.10％;高通量测序结果表明,Rpf蛋白的投加主要促进了与SMZ降解相关的归属于变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)的unclassified_f_Comamonadaceae、OLB8、Shinella和Rhodococcus等在系统内的富集,进而提高了 SMZ去除效果.结论:首次利用Rpf强化微生物降解SMZ废水,为Rpf应用于其他磺胺类抗生素的去除提供了理论基础.

石油降解菌在各种有害环境因素作用下会进入活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态,从而影响其生长及石油降解率.为了研究有害环境因素对石油降解菌生长及石油降解率的影响,采用分光光度法、荧光染色-激光共聚焦显微镜观测 H2O2 胁迫下苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)JP1 细胞的生长及VBNC状态形成情况.结果表明,不同浓度H2O2 对其生长有一定抑制作用,当培养液中H2O2 浓度为 75.0 mmol/L时,可有效抑制苍白杆菌JP1 生长,处理12h后苍白杆菌JP1 进入VBNC状态.VBNC状态的苍白杆菌JP1 细胞缩小变成球体,周质间隙增大;在适宜条件下,VBNC状态苍白杆菌JP1 能够复苏为可培养状态,添加丙酮酸钠能够促进VBNC状态细菌细胞的复苏.复苏后的苍白杆菌RJP1 具有良好的环境适应性和石油降解能力,为石油污染生物修复的菌种筛选及应用提供了新的策略.

[背景]副溶血性弧菌为冰鲜产品及肉制品中常见的污染微生物,致病性强,危害严重,出入境运输及加工的肉食品常采取冷冻冷藏的处理手段来防止微生物污染及生长,以保持食物新鲜.而残留的部分副溶血性弧菌会进入活的非可培养状态(Viable but non-culturable state,VBNC),从而构成潜在的风险隐患.[目的]建立可用于冷冻食品中VBNC副溶血性弧菌的快速检测方法,并探讨其适用性.[方法]将大西洋鲑鱼1:10匀浆,加入终浓度为6.6×105 CFU/mL的副溶血性弧菌,-20 ℃分别诱导10、20、30和50 d.建立实时荧光PCR技术(qPCR)方法,测定其特异性、灵敏度及稳定性.利用PMA-qPCR法对不同冷冻时期样品中的副溶血性弧菌进行检测,同时与qPCR、平板培养法进行比较.[结果]建立的qPCR方法特异性好,与其他阴性参考株无交叉反应;灵敏度高,检测限为19.8CFU/mL;重复性好,Cq值的变异系数(CV)均在1.5％以下;标准曲线为y=-3.272x+45.310,线性回归系数R2为0.996,定量范围为1×102-1×109 CFU/mL.在低温诱导10-50 d后,qPCR法的Cq值在26.32-27.34之间,与诱导前相比几乎没有变化;叠氮溴化丙锭(PMA)-qPCR法的Cq值则从诱导前的26.43逐步上升到38.84,呈现明显的上升趋势,表明死菌的数量在显著上升.经过比较及统计,PMA-qPCR检测的活菌数均高于平板培养法测出的数量,差异显著(P＜0.05).[结论]PMA-qPCR特异性及灵敏度高,能有效抑制对死菌的扩增,同时能克服传统平板培养法对VBNC的漏检缺陷,可方便、快捷地用于冷冻食品中受损致病微生物,尤其是进入VBNC状态的细菌检测.

99％以上的微生物因处于活的但非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态而无法分离培养.复苏促进因子(resuscitation-promoting factors,Rpfs)是培养获取VBNC菌的最重要突破.结合课题组近十余年从环境功能视角利用Rpf复苏培养VBNC菌的研究,本文在阐述微生物VBNC状态的形成及复苏进展的基础上,从VBNC菌形成及复苏过程出发,探究“探索因子”与群体感应的内在关系.并总结了课题组利用Rpf所复苏培养的具有潜在环境功能的VBNC菌种.本论文将为揭示微生物VBNC状态的形成及复苏机制提供新的思路,并为认识和重新评价Rpf法复苏培养VBNC菌在污染环境微生物修复中的作用提供理论依据.

探讨鼠伤寒沙门氏菌oxyR基因缺失株引起的VBNC状态及其与群体感应的关系.运用同源重组的方法构建oxyR基因无痕缺失的鼠伤寒沙门氏菌并检测该菌株对H2 O2的敏感性;将oxyR基因缺失株和亲本株(WT)涂布或滴于LB固体培养基,观察其是否生长及其浓度依赖性生长情况;用swimming和swarming平板检测oxyR基因缺失株和WT的运动能力;检测固体培养基和液体培养基中沙门氏菌分解H2 O2的能力.成功构建了oxyR无痕缺失菌株;oxyR基因缺失株在0.1 mmol/L H2 O2的LB平板上形成的菌苔发生了变形,在1 mmol/L H2 O2的LB平板上不能生长,而WT均能生长;6×106和6×105 CFU的WT涂布于LB平板上能长满菌苔,而等量的oxyR缺失株不能生长菌落;不同浓度的WT滴于LB平板均能形成菌苔,而oxyR缺失株仅在OD600≥10-1浓度时才能形成菌苔;oxyR缺失株泳动距离无显著性变化,而群集运动距离显著性大于WT;固体培养的沙门氏菌比液体培养的沙门氏菌有更强的分解H2 O2的能力.鼠伤寒沙门氏菌的群体感应系统通过调控其群集运动和H2 O2分解能力来复苏由oxyR基因缺失引起的VBNC状态.

目的 探讨瘢痕子宫再次妊娠后如何决定分娩方式.方法 2011年6月至2015年6月云南省昭通市第一人民医院收治434例瘢痕子宫再次妊娠孕妇,对其如何决定分娩方式及母儿结局进行回顾性分析.把同期随机132例非瘢痕性子宫经阴道分娩(VBNC)与瘢痕子宫再次妊娠经阴道分娩(VBAC)132例及重复剖宫产(RCS)302例进行对照分析;同期随机首次剖宫产(PCS)302例与重复剖宫产(RCS)302例进行对照分析.结果 132例阴道试产,100例试产成功,成功率75.76％;RCS334例,手术产率76.96％.瘢痕子宫再次妊娠阴道分娩(VBAC)组产后出血率、 子宫先兆破裂发生率、 新生儿出生Apgar评分与非瘢痕性子宫经阴道分娩(VBNC)组相比较,无明显统计学差异(P>0.05);VBAC组产时出血量、 住院时间、 住院费用及产后出血率均低于RCS组[(170.5±20.)vs(205.7±5.0)mL]、[(3.5±0.5)vs(6.5±0.5)d、[(2321.0±125.0)vs(4943.0±196.3)元、10.0％vs.18.7％)(P均<0.05);RCS组产后出血率(18.7％)较PCS组(3.3％)高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 瘢痕子宫再次妊娠后可选择性进行阴道分娩,条件是分娩前充分评估,临产后严密监护,做好急诊剖宫产准备.

有活力但不可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态是细菌遭遇逆境时进入的一种特殊状态,该状态下的菌体在条件适宜时可复苏并恢复其致病性,被认为是细菌躲避不良环境的一种生存策略.VBNC状态菌体对人类医学和工农业生产具有巨大的潜在威胁,开展关于VBNC状态的检测及诱导、复苏及其机制研究可为减少或避免该状态细菌的危害提供理论基础.本文简要综述了细菌VBNC状态在诱导、复苏及致病性等方面的研究进展,并结合本实验室及国内外相关团队近年来在植物病原细菌VBNC状态研究中的结果,详细总结了VBNC状态细菌的形成和复苏机制,对植物病原细菌在环境胁迫下的存活机制、病害田间初侵染来源分析及VBNC状态菌体在病害循环中的作用等相关研究具有重要参考意义.

[目的]解析广西蚕沙中细菌群落组成与多样性,为蚕沙中菌种资源发掘和蚕沙的综合利用提供科学依据.[方法]通过高通量测序技术研究细菌群落组成特征,同时利用常规稀释涂布平板法和基于复苏促进因子(Rpf)的MPN培养系统解析并筛选蚕沙中可培养和活的非可培养(VBNC)状态的优势菌群,并经16S rRNA基因测序对筛选得到的菌株作初步分类鉴定.[结果]高通量测序表明,广西蚕沙样品中细菌归属于10个门、18个纲、27个目、57个科、96个属,其中4个属的丰度达1％以上,优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)肠杆菌属(Enterobacter);通过稀释涂布平板法共获得14个属的33株可培养细菌,其中4个属(Citrobacter、Weissella、Chitinophaga、Pseudoclavibacter)在高通量测序中未被检测到;而在MPN培养系统中,基于复苏促进因子的处理组细菌总数最大检出丰度提高了100倍,并从中共检出21株对Rpf敏感的VBNC菌株,其中6个属(Paenibacillus、Caulobacter、Roseomonas、Pantoea、Erwinia、Acinetobacter)为传统分离法中未能获得的菌属,2个属(Paenibacillus和Caulobacter)在高通量测序中未被检测到.[结论]蚕沙细菌多样性丰富,不同方法解析蚕沙细菌组成多样性存在一定差异,而且通过添加Rpf首次发现了蚕沙中存在大量过去未被认知的VBNC状态细菌,其中从16S rRNA基因序列同源性推测有3个VBNC菌株为潜在新种.此研究结果为深入挖掘蚕沙中微生物资源提供了新的视角与途径,为蚕沙的综合处理提供了研究基础.

[背景]乳杆菌属是发酵食品中最常见的微生物之一,与食品的品质和安全密切相关,定量检测乳杆菌活菌数、解析乳杆菌群落组成对发酵乃至肠道微生物等具有重要意义.[目的]建立一种在种水平上定量检测5种乳杆菌活菌数的叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR(propidium monoazide-quantitative PCR,PMA-qPCR)检测方法并探讨其适用性.[方法]以植物乳杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌等发酵食品中常见的5种乳杆菌为目标菌株,查找并筛选特异性引物用于荧光定量PCR(qPCR)检测,优化叠氮溴化丙锭(PMA)处理条件,测定PMA-qPCR检测法的特异性、灵敏度及可靠性.最后利用PMA-qPCR法检测黄酒酿造过程中5种乳杆菌的活菌数.[结果]PMA最佳处理条件为:浓度20μmol/L下暗处理15min后曝光15min,此时可抑制样品中99.89％的死菌DNA扩增.该方法特异性高,能够准确识别5种乳杆菌;线性关系强,R2＞0.98;灵敏度高,检测限为101.8-103.2CFU/mL;重复性好,Cq值变异系数小于1％;与平板计数相比差异不显著(统计学上),P＞0.05.利用该方法检测黄酒中5种乳杆菌的活菌数,发现发酵乳杆菌、干酪乳杆菌和短乳杆菌是主要的乳杆菌(总计占比59％-89％),与已知黄酒酿造中乳杆菌群落组成相符.[结论]建立的PMA-qPCR法能够快速、准确地检测5种乳杆菌的活菌数,为解析样品中乳杆菌的实时组成及检测具有活性但不可培养(viable but nonculturable,VBNC)状态的乳杆菌提供了可靠的手段.