T-DNA突变体是研究基因功能的重要资源.高效热不对称交错PCR (hiTAIL-PCR)是克隆突变体中T-DNA插入位点侧翼序列的常用方法.然而我们发现,利用hiTAIL-PCR克隆到的一些侧翼序列并不对应于宿主的染色体DNA序列,而是质粒的骨架DNA片段.通过设置1组RB-S4/AC1或者LB-A4/AC1对照反应,用PCR方法鉴定了hiTAIL-PCR扩增产物中位于T-DNA侧翼的质粒骨架片段.在后续分析中,通过排除这些片段,提高了利用hiTAIL-PCR获得宿主染色体DNA片段的效率.同时,通过调整反应程序,使得整个PCR的反应时间也大为缩短.在拟南芥(Arabidopsis thaliana) T-DNA突变体drf1侧翼序列的克隆实例中,对照反应的引入将hiTAIL-PCR中需鉴定的22条扩增产物降至4条,效率提高了81.8％.

为研究睡美人(Sleeping Beauty,SB)转座子系统在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾脏细胞(CIK)中介导的整合特性,构建了SB转座子和转座酶在两个质粒的二元反式(trans)转座子系统,以及转座子和转座酶元件在同一个质粒的一元顺式(cis)转座子系统;通过转染CIK细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR分析了转染2d后及嘌呤霉素筛选4周后的细胞,测定DsRed转染效率和整合效率,并结合高效热不对称交互式PCR扩增获得SB转座子整合位点的序列.结果表明, SB二元转座子系统的整合效率远高于一元系统; SB转座子与转座酶比例为1:2时,外源基因DsRed的整合效率最高;SB转座子偏向于插入草鱼基因组TA序列处.研究表明优化SB转座子和转座酶的比例能提高外源基因在草鱼细胞中的整合效率并快速获得突变细胞, 同时为在鱼类细胞中采用SB转座子建立突变体文库提供理论基础.

目的:研究抗虫抗草甘膦玉米转化体ZD12-6外源基因的分子特征,对ZD12-6的抗虫和抗草甘膦性状进行综合评价,为ZD12-6产业化提供基础信息.创新点:抗虫抗草甘膦转基因玉米ZD12-6是聚合了双抗虫基因和抗草甘膦基因的转化体,多基因聚合有利于后期品种转育和多性状叠加.对该转化体的分子特征信息分析和功能评价是评判其产业化价值的重要依据.方法:利用DNA印迹法(Southern blot)研究外源基因插入拷贝数;利用高效热不对称交错聚合酶链反应(hiTAIL-PCR)方法对外源基因的插入位点进行定位;通过蛋白质印迹法(Western blot)对外源蛋白进行定性分析;利用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析外源蛋白表达量;通过生物测定对抗虫和草甘膦的抗性水平进行评估.结论:抗虫抗草甘膦玉米转化体ZD12-6中外源基因单拷贝插入,插入位点位于玉米1号染色体.ZD12-6对玉米上的主要害虫具有良好抗性,同时对草甘膦具有较强耐受性,具有产业化推广潜力.

利用hiTAIL-PCR(high efficient thermal asymmetric interlaced PCR)法扩增获得了转基因水稻BPL9K-2的外源基因插入位点的左旁侧序列450bp,与水稻参考基因组数据比对发现其左边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 765位核苷酸残基之后.根据水稻参考基因组序列和外源基因右边界序列,设计引物扩增得到485bp的特异片段,通过数据库比对发现其右边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 825位核苷酸残基之前.因为外源基因插入和非正常重组,水稻基因组上缺失了59个核苷酸.基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻BPL9K-2的事件特异性定性PCR检测方法,可以分别扩增到片段大小为449bp和485bp的特异条带.该方法特异性好,灵敏度高,能够在BPL9K-2基因组DNA相对含量为0.1％的模板中检测出转基因成分.依据旁侧序列,建立了快速鉴定转基因后代植株外源基因型的三引物PCR检测方法.这些方法的建立,为转基因水稻BPL9K-2的应用和检测提供了技术支持.

芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire)引起的黑斑病是十字花科蔬菜生产上的重要病害之一,在全球主产区都有报道.目前关于该病菌的致病机理的研究还较少.因此,查找和鉴定芸薹生链格孢致病相关基因,不仅有助于认识该类病原真菌致病的分子机制,还有助于发现病害防治新靶标.本研究从本实验室己构建的芸薹生链格孢转化子库中筛选得到了7株致病性缺陷的突变菌株.进一步利用HiTAIL-PCR技术对插入位点的侧翼序列进行了扩增,并通过生物学分析方法进行了初步分析.相关研究结果将有助于对芸薹生链格孢致病机理的认识,为发现病害防治新靶标提供理论基础.

获得药用植物虎杖(Polygonum cuspidatum)PcMYB1启动子,并分析其活性,为进一步研究虎杖转录因子PcMYB1的功能奠定基础.通过hiTAIL-PCR方法,从虎杖叶片基因组DNA中克隆PcMYB1启动子并进行生物信息学分析.分别构建由全长启动子或5'端缺失启动子驱动GUS的重组表达载体P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS和P4∷GUS.将重组表达载体转入发根农杆菌中进行虎杖毛状根转化试验,以转化的阳性毛状根为材料,通过GUS组织化学染色分析启动子的活性.成功获得2884 bp的PcMYB1启动子序列(GenBank登录号MT811057).该启动子具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,还含有茉莉酸甲酯和低温响应元件以及光响应、厌氧应答等相关的顺式调控元件.重组表达载体经PCR鉴定,证实已构建成功.转化的虎杖毛状根染色之后显蓝色,但同对照相比颜色较浅,说明全长启动子或5'端缺失启动子都具有驱动GUS的活性,但启动活性都比CaMV35S启动子的启动活性弱.PcMYB1的启动子被成功克隆,其具有驱动下游GUS表达的活性.

该研究以纤枝短月藓为材料,利用RT-PCR和HiTail PCR技术分别克隆得到纤枝短月藓LEA 5基因的ORF和启动子序列,并进行生物信息学、基因表达及耐盐性分析,为进一步研究LEA5蛋白的保护机制奠定基础.结果 显示:(1) LEA5基因包含267 bp的开放阅读框(ORF),编码88个氨基酸.(2)LEA5基因启动子序列为1053 bp,利用PlantCARE在线工具预测顺式作用元件显示,该启动子不仅具有典型的CAAT box元件,还含有ABRE、MYB、MYC、MYB结合位点(MBS)等其他元件.(3)荧光定量分析表明,LEA 5基因在纤枝短月藓不同时期和不同组织中都有表达.(4)LEA5蛋白的异源表达提高了大肠杆菌对盐胁迫的耐受性,表明LEA5蛋白可能在耐盐性中起重要作用.

为探究纤枝短月藓LEA2基因的结构和表达特征,该研究以纤枝短月藓为材料,首次利用PCR克隆技术得到纤枝短月藓BeLEA2基因序列,并对该基因进行分析.结果表明:(1)该基因序列中含有2个外显子和1个内含子,其开放阅读框(ORF)为456 bp,编码151个氨基酸,预测其相对分子质量为16515.96 Da.(2)将纤枝短月藓与其他植物LEA2基因氨基酸序列进行比对,构建系统进化树,结果显示纤枝短月藓与小立碗藓的亲缘关系最近.(3)利用HiTail-PCR技术克隆获得1072 bp的BeLEA2启动子序列,用PlantCARE在线工具对该启动子的顺式作用元件进行预测,结果表明该启动子除了含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有ABRE、MYB、MYC、MYB结合位点(MBS)等其他顺式元件.(4)实时荧光定量PCR分析表明,BeLEA2基因在纤枝短月藓不同发育时期和不同组织中都有表达,且对脱水胁迫有响应.以上结果为进一步探究LEA2基因在苔藓植物中的功能及作用机制奠定了基础.

生物转化反式茴脑生成的苯丙素类芳香物质被视为天然原料,能广泛应用于食品加工、香料生产及医药等领域.以能代谢反式茴脑的假单胞菌(Pseudomonas sp.)AT39为出发菌株,采用转座子(pTnMod?RKm')插入突变构建了含有6137个突变体的突变体库,筛选出44株反式茴脑代谢受影响的突变株.检测突变菌及野生菌的反式茴脑利用能力,发现突变菌AT39?15的反式茴脑代谢能力是野生菌的14％.利用hiTAIL?PCR技术对突变菌AT39?15转座子侧翼序列扩增,获得插入突变的基因,测序结果显示基因大小为1047 bp,基因序列与恶臭假单胞菌(Pseudomonas sp.)JYR?1的反式茴脑氧化酶基因(tao)一致性达100％.研究结果为下一步构建基因工程菌提供了基因资源.

晚期胚胎发育丰富蛋白(late embryogenesis abundant,LEA),广泛存在于生物体内,与植物抗逆性密切相关,可在干旱胁迫下保护植物细胞,减少植物损伤.垫状卷柏(Selaginella pulvinata)是一种在干旱胁迫下生存能力极强的蕨类植物,具有很强的恢复能力.为探究垫状卷柏SpLEA1基因在耐旱植物中的分子机制与表达特征,该研究以高耐旱性植物垫状卷柏为实验材料,基于转录组测序结果,采用RT-PCR技术获得SpLEA1基因cDNA序列,采用HiTail-PCR技术获得启动子序列,利用生物信息学对序列进行了分析,并采用qRT-PCR技术分析了SpLEA1基因在干旱胁迫下的表达模式.结果表明:(1)垫状卷柏SpLEA1全长为476 bp,开放阅读框(ORF)为279 bp,共编码92个氨基酸,通过在线工具预测到蛋白分子量为9491.46 Da,等电点为5.45,蛋白结构预测分析表明该蛋白为亲水性蛋白,含有10个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主.(2)预测到SpLEA1蛋白的保守结构域为Lea-5,来源于LEA1家族.基于系统发生树和遗传距离矩阵,发现垫状卷柏SpLEA1与来自鹰嘴豆(Cicer arietinum)和红车轴草(Trifolium pratense)的Lea-5蛋白同源性较高.(3)对启动子序列进行顺式作用元件的预测分析发现SpLEA1基因启动子含有5类激素响应元件和与干旱胁迫响应有关的功能元件.(4)在自然干旱处理下SpLEA1基因表达上调,并在12 h时达到峰值,在24 h干旱后进行复水处理,表达量显著下调.综上所述,SpLEA1基因在垫状卷柏中很可能参与了干旱胁迫响应机制的相关调控.该结果为进一步研究垫状卷柏SpLEA1基因在干旱胁迫下的功能及其表达调控机制提供了参考.