目的:探讨二甲双胍调控miR-340-5p/DEAD-box解旋酶17（DEAD-box helicase 17，DDX17）轴对高糖诱导成骨细胞增殖、凋亡的影响。方法:MC3T3-E1细胞分为对照组、高糖组、二甲双胍组、inhibitor NC组、miR-340-5p inhibitor组、二甲双胍+mimic NC组、二甲双胍+miR-340-5p mimic组，qRT-PCR检测miR-340-5p表达；Western blot检测DDX17、细胞周期素D1（Cyclin D1）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved aspartate-specific cysteine protease-3，Cleaved caspase-3）蛋白；CCK-8、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）染色检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡；荧光原位杂交实验、双荧光素酶分别验证miR-340-5p与DDX17的定位、靶向关系。结果:与对照组比较，高糖组miR-340-5p表达、细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达升高（ t=19.81，39.47，24.61，21.62， P均<0.001），OD 450值、EdU阳性细胞率及DDX17、Cyclin D1、PCNA蛋白表达降低（ t=7.624，30.100，26.54，19.46，21.20， P均<0.001）；与高糖组比较，二甲双胍组miR-340-5p表达、细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达降低（ t=13.37，28.55，18.35，18.78， P均<0.001），OD 450值、EdU阳性细胞率及DDX17、Cyclin D1、PCNA蛋白表达升高（ t=7.97，25.76，18.48，12.39，18.98， P均<0.001）；与高糖组、inhibitor NC组比较，miR-340-5p inhibitor组miR-340-5p表达、细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达降低（ F=85.92，301.11，142.64，170.35， P均<0.001），OD 450值、EdU阳性细胞率及DDX17、Cyclin D1、PCNA蛋白表达升高（ F=26.54，447.72，249.31，113.46，393.27， P均<0.001）；与二甲双胍组、二甲双胍+mimic NC组比较，二甲双胍+miR-340-5p mimic组miR-340-5p表达、细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达升高（ F=36.27，395.56，94.90，18.59， P均<0.001），OD 450值、EdU阳性细胞率及DDX17、Cyclin D1、PCNA蛋白表达降低（ F=21.44，128.47，24.28，25.89，18.06， P均<0.001）。miR-340-5p靶向调控DDX17表达，且二者共定位于细胞质中。 结论:二甲双胍通过下调miR-340-5p表达，上调DDX17表达进而促进高糖诱导的MC3T3-E1细胞增殖，抑制凋亡。

目的:阐释miR-340-5p对HBV复制的影响及其调控机制，并为HBV感染后的生物标志物和治疗用药提供新的策略。方法:在肝癌细胞HepG2.2.15中转染miR-340-5p的模拟物(340-mimic)和抑制剂(340-inhibitor)及其对应的阴性对照。通过ELISA检测上清中HBeAg和HBsAg的水平变化。同时收取细胞，提取RNA和壳体化DNA，并采用qRT-PCR分别检测HBV总RNA和pgRNA的水平及HBV DNA拷贝数的变化；分子克隆构建STAT3的过表达质粒pEF-flag-stat3，通过qRT-PCR和western blot对STAT3的mRNA和蛋白表达加以验证；此外，共转染miR-340-5p的模拟物和pEF-flag-stat3后通过northern blot，qPCR和ELISA对HBV的复制情况进行检测。结果:miR-340-5p过表达后，HBV转录生成总RNA和逆转录模板pgRNA的水平明显下降至对照组的45.89%、61.46% ( P＝0.001、 P＝0.003)；壳体化DNA的合成及HBeAg和HBsAg的分泌水平分别受到72.46%、18.27%、14.42%的抑制( P<0. 001、 P<0. 001、 P＝0.005)；干扰内源性miR-340-5p则与对照组相比分别增加44.02%、45.56%、22.66%、11.85%、14.04%( P＝0. 009、 P＝0. 01、 P＝0. 011、 P＝0.013、 P＝0.027)。相比之下在此基础上过表达信号转导和转录激活因子(STAT)3能够减弱被miR-340-5p抑制的HBV复制。进一步的实验结果也表明STAT3对HBV的复制有促进作用。 结论:miR-340-5p能够通过靶向作用于STAT3抑制其转录和翻译进而抑制HBV的复制。

目的:探索微小RNA(miR)-340-5p在胰腺导管腺癌细胞(PDAC)中表达及影响其生物学行为的机制。方法:实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测40例胰腺导管腺癌与正常细胞中miR-340-5p的表达，研究其表达水平与临床特征之间的联系。检测不同胰腺导管腺癌细胞及人胰腺导管上皮细胞中miR-340-5p水平。miR-340-5p模拟物转染PDAC细胞株PANC-1；甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性；划痕实验、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭迁移能力。RT-qPCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。双荧光素酶报告基因分析实验检测miR-340-5p对RhoA的调控功能。结果:PDAC组织中miR-340-5p水平低于正常胰腺组织(0.362 4±0.083 7、0.965 2±0.129 9， t＝21.272， P<0.01)；PDAC中miR-340-5p表达降低与胰腺癌淋巴结转移( χ2＝7.782， P<0.01)、肝转移( χ2＝17.109， P<0.01)有相关。双荧光素酶报告基因分析结果表明，野生型RhoA的荧光素酶活性在转染miR-340-5p模拟物后低于对照组(0.992 5±0.099 8比0.177 5±0.019 0， t＝18.496， P<0.01)。转染后，转染组细胞增殖活性降低(0.505 2±0.077 1比1.031 0±0.069 1、1.029 5±0.113 5， t＝38.012、7.637， P<0.01、迁移距离减少(0.753 3±0.050 1、0.725 0±0.071 5比0.338 3±0.087 7， t＝11.098、7.031， P<0.01)、迁移细胞数减少(57.000 0±4.290 0、52.666 7±5.785 0比19.833 3±2.994 0， P<0.01)。Western blot及RT-qPCR结果显示，与空白对照组(NC)及阴性对照组(Scramble)比较，miR-340-5p模拟物转染组N-cadherin(1.048 3±0.076 9、1.040 7±0.079 2比0.457 3±0.074 5， t＝11.800、11.585， P<0.01)、Vimentin(1.045 3±0.062 8、0.993 3±0.068 6比0.521 7±0.057 9， t＝10.982、9.585， P<0.05)、MMP-9(1.047 0±0.069 6、1.154 3±0.101 1比0.560 3±0.457 1， t＝32.803、18.559， P<0.01)表达显著降低，E-cadherin(1.053 3±0.100 3、0.987 7±0.083 4比1.976 0±0.154 2， t＝－29.502、－24.203， P<0.01)表达升高。 结论:胰腺导管腺癌中miR-340-5p表达降低，过表达miR-340-5p后能明显抑制PANC-1细胞的体外增殖和转移。其对RhoA信号通路介导的上皮-间充质转化(EMT)进程具有潜在抑制作用。

目的 探讨miR-340-5p靶向调控富含AT的相互作用结构域(ARID)1A对甲状腺癌活性、迁移和侵袭的影响.方法 通过实时荧光定-聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western印迹检测miR-340-5p和ARID1A在甲状腺癌细胞中表达水平.通过噻唑蓝(MTT)和Transwell实验检测转染miR-340-5p抑制物后癌细胞活性、迁移和侵袭变化.双荧光素酶报告基因检测miR-340-5p和ARID1A的靶向结合关系.最后通过同时敲低miR-340-5p和ARID1A的回复实验验证miR-340-5p调控ARID1A影响癌症发展.结果 miR-340-5p在甲状腺癌细胞中明显高表达,ARID1A表达明显较低(P＜0.05).通过抑制BC-PAP细胞中miR-340-5p表达明显减少了癌细胞活性、迁移和侵袭水平.miR-340-5p和ARID1A具有直接靶向结合关系.敲降ARID 1A能够明显逆转miR-340-5p抑制物对BCPAP细胞活性、迁移和侵袭的抑制作用.结论 miR-340-5p是甲状腺癌中的促癌基因,ARID1A为miR-340-5p的靶标下游,miR-340-5p通过靶向调控ARID 1A促进甲状腺癌细胞活性、迁移和侵袭.

目的:探讨miR-340-5p调控磷酸二酯酶4D（PDE4D）表达对胃癌细胞顺铂（DDP）耐药性的影响。方法:将胃癌细胞AGS连续暴露于0.1 ~ 1 μg/mL DDP中来构建耐DDP的胃癌细胞系AGS/DDP，1、3、5、7 μg/mL DDP处理AGS、AGS/DDP细胞，CCK-8检测细胞活力及IC50；qRT-PCR检测miR-340-5p表达量；Western blot检测PDE4D蛋白表达水平；验证miR-340-5p与PDE4D靶向关系；分别将miR-340-5p mimics、siRNA PDE4D转染于AGS/DDP细胞，miR-340-5p mimics和pcDNA-PDE4D共转染于AGS/DDP细胞，将转染成功的AGS/DDP细胞以及未转染AGS/DDP细胞分别用5 μg/mL DDP处理，观察AGS/DDP细胞增殖、迁移和侵袭变化。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。结果:与AGS细胞相比，AGS/DDP细胞在1、3、5、7 μg/mL DDP处理时的细胞活力升高，IC50值[（5.89 ± 0.27）比（1.46 ± 0.11）μg/mL]升高；与AGS细胞相比，AGS/ DDP细胞中miR- 340- 5p的表达（0.34 ± 0.17比1.00 ± 0.00）降低，而PDE4D蛋白水平（1.83 ± 0.11比0.25 ± 0.01）升高；PDE4D为miR-340-5p靶基因；过表达miR-340-5p或敲低PDE4D可抑制AGS/ DDP细胞增殖、迁移[（54.17 ± 4.12）比（26.00 ± 2.28）个、（55.00 ± 4.43）比（24.50 ± 2.07）个]与侵袭[（37.17 ± 3.19）比（19.33 ± 1.63）个、（38.33 ± 3.14）比（16.33 ± 1.63）个]；上调PDE4D表达可逆转过表达miR-340-5p对AGS/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用（P均< 0.05）。结论:miR-340- 5p通过靶向下调PDE4D表达抑制AGS/DDP细胞增殖、迁移和侵袭，降低其对DDP的耐药性。

在许多发展中国家,宫颈癌是女性癌症相关发病和死亡的主要原因.本文阐明了微小RNA(miRNA)在上皮-间充质转化(EMT)中的作用机制,并发现miRNA通过调控EMT在宫颈癌的转移侵袭和肿瘤耐药中发挥重要作用.miR-92a-3p、miR-21、miR-138等可以直接靶向EMT促进宫颈癌转移侵袭;miR-98-5p、miR-204-5p、miR-340等可以通过抑制EMT来抑制宫颈癌转移侵袭;miR-101-3p、miR-106b、miR-4677-3p等可通过内源性竞争机制影响EMT进而影响宫颈癌发生和进展.在宫颈癌肿瘤耐药性中,miR-25-3p可通过靶向Sema4C,将EMT逆转为间质表型上皮样转化,增强宫颈癌耐药细胞对顺铂的敏感性.靶向miRNA可能是一种新型治疗宫颈癌的方法.

目的 研究高脂与正常环境下大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)成骨分化过程中4种微RNA对蓬乱蛋白2的靶向调节作用及其对BMSC成骨分化的影响.方法 分别用普通(对照组)和高脂(高脂组)成骨诱导液培养BMSC,第3、5、7、14、21天实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)分析4种微RNA (micro RNA,miR) (miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p及miR-351-5p)、蓬乱蛋白2、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runt相关基因2(Runt-related transcription gene 2,Runx2)mRNA相对表达量,蛋白质印迹法分析蛋白表达;BMSC分别转染微RNA模拟物、抑制物和相应阴性对照(分别为模拟物组、抑制物组和相应阴性对照组),高脂成骨诱导后检测第1、3、5、7天ALP活性;第7天行ALP染色,蛋白质印迹法分析蓬乱蛋白2、ALP、Runx2的蛋白表达,qPCR分析蓬乱蛋白2 mRNA表达.构建蓬乱蛋白2野生型和突变型双荧光酶报告质粒,每种质粒分别与4种微RNA模拟物或相应阴性对照共转染293T细胞,检测荧光素酶活性.结果 成骨诱导各时间点高脂组BMSC的miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p及miR-351-5p相对表达量均较对照组高,第21天分别高20％、60％、340％、4420％ (P＜0.05).转染miR-21-5p、miR-29c-3p模拟物后BMSC蓬乱蛋白2、ALP、Runx2蛋白表达均降低;其中miR-29c-3p模拟物组蓬乱蛋白2比相应阴性对照组下降35％(P＜0.05),miR-29c-3p抑制物组蓬乱蛋白2比相应阴性对照组上调269％ (P＜0.05).共转染野生型质粒与miR-29c-3p模拟物后,293T细胞荧光素酶活性受到抑制,较相应阴性对照组下降60％(P＜0.05).结论 高脂环境下BMSC成骨分化受到抑制,miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p及miR-351-5p可能参与BMSC成骨分化调控;miR-29c-3p通过靶向调控蓬乱蛋白2表达而发挥抑制BMSC成骨分化的作用.

目的:观察长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)RP3-340N1.2在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:收集湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心2017年1月至2017年9月13例行乳腺癌根治术切除的癌组织及相应的癌旁组织标本,采用qRT-PCR检测13例乳腺癌组织及癌旁组织、乳腺癌细胞株和正常乳腺上皮细胞中RP3-340N1.2的表达差异.使用Lipofectamine 3000转染试剂分别将RP3-340N1.2质粒(实验组)和阴性对照质粒(对照组)转染至乳腺癌MCF-7细胞,CCK-8法和Transwell迁移实验检测RP3-340N1.2过表达对MCF-7细胞增殖、迁移能力的影响.qRT-PCR检测RP3-340N 1.2过表达对miR-134-5p和OPCML mRNA表达的影响,Western blotting检测OPCML相关蛋白的表达水平.结果:RP3-340N 1.2在乳腺癌组织中表达明显低于癌旁组织(P＜0.01),其在乳腺癌细胞株中表达水平明显低于正常乳腺上皮细胞(P＜0.01).上调RP3-340N1.2的表达抑制MCF-7细胞的增殖和迁移能力(均P＜0.05).过表达RP3-340N1.2后MCF-7细胞中miR-134-5p表达水平明显降低(P＜0.01)、OPCML mRNA和蛋白的表达水平升高(P＜0.01),而周期调控蛋白CDK4、Cyclin D2的表达水平下调,细胞迁移调控蛋白Vimentin和N-cadherin蛋白表达下调(均P＜0.01).结论:RP3-340N1.2在乳腺癌组织和细胞株中低表达,上调RP3-340N1.2的表达可引起miR-134-5p的表达降低、OPCML mRNA表达升高,从而抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力.

目的 检测结肠癌组织和癌旁正常肠黏膜组织中miR-340和细胞周期蛋白D1(CCND1)表达,探讨其与结肠癌临床病理特征和预后的关系.方法 选择2013年1月至2014年12月间接受结肠癌根治术的87例初治患者.采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测miR-340表达水平,采用免疫组化染色法检测CCND1蛋白表达水平.分析其表达与结肠癌临床病理特征(年龄、性别、肿瘤直径、临床分期、T分期、淋巴结转移、脉管侵犯、Ducks分期、肿瘤位置、分化程度等)的关系.采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,生存差异行Log-rank检验.结果 结肠癌组织中miR-340的表达水平为1.53±0.60,低于癌旁组织的2.75±0.62,差异有统计学意义(P＜0.05);结肠癌组织中CCND1蛋白阳性表达率为59.77％ (52/87),高于癌旁组织的41.38％ (36/87),差异有统计学意义(P＜0.05).结肠癌组织中miR-340表达和CCND1蛋白表达呈负相关性(r=-0.408,P＜0.001).miR-340表达与肿瘤直径、脉管侵犯、Ducks分期、临床分期、淋巴结转移有关(P＜0.05),CCND1表达与肿瘤直径、肿瘤位置、Ducks分期、临床分期有关(P＜0.05).87例结肠癌患者5年生存率为59.77％ (52/87).miR-340低表达者的5年生存率为47.73％(21/44),低于高表达者的72.09％(31/43),差异有统计学意义(P＜0.05).miR-340低表达+CCND1阳性表达者5年生存率为31.43％(11/35),低于非miR-340低表达+CCND1阳性表达者的78.85％ (41/52),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-340表达与肿瘤直径、脉管侵犯、Dukes分期、临床分期、淋巴结转移以及总生存有关,且与CCND1表达呈负相关;miR-340联合CCND1有望成为判断结肠癌患者预后的重要指标.

目的:研究miR-340-5p对喉癌Hep2细胞增殖的影响并探究其内在分子机制,为喉癌的诊断和治疗筛选潜在的生物标志物及靶点.方法:利用qRT-PCR对喉癌患者癌组织、癌旁组织、喉癌细胞株Hep2和正常支气管HBE细胞株中miR-340-5p表达进行定量分析;通过构建双荧光素酶报告载体验证STAT3是否为miR-340-5p潜在靶基因;利用脂质体转染miR-340-5p mimics/inhibitor于Hep2细胞中并通过qRT-PCR进行验证;分别利用CCK-8法、Annexin V/PI法对转染后的细胞进行细胞增殖、凋亡分析;利用Western Blot检测转染后STAT3及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达量.结果:qRT-PCR结果表明喉癌组织及Hep2细胞中miR-340-5p水平显著低于癌旁组织及HBE细胞,且过表达或抑制miR-340-5p后其表达量分别显著提高或降低;荧光素酶活性表明miR-340-5p直接与靶基因STAT3 3’-UTR相互作用,负调控其表达;细胞增殖、凋亡分析表明上调miR-340-5p可显著抑制Hep2细胞体外增殖并诱导其凋亡,反之亦然;Western Blot结果表明过表达miR-340-5p后Hep2细胞内STAT3及p-catenin、c-Myc、TCF-4、CyclinD1和ROCK1蛋白水平较对照组显著降低,反之亦然.结论:miR-340 5p在喉癌组织及Hep2细胞中异常低表达,其通过靶向STAT3基因负调控Wnt/β-catenin信号通路抑制喉癌病程,因此可作为喉癌诊断、治疗潜在生物学靶标.