成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种利用RNA指导核酸内切酶进行基因编辑的技术，具有操作简便、靶向精准、周期短、基因敲除效率高等特点，被广泛用于多个物种的基因编辑及疾病基因治疗中。目前，采用该技术已构建了多种眼科疾病动物模型，如角膜营养不良模型( UBIAD1、 TGF- β R124C基因突变)、青光眼模型( MYOC Y435H、 OPTN E50K和 PMEL基因突变)、白内障模型( GJA8、 KPNA4、 c- Maf、 AQP5和 PIKFYVE基因突变)、Leber先天性黑矇动物模型( KCNJ13和 LCA5基因突变)、视网膜母细胞瘤动物模型( RB1/ RBL基因突变)和视网膜色素变性动物模型( HKDC1、 C8ORF37、 CERKL、 PRCD、 ASRGL1、 LRAT和 PDE6B基因突变)等。还有研究者采用该基因编辑技术进一步证实了 MFRP、 CPAMD8、 Pax6和 FREM基因在动物眼部发育过程中的作用。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用进行综述。

目的:探讨靶向羧酸酯酶1f（Ces1f）基因敲减对脂多糖/D-半乳糖胺(LPS/D-GalN)诱导的急性肝衰竭小鼠枯否细胞（KC）极化活性的影响。方法:将携带靶向Ces1f干扰序列的小RNA（siRNA）与多肽转运载体（Endoporter）结合形成的复合物siRNA-EndoPorter包裹在β-1, 3-D葡聚糖壳中形成复合体颗粒(GeRPs)。将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、模型组（LPS/D-GalN）、预处理组(GeRPs)、预处理模型组（GeRPs+LPS/D-GalN）、空载体组（EndoPorter）。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹（western blot）技术检测各组小鼠肝组织Ces1f mRNA及蛋白表达水平；采用实时荧光定量PCR技术检测各组小鼠KC M1极化表型分化簇86（CD86）mRNA以及KC M2极化表型分化簇163（CD163）mRNA表达水平；采用免疫荧光双染技术检测KC中Ces1f蛋白以及M1/M2极化表型CD86/CD163蛋白表达情况；采用苏木精-伊红染色观察肝组织病理损伤情况。多组间均数比较采用单因素方差分析，或方差不齐时采用独立样本非参数秩和检验。结果:正常对照组与模型组、预处理组和预处理模型组肝组织Ces1f mRNA/蛋白相对表达水平分别为：1.00±0.00、0.80±0.03/0.80±0.14、0.56±0.08/0.52±0.13、0.26±0.05/0.29±0.13，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为9.171/3.957、20.740/9.315、34.530/13.830， P值均< 0.01）。正常对照组与模型组、预处理组和预处理模型组KC Ces1f阳性细胞百分比分别为91.42%±3.79%、73.85%±7.03%、48.70%±5.30%、25.68%±4.55%，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为6.333、15.400、23.700， P值均< 0.01）。正常对照组与模型组、预处理模型组CD86 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.00、2.01±0.04、4.17±0.14，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为33.800、106.500， P值均< 0.01）。正常对照组与模型组、预处理模型组CD163 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.00、0.85±0.01、0.65±0.01，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为23.360、55.350， P值均< 0.01）。正常对照组与模型组、预处理模型组（F4/80 +CD86 +）百分比和（F4/80 +CD163 +）百分比分别为10.67%±0.91%和12.60%±1.67%、20.02%±1.29%和8.04%±0.76%、43.67%±2.71%和5.43%±0.47%，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为11.130/8.379、39.250/13.190， P值均< 0.01）。正常对照组与模型组、预处理模型组肝损伤评分分别为0.22±0.08、1.32±0.36、2.17±0.26，各组间差异均有统计学意义（ F值分别为12.520、22.190， P值均< 0.01）。 结论:Ces1f可能是一个肝脏炎症抑制分子，其抑制效应的产生可能来自于该分子对KC极化表型稳态的维持。

目的:探讨PTEN诱导酶1（PTEN-induced putative kinase 1, Pink1）/帕金蛋白（parkin）通路在劳力型热射病（exertional heat stroke, EHS）大鼠急性肺损伤中的作用。方法:将60只SD大鼠随机分为4组，正常组（CON组）、正常Parkin过表达组（CON+Parkin组）、劳力型热射病组（EHS组）和劳力型热射病Parkin过表达组（EHS+Parkin组），每组大鼠15只。正常Parkin过表达组和EHS Parkin过表达组大鼠经尾静脉注射携带有Parkin基因的腺相关病毒0.15 μL。20 d后，建立EHS大鼠模型，绘制生存曲线。检测肺系数和肺毛细血管通透性；HE染色观察肺组织病理变化；ELISA方法检测肺组织中白介素（interleukin, IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）和活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）的含量；免疫组织化学观察肺组织凋亡；Western blot方法测定大鼠肺组织中Pink1、Parkin、泛素结合蛋白P62（Ubiquitin-binding protein p62）和微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3）的表达，并计算LC3-II/LC3-I比值。免疫荧光检测Pink1和Parkin共定位。单因素多水平组比较采用单因素方差分析，采用SNK-q法进一步进行组间两两比较。结果:与正常组相比，EHS组大鼠生存率降低（ P<0.001），肺系数和肺血管通透性均升高[（4.39±0.42）、（33.38±8.29）μg/g， P<0.05）]，肺组织发生渗出和实变，炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和ROS水平均显著升高[（34.31±5.34）pg/mL、（34.03±4.78）pg/mL、（91.64±8.16）pg/mL、（259.01±89.17）U/mg， P<0.05]，细胞凋亡增加。Western及免疫荧光结果显示，劳力型热射病大鼠Pink1、Parkin表达减少，Pink1和Parkin结合减弱，LC3-II/LC3-I比值降低，P62表达增加。与EHS组相比，EHS Parkin过表达组的大鼠生存率明显升高（ P<0.05），肺系数和肺血管通透性均降低[（3.83±0.62）、（22.49±7.90）μg/g， P<0.05]，渗出和实变等病理改变明显减轻，上述炎症因子和ROS水平均显著降低[（14.09±3.24）pg/mL、（26.94±2.11）pg/mL、（63.35±11.62）pg/mL、（161.13±26.31）U/mg， P<0.05]；肺组织凋亡减轻。肺组织中Parkin表达和LC3-II/LC3-I比值均升高( P<0.05)，Pink1和Parkin的结合增强，P62表达减低( P<0.05)，而Pink1表达差异无统计学意义（q=0.75）。正常组和正常Parkin过表达组之间差异无统计学意义（q=0.95）。 结论:激活Pink1/Parkin通路，增强线粒体自噬可减轻劳力型热射病大鼠急性肺损伤。

目的:基于上海市双生子人群，探讨胰岛素抵抗（IR）与全基因组DNA甲基化之间的关联。方法:于2012-2013、2017-2018和2022-2023年招募上海市成年同卵双生子（MZ）作为研究对象，通过问卷调查、体格测量和实验室检测收集相关信息，进行甲基化检测，采用广义线性混合效应模型分析单个位点DNA甲基化水平与稳态模型2胰岛素抵抗指数（HOMA2-IR）之间的关联，并采用非配对和配对设计分析DNA甲基化水平与IR表型之间的关联，对筛选出的阳性位点进行聚类分析得到位点簇，通过广义线性回归评估甲基化模式。结果:本研究纳入100对MZ，发现cg10535199-2q23.1（ β=0.74%， P=1.51×10 -7， OR=1.06，95% CI：1.03~1.09）和ch.17.49619327- SPOP（ β=0.23%， P=7.54×10 -7， OR=1.17，95% CI：1.08~1.28）位点高甲基化超过有建议意义的关联水平，经多重比较校正后，未发现位点达到基因组显著性水平，配对分析结果无统计学意义。识别出2个HOMA2-IR位点簇，位点簇1甲基化下调（ β=-0.39%， P<0.001），位点簇2甲基化上调（ β=0.47%， P<0.001）。 结论:IR与DNA甲基化之间存在关联，遗传因素可能在关联中发挥作用。

目的:探讨长链非编码RNA微小RNA(miR)-17-92a-1基因簇宿主基因(MIR17HG)对耐奥沙利铂(L-OHP)结直肠癌细胞株SW480/L-OHP的调控及机制。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定MIR17HG含量。SW480/L-OHP中构建MIR17HG敲减组(sh-MIR17HG)和对照组(sh-NC)。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活性，流式细胞术检测凋亡。荧光素酶报告实验和蛋白质印迹法检测TOP/FOP比值和β-连环蛋白(β-catenin)等分子表达。CHIR99021处理细胞后检测细胞凋亡率。应用SPSS 20.0软件进行统计分析。结果:SW480/L-OHP中MIR17HG含量高于SW480(9.84±0.69比2.22±0.47， t＝15.893， P<0.01)。L-OHP刺激后sh-MIR17HG组细胞活性低于sh-NC组(0.715±0.024比0.877±0.015， t＝-9.802， P<0.01)，凋亡率高于sh-NC组[(25.65±2.85)%比(7.38±0.89)%， t＝10.592， P<0.01]。SW480/L-OHP细胞的TOP/FOP比值高于SW480细胞(9.51±1.13比3.67±0.80， t＝7.320， P<0.01)。sh-MIR17HG组TOP/FOP比值低于sh-NC组(2.85±0.87比9.17±1.76， t＝-5.564， P<0.01)，β-catenin水平也低于sh-NC组(8.95±2.07比26.09±2.61， t＝-8.908， P<0.01)。CHIR99021刺激组凋亡率低于未刺激组[(13.91±1.69)%比(22.99±3.13)%， t＝-4.426， P<0.05]。 结论:SW480/L-OHP中高表达的MIR17HG可激活Wnt/β-catenin通路，进而促进结直肠癌细胞对L-OHP的耐药性。

目的:通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)，并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法:针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA)，将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞，利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2 －/－ Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2 －/－ Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用 t检验。 结果:利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株，HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达，HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较，差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15， t＝0.17， P>0.05)，但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%， t＝5.62， P<0.01]；KP感染HMGB2 －/－ Raw264.7，促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml， t＝5.00， P<0.01；(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml， t＝3.36， P<0.01；(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml， t＝3.68， P<0.05]。 结论:通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株，验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

目的:探讨热休克转录因子1(HSF1)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)抗氧化和抗衰老的作用。方法:利用成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除人ARPE-19细胞系中 HSF1基因，构建并获得2种HSF1缺失ARPE细胞株(ARPE/Hsf1 －/－)，分别命名为H8、H9细胞株。取野生型、H8和H9细胞株，应用DHE探针染色结合流式分析技术测定细胞内活性氧簇(ROS)含量，应用流式细胞分析方法测定细胞周期；采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定不同培养时间点细胞活力值；采用结晶紫染色实验测定细胞相对存活率；采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色实验检测衰老细胞比率；采用Western blot法检测各细胞株中热休克蛋白(HSP)70、HSP27、聚集素(CLU)、p53、p21和白细胞介素(IL)-1β蛋白表达水平；采用实时荧光定量PCR法测定各细胞株中p53、p21、IL-6、IL-8、IL-1β、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)mRNA表达水平。比较各细胞株在不同热休克处理条件下和HSP90抑制剂IPI504处理下热休克反应相关蛋白相对表达量，比较各细胞株不同浓度H 2O 2处理后相对存活率，比较各细胞株经或未经ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理后p21蛋白相对表达量。 结果:基因测序显示H8和H9细胞株成功携带突变基因，Western blot检测结果显示H8、H9细胞株不表达HSF1蛋白，HSF1在ARPE-19细胞中被成功敲除。与野生型细胞株相比，H8、H9细胞株中的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；各细胞株HSP90蛋白相对表达水平总体比较，差异无统计学意义( F＝0.29， P>0.05)。在不同热休克刺激和IPI504诱导下野生型细胞株中HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；与野生型细胞株相比，H8和H9细胞株的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著低于相应处理的野生型细胞，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与野生型细胞株相比，H8和H9细胞株培养24、48、72和96 h的细胞活力均显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与野生型细胞株比较，H8和H9细胞株G1期细胞百分比显著升高，细胞周期抑制因子p53、p21的mRNA和蛋白相对表达水平显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)，SA-β-gal染色阳性细胞比率显著增加，差异均有统计学意义(均 P<0.001)；衰老相关炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、MCP1 mRNA相对表达量显著下降，差异均有统计学意义(均 P<0.001)。H8和H9细胞株ROS含量明显高于野生型细胞株，差异均有统计学意义(均 P<0.001)；H8和H9细胞株经NAC处理后p21蛋白相对表达量较未经NAC处理明显降低，差异均有统计学意义( P<0.05)。H8和H9细胞株200、400、600、800 μmol/L H 2O 2处理条件下细胞相对存活率明显低于野生型细胞，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:敲除HSF1可下调HSP的表达，激活ROS/P53/P21通路，诱导RPE细胞衰老，并增加RPE对氧化应激刺激的敏感性。HSF1在RPE细胞中可能具有抗衰老和抗氧化调控作用。

目的:了解我国HIV CRF01_AE亚型及其相关重组亚型的包膜糖蛋白(envelope glycoprotein，ENV)分子流行情况，建立ENV共识序列以了解氨基酸突变及蛋白质三级结构。方法:收集Los Alamos数据库中2015—2021年我国HIV-1 CRF01_AE亚型及其相关重组亚型的完整ENV基因序列，构建系统发育进化树并建立ENV共识序列，使用Protscale及PROVEAN对ENV共识序列广谱中和抗体表位中的氨基酸亲疏水性变化及有害性突变进行预测，同时分析氨基酸突变对ENV三级结构的影响。结果:系统发育分析结果显示，有70.0%（14/20）的CRF01_AE亚型序列属于进化簇4，在ENV共识序列的广谱中和抗体表位V1/V2及Loop D中分别存在4个和1个的氨基酸突变使亲疏水性发生变化，PROVEAN预测结果显示V1/V2位点的G152D及β23/V5/β24表位的M476I为有害突变。ENV共识序列的蛋白质三级结构pLDDT值为86.2，在V1/V2表位存在由于有害突变所产生的新α螺旋。结论:我国HIV-1 CRF01_AE亚型基因谱系众多，加剧了重组病毒的形成。在ENV共识序列V1/V2结构域中由于氨基酸突变使其蛋白空间结构发生改变，这种改变可能会对后续广谱中和抗体的诱导产生影响。

目的:构建表达视觉系统同源框2( VSX2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。 方法:根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理，设计 VSX2的小向导RNA(sgRNA)，构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒；2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系，采用嘌呤霉素筛选获得单克隆，扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型；采用核型分析法分析报告细胞系核型；采用STR法排除细胞交叉污染；采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达；通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力；应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官，并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。 结果:电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有 VSX2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明，BC1- VSX2 eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明，BC1- VSX2 eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性，包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明，由BC1- VSX2 eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性；eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。 结论:成功构建1株表达 VSX2-eGFP报告基因的hiPSCs，该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化，为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。

目的:基因诊断1例β基因簇大片段纯合缺失病例并分析其临床特征，为临床遗传咨询提供依据。方法:应用毛细管电泳和常规地中海贫血基因检测技术检测广东惠州地区71 001份外周血样本，针对可疑β基因簇大片段缺失样本加用裂缝聚合酶链反应(Gap polymerase chain reaction，Gap-PCR)技术和多重连接探针扩增技术分析其基因分型，用统计学R软件比较分析血液学特征。结果:检出89例β基因簇中国型 Gγ( Aγδβ) 0缺失基因分型(检出率为0.13%)，其中中国型 Gγ( Aγδβ) 0缺失杂合子70例，中国型 Gγ( Aγδβ) 0杂合缺失复合α地中海贫血18例， Gγ( Aγδβ) 0缺失纯合子1例。建立13 683例正常对照组，与杂合子携带者的6组血液学参数相比较，箱线图显示差异均具有统计学意义( P<0.05)。诊断出的1例 Gγ( Aγδβ) 0缺失纯合子临床表型为轻度贫血，血红蛋白电泳结果显示HbF值100%。 结论:惠州地区人群β基因簇大片段缺失基因型的携带率高，血液学HbF值明显升高，应重视筛查，选择性行罕见型检测，防止漏诊或误诊，指导临床遗传咨询和产前诊断。