目的:探讨外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制。方法:采用实验研究方法。将15只6~8周龄雌性SD大鼠按随机数字表法（分组方法下同）分为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+肉碱组，每组5只，单纯烫伤组和烫伤+肉碱组大鼠背部制作30%体表总面积的Ⅲ度烫伤，其中烫伤+肉碱组大鼠另外给予腹腔注射左旋肉碱。伤后72 h，采用全自动生化仪检测肝损伤生物化学指标天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平，样本数为5。伤后72 h，采用苏木精-伊红染色观察肝组织损伤情况。伤后72 h，采用实时荧光定量反转录PCR（RT-qPCR）法检测肝组织中细胞焦亡相关标志物核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶1（caspase-1）、消皮素D和白细胞介素1β（IL-1β）以及内质网应激相关标志物葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的mRNA水平；采用蛋白质印迹法检测肝组织中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平，样本数均为5。取人肝癌细胞HepG2，分为二甲基亚砜（DMSO）组、0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组，分别作相应处理。培养24 h后，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞活力并筛选衣霉素干预浓度（样本数为5）。取HepG2人肝癌细胞，分为DMSO组、单纯衣霉素组和衣霉素+肉碱组，分别作相应处理。培养24 h后，采用蛋白质印迹法检测细胞中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平，样本数均为3。对数据行单因素方差分析和LSD- t检验。 结果:伤后72 h，单纯烫伤组大鼠血清中AST和ALT水平分别为（640±22）、（157±8）U/L，均分别明显高于假伤组的（106±13）、（42±6）U/L（ t值分别为-46.78、-25.98， P<0.01）；烫伤+肉碱组大鼠血清中AST和ALT水平分别为（519±50）、（121±10）U/L，均明显低于单纯烫伤组（ t值分别为4.93、6.06， P<0.01）。伤后72 h，假伤组大鼠肝组织形态基本正常，未见明显的炎症细胞浸润；与假伤组相比，单纯烫伤组大鼠肝组织可见大量的炎症细胞浸润，细胞排列紊乱；与单纯烫伤组相比，烫伤+肉碱组大鼠肝组织可见少量的炎症细胞浸润。伤后72 h，单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1β mRNA表达水平均明显高于假伤组（ t值分别为34.42、41.93、30.17、15.68， P<0.01）；烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1β mRNA表达水平均明显低于单纯烫伤组（ t值分别为34.40、37.20、19.95、7.88， P<0.01）。伤后72 h，与假伤组相比，单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显升高（ t值分别为12.28、26.92、5.20、10.02、24.78， P<0.01）；与单纯烫伤组相比，烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显下降（ t值分别为10.99、27.96、12.69、8.96、12.27， P<0.01）。伤后72 h，单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显高于假伤组（ t值分别为21.00、16.52， P<0.01），烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显低于单纯烫伤组（ t值分别为8.92、8.21， P<0.01）；单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显高于假伤组（ t值分别为22.50、14.29， P<0.01），烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显低于单纯烫伤组（ t值分别为14.29、5.33， P<0.01）。培养24 h后，与DMSO组相比，0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组细胞存活率均明显下降（ t值分别为4.90、9.35、18.64、25.09， P<0.01）；选择0.8 μmol/L作为后续衣霉素的干预浓度。培养24 h后，与DMSO组相比，单纯衣霉素组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显升高（ t值分别为10.48、17.67， P<0.01）；与单纯衣霉素组相比，衣霉素+肉碱组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显下降（ t值分别为8.08、13.23， P<0.05或 P<0.01）。培养24 h后，与DMSO组相比，单纯衣霉素组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显升高（ t值分别为13.44、27.51， P<0.01），caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化（ P>0.05）；与单纯衣霉素组相比，衣霉素+肉碱组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显下降（ t值分别为20.49、21.95， P<0.01），caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化（ P>0.05）。 结论:在严重烫伤大鼠中，外源性左旋肉碱可能通过抑制过度内质网应激介导的细胞焦亡相关通路发挥对肝损伤的保护作用。

目的:探讨SMARCA4(SWI/SNF-related,matrix-associated,actin-dependent regulator of chromatin,subfamily A,member 4)在铁死亡中的作用和分子机制.方法:(1)培养人纤维肉瘤细胞系HT1080,设置对照[二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)]组和不同浓度(31.25、62.5和125 nmol/L)Ras选择性致死小分子3(Ras-selec-tive lethal small molecule 3,RSL3;铁死亡诱导剂)处理组,每组3个复孔;利用Western blot检测细胞中SMARCA4蛋白水平.(2)利用2条小干扰RNA敲减HT1080细胞的SMARCA4基因,并将细胞分为阴性对照组和SMARCA4基因敲减(siSMARCA4-1和siSMARCA4-2)组,每组3个复孔;利用Western blot检测3组细胞中SMARCA4蛋白水平;利用高内涵细胞成像分析系统检测DMSO、坏死抑素2外消旋体(necrostatin 2 racemate,Nec-1s;坏死性凋亡抑制剂)、N-苯甲基氧化碳酰-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮[Z-VAD(OMe)-FMK,Z-VAD;广谱caspase抑制剂/凋亡阻断剂]和铁抑素1(ferrostatin-1,Fer-1;铁死亡抑制剂)处理后3组细胞的存活率;利用RT-qPCR和流式细胞术检测3组细胞的铁死亡指标:前列腺素内过氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)基因转录、脂质过氧化、总活性氧(reactive oxygen species,ROS)、不稳定铁池(labile iron pool,LIP)和谷胱甘肽;利用RT-qPCR检测3组细胞中铁代谢基因、调控铁死亡的ROS调节基因和胆固醇合成关键基因的转录水平;利用高内涵细胞成像分析系统检测胆固醇处理后3组细胞的存活率.(3)对已发表的在线数据进行共同差异基因分析和基因本体论(gene on-tology,GO)富集分析.结果:(1)RSL3处理降低SMARCA4蛋白水平(P＜0.05).(2)敲减SMARCA4导致细胞铁死亡.(3)敲减SMARCA4不通过影响LIP或调控铁死亡的ROS调节基因的转录水平而导致铁死亡.(4)敲减SMARCA4影响细胞膜、脂筏相关通路和胆固醇合成;(5)补充胆固醇可以挽救敲减SMARCA4导致的铁死亡(P＜0.01).结论:铁死亡诱导剂RSL3处理降低人纤维肉瘤HT1080细胞中的SMARCA4蛋白水平,且敲减SMARCA4通过抑制胆固醇合成导致HT1080细胞铁死亡.

目的 评价消旋酶法DL-丙氨酸的遗传毒性.方法 小鼠骨髓细胞微核实验设阴性对照组(纯水)、阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg)和消旋酶法DL-丙氨酸3个剂量组(10000、5000和2500 mg/kg),观察各组小鼠胸骨骨髓细胞微核发生率;小鼠精原细胞染色体畸变实验设阴性对照组(纯水)、阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg)和消旋酶法DL-丙氨酸3个剂量组(10000、5000和2500 mg/kg),观察各组小鼠睾丸精原细胞染色体畸变类型并计算畸变率.细菌回复突变实验(Ames实验)设空白对照组、溶剂对照组、阳性对照组和消旋酶法DL-丙氨酸5个剂量组(50、158、500、1580、5000μg/皿和8、40、200、1000、5000μg/皿),计数各组回复突变菌落数.结果 小鼠骨髓细胞微核实验结果显示,各剂量组消旋酶法DL-丙氨酸微核细胞率与对照组的差异无统计学意义(P>0.05);小鼠精原细胞染色体畸变实验结果显示,各剂量组消旋酶法DL-丙氨酸动物睾丸精原细胞染色体畸变率与对照组的差异无统计学意义(P>0.05);细菌回复突变实验结果显示,在加或不加S9的情况下,各剂量组消旋酶法DL-丙氨酸对TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535菌株均无致突变作用,差异无统计学意义(P>0.05).结论 消旋酶法DL-丙氨酸未见明显遗传毒性.

变异链球菌是口腔主要的龋病病原菌.丙氨酸消旋酶通过合成右旋丙氨酸(D-alanine,D-ala)参与细菌细胞壁肽聚糖的生物合成过程,与细菌性疾病密切相关,近年来成为抗菌药物的又一理想靶位.D-环丝氨酸(D-cycloserine,DCS)是丙氨酸消旋酶不可逆性抑制剂.本研究通过聚合酶链反应克隆变异链球菌UA159的smu.1834c基因,经过酶切、连接,构建重组表达质粒pET-smu.1834c,诱导表达重组,纯化蛋白.测定DCS对丙氨酸消旋酶活性的抑制作用.成功诱导表达纯化smu.1834c基因编码蛋白,具有体外催化L-丙氨酸生成D-丙氨酸的活性.发现DCS能够抑制该蛋白的活性.本研究证实变异链球菌smu.1834c基因编码丙氨酸消旋酶.DCS能够抑制其活性,并且呈现一定的剂量相关性.

[目的]通过定点突变探究腾冲嗜热厌氧菌MB4中生物合成型丙氨酸消旋酶TtAlr底物通道内氨基酸位点A172和S173的功能.[方法]利用定点突变PCR技术构建突变体,通过亲和层析法纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性及其稳定性.[结果]通过定点突变PCR成功得到8个突变体,酶学特性分析发现,A172位点突变为丝氨酸(S)后酶蛋白的相对活性有所提升,但含有该位点突变的酶蛋白稳定性均大幅下降;S173位点突变为天门冬氨酸(D)后导致突变体蛋白的最适反应温度提升了15℃,半衰期大幅延长,但相对活性明显下降.[结论]丙氨酸消旋酶TtAlr底物通道内A172和S173位点均是影响酶蛋白催化活性和稳定性的关键位点.

[背景]高效实现D-氨基酸的生物合成一直是人们关注的热点.内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-diaminopimelate dehydrogenase,DAPDH)能够直接催化2-酮酸和氨合成D-氨基酸.[目的]提高DAPDH对烷基取代2-酮酸的催化活力,并解释其催化机制.[方法]以来源于嗜热共生杆菌(Symbiobacterium thermophilum)的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)为模板,在前期结构分析结合被选择位点突变结果的基础上,确定对H227位进行定点饱和突变,并以D-丙氨酸、D-2-氨基丁酸、D-正-缬氨酸、D-谷氨酸为底物进行筛选.[结果]获得突变体H227Q和H227N.突变体H227Q对丙酮酸、2-氧代丁酸、2-氧代戊酸、2-酮戊二酸的比活力比野生型分别提高了10.9、11.5、8.6和7.6倍.动力学参数表明,突变体H227Q同时提高了酶对底物的亲和力及催化常数,使其对丙酮酸的催化效率(kcat/Km)相较于野生型提高了9.4倍.利用分子模拟技术分析突变体H227Q与产物氨基酸之间的相互作用表明,227位的谷氨酰胺通过与氨基酸的羧酸形成氢键,使得氨基酸产物Ca上的氢和辅酶烟酰胺环C4原子之间的距离缩短.[结论]利用定向进化技术提高DAPDH对烷基取代2-酮酸的催化活力,有助于开发新型的高效生物催化剂,这些工作也为下一步继续进行更具挑战性的D-氨基酸研究提供了基础.

[目的]通过易错PCR技术提高鼠伤寒沙门氏菌中丙氨酸消旋酶的催化活性.[方法]利用易错PCR技术构建丙氨酸消旋酶基因alrst的突变体文库,采用缺陷菌株UT5028筛选突变体基因,以D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性,通过凝胶过滤层析法分析酶蛋白寡聚化状态,并采用HPLC检测酶蛋白的动力学参数.[结果]经过易错PCR及定点突变技术最终获得了3个催化活性有所提高的突变体A3V、Y343H和A3VY343H,酶学特性分析发现,与野生型蛋白StAlr相比,突变体Y343H仅对底物L/D-丝氨酸的催化效率略有提高,kcat/Km值分别是StAlr的2.01和3.68倍;而突变体A3V则对底物L/D-丙氨酸或L/D-丝氨酸的Km、kcat和kcat/Km值均有较大幅度的改变,其kcat/Km值分别是StAlr的105.51、97.36、4.63和10.73倍.凝胶过滤层析结果显示,突变体A3V在蛋白含量极低时就呈现出单体和二聚体共存状态,且随着蛋白含量的增加,其向二聚体状态迁移的速率最为明显.[结论]丙氨酸消旋酶StAlr的第3位点是影响其催化活性和低聚合状态的关键位点.

目的 探究神曲消食口服液对功能性消化不良(FD)小鼠胃肠运动的影响及机制.方法 取40只KM小鼠随机分为正常组、神曲消食口服液低、中及高剂量组,检测小鼠血常规和肝肾功能指标.另取50只KM小鼠中随机选出10只作为正常组,剩余小鼠采用不规律进食+左旋精氨酸(L-Arg)法构建FD动物模型,再随机分为模型组、神曲消食口服液低、中及高剂量组;记录小鼠体重情况,计算小鼠胃内残留率和肠推进率,观察胃组织病理学改变,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)检测小鼠胃组织中内质网应激因子肌醇需求酶1(IREl)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)的表达.结果 各组小鼠白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MONO)、中性粒细胞(NEU)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆汁酸(TBA)、尿素氮(BUN)及肌酐(CRE)比较,组间差异无统计学意义(P>0.05);各组小鼠胃组织粘膜层、粘膜下层、肌层及浆膜层结构清晰,均未见明显的病理学改变;与模型组相比,神曲消食口服液低、中及高剂量组胃排空率和小肠推进率明显升高,胃组织中IREl和TRAF2 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05).结论 神曲消食口服液对正常小鼠血常规及肝肾功能无明显影响,可明显改善FD小鼠胃肠运动功能,可能与下调内质网因子IREl和TRAF2的表达有关.

[目的]将嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶OF4DadX的N-端结构域分别与多个不同种属的丙氨酸消旋酶C-端结构域重组,探究丙氨酸消旋酶C-端结构域功能.[方法]利用基因拼接构建丙氨酸消旋酶重组基因,通过镍亲和层析纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测重组酶蛋白的酶学特性,借助分子筛和HPLC液相色谱分析其聚合状态及动力学参数.[结果]通过基因拼接构建了12个重组基因,经检测,表达、纯化获得的重组酶蛋白中只有OF4TtDadX240c具有催化活性,其活性仅为OF4DadX的60.54％,酶催化动力学结果显示OF4TtDadX240c催化反应速率Vmax/Km下降约10倍,但其稳定性大幅提高,半衰期比OF4DadX延长约5倍,耐热性提高较明显;聚合状态表明OF4DadX、OF4TMDadX226c和OF4TtDadX240c为二聚体结构,其他酶蛋白均为单体,但OF4TMDadX226c未检测到活性,推测可能是酶催化活性中心移位,未能形成质子转移而失去活性.[结论]丙氨酸消旋酶C-端折叠结构域对消旋酶低聚化、稳定性和酶催化功能具有重要作用.

抗生素的滥用和人口的大量流动使得病原菌耐药性增强并与其他病原体产生共感染等问题,严重威胁人类的生命安全,因此,研发新型抗菌药物成为人类亟待解决的问题.丙氨酸消旋酶是以磷酸吡哆醛为辅酶催化L-丙氨酸与D-丙氨酸旋光结构互换的一类异构酶,其消旋产物D-丙氨酸对细菌细胞壁的形成具有决定性作用,与细菌性疾病密切相关.抑制丙氨酸消旋酶的活性会影响细菌的生存,近年来成为设计抗菌药物的一个理想靶位,其抑制剂的开发已成为抗菌药物研发的热点.本文从丙氨酸消旋酶的来源、结构、功能、应用及抑制剂等方面进行系统阐述,并对丙氨酸消旋酶的研究提出新的策略,为进一步研究丙氨酸消旋酶与致病菌的关系及抗菌药物候选靶标的研究提供理论基础.