目的:探讨脊髓二价金属离子转运体1(DMT1)亚硝基化修饰与瑞芬太尼诱发大鼠痛觉过敏机制的关系。方法:清洁级健康成年雄性SD大鼠40只，2～3月龄，体质量240～260 g，采用随机数字表法分为4组( n＝10)：对照组(C组)尾静脉输注生理盐水0.1 ml·kg －1·min －1 60 min；瑞芬太尼组(R组)尾静脉输注瑞芬太尼1.0 μg·kg －1·min －1 60 min；L-NAME组(C＋L组)腹腔注射一氧化氮合酶抑制剂L-NAME 30 mg/kg，10 min后尾静脉输注生理盐水0.1 ml·kg －1·min －1 60 min；瑞芬太尼＋L-NAME组(R＋L组)腹腔注射L-NAME 30 mg/kg，10 min后尾静脉输注瑞芬太尼1.0 μg·kg －1·min －1 60 min。分别于静脉输注前24 h、输注结束后6、24和48 h(T 0～3)时测定机械缩足反应阈(MWT)和热缩足潜伏期(TWL)。最后一次测定痛阈后麻醉状态下处死大鼠，取L 4～6脊髓标本，采用实时定量PCR法检测脊髓nNOS和DMT1 mRNA的表达；生物素转化法提取亚硝基化蛋白质，Western blot法检测nNOS、总体DMT1和亚硝基化DMT1的表达；分光光度法测定脊髓NO含量；原子吸收分光光度计法测定脊髓铁含量。 结果:与C组比较，R组T 1～3时MWT降低，TWL缩短，R组和R＋L组脊髓nNOS及其mRNA和亚硝基化DMT1表达上调，NO和铁含量升高( P<0.05)；C＋L组各指标差异均无统计学意义( P>0.05)；与R组比较，R＋L组T 1～3时MWT升高，TWL延长，脊髓nNOS及其mRNA和亚硝基化DMT1表达下调，NO和铁含量降低( P<0.05)；与C＋L组比较，R＋L组T 1～3时MWT降低，TWL缩短，脊髓nNOS及其mRNA和亚硝基化DMT1表达上调，NO和铁含量升高( P<0.05)；各组脊髓DMT1 mRNA和总体DMT1表达比较差异均无统计学意义( P>0.05)。 结论:脊髓nNOS激活引起NO生成增加，介导DMT1亚硝基化修饰，可能与瑞芬太尼诱发大鼠痛觉过敏的机制有关。

目的:建立工作场所空气中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基甲基乙胺、N-亚硝基二丁胺、N-亚硝基正丙胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基二苯胺和N-亚硝基吡咯烷8种N-亚硝胺化合物的气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）检测方法。方法:于2023年1至8月，以ThermoSorb/N柱采集工作场所中空气中8种N-亚硝胺，用4 ml甲醇-二氯甲烷（体积比1∶1）溶液解吸，VF-624 ms毛细管色谱柱分离，多反应监测模式检测，外标法定量，并对方法的检出限和精密度等指标进行分析。结果:8种N-亚硝胺测定方法的线性范围为1.0~20.0 μg/L，相关系数0.999 3~0.999 9，方法检出限0.051~0.132 μg/L，最低定量浓度0.030~0.078 μg/m 3（以空气体积22.5 L，解吸液体积4.0 ml计），批内精密度2.05%~6.89%，批间精密度2.41%~8.26%，解吸效率67.20%~102.60%；样品在4 ℃条件下至少可保存7 d。 结论:GC-MS/MS测定工作场所空气中8种N-亚硝胺方法的灵敏度高、精密度好，可准确测定工作场所空气中8种N-亚硝胺含量。

目的 考察盐酸雷尼替丁原料药中的N-亚硝基二甲胺(NDMA)及其前化合物二甲胺(DMA)和亚硝酸盐(NO2-)在高温条件下含量变化.方法 盐酸雷尼替丁原料药分别置于有氧和无氧环境中,在40℃和60 ℃的条件下破坏5、10和30d.采用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)、阳离子和阴离子色谱法,分别测定破坏后样品中NDMA、DMA和NO2-的含量.结果 建立的3种检测方法的专属性、灵敏度、线性、回收率和重复性均满足要求.在有氧和无氧环境中,60℃破坏的盐酸雷尼替丁样品中3种物质的含量均高于40℃;另外,在有氧条件下,3种物质的含量也明显高于相应的无氧条件,其中第30日,60℃有氧条件下NDMA、DMA和NO2-分别增长至1.92、55.50和44.76 μg·g-1.结论 温度和氧气是盐酸雷尼替丁产生NDMA及其前体化合物DMA和NO2-的重要因素;同时,间接验证盐酸雷尼替丁产生NDMA可能的机制为首先降解生成DMA和NO2-,并进一步反应生成NDMA.本研究可为盐酸雷尼替丁贮存条件设置和质量标准提升提供参考.

目的 建立并验证基于4%中性甲醛固定肝组织制备肝细胞的大鼠肝微核实验(LMNT)方法(甲醛固定-LMNT法).方法 ①SD大鼠分为雌性和雄性组,然后分别随机分为溶剂对照组和肝微核阳性化合物N-亚硝基二乙胺(DEN)12.5 mg·kg-1组,每组5只,分别ig给予生理盐水和DEN,每天1次,连续14d后取肝组织,同时用胶原酶消化-LMNT法和甲醛固定-LMNT法检测微核化肝细胞数量和处于有丝分裂期肝细胞数,分别计算肝细胞微核率和有丝分裂指数,肝细胞微核率>0.07%判定为阳性结果.②雄性SD大鼠分为喹啉(30,60和120 mg·kg-1)组、N-亚硝基吡咯烷(NPYR,25,50和100 mg·kg-1)组、各自溶剂对照组(NPYR,去离子水;喹啉,玉米油)及阳性对照DEN(12.5 mg·kg-1)组,每组5～6只,连续ig 15 d.每日记录体重,实验结束取肝记录肝总重,计算肝系数.自动生化分析仪检测肝功能相关血清生化指标谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性和血清总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL)的水平.采用胶原酶消化-LMNT法和甲醛固定-LMNT法测定肝细胞微核率,用外周血微核实验和肝彗星实验评价喹啉和NPYR遗传毒性.结果 ①与各自溶剂对照组的肝细胞微核率(0.069%和0.030%)相比,甲醛固定-LMNT法测得的DEN组雄性大鼠肝细胞微核率为1.10%,雌性大鼠为0.82%,均显著升高(P<0.05);与各自溶剂对照组(0.060%和0.030%)相比,胶原酶消化法-LMNT法测得的DEN组雄性大鼠肝细胞微核率为1.45%,雌性大鼠为0.46%,均显著升高(P<0.05),判定为阳性.2种方法中雄性大鼠的肝细胞微核率均显著高于雌性(P<0.05).与各自溶剂对照组相比,2种方法测得的DEN组雄性和雌性大鼠肝细胞有丝分裂指数均无明显差异.②与溶剂对照组相比,NPYR 50和100 mg·kg-1组大鼠体重在ig第 7～14天显著降低(P<0.01),DEN组在ig第8～14天显著降低(P<0.01);喹啉120 mg·kg-1组大鼠在ig第4～14 天显著降低(P<0.01),DEN组在ig第10～14天显著降低(P<0.05).与溶剂对照组相比,NPYR 100 mg·kg-1组(P<0.01)和DEN组(P<0.05)的肝重和肝系数均显著降低;喹啉60和120 mg·kg-1组肝重(P<0.01)和肝系数(P<0.05)均显著增加.与溶剂对照组相比,DEN组大鼠血清T-BIL水平显著升高(P<0.01),NPYR 100 mg·kg-1组GPT、GOT活性和D-BIL、T-BIL水平均显著升高(P<0.01),NPYR 25,50 mg·kg-1和喹啉各剂量组则均无显著差异.甲醛固定-LMNT法测得的NPYR组肝细胞微核率较胶原酶消化-LMNT法略高,均判定为阳性;与溶剂对照组相比,2种方法测得的NPYR组肝细胞微核率均显著增加(P<0.05),喹啉组结果相当,均判定为阳性;2种方法测得的喹啉组肝细胞微核率均显著增加(P<0.05).2种方法测得的NPYR和喹啉组肝细胞微核率相关性较好(R2分别为0.8614和0.9279).NPYR组外周血微核实验为阴性,彗星实验结果为阳性;喹啉组外周血微核实验和彗星实验结果均为阴性.结论 初步建立并验证了甲醛固定-LMNT法,且该方法检测肝致癌物的灵敏度与胶原酶-LMNT法相近.

目的:观察平胃胶囊对亚硝酸胺类化合物N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-ni-trosoguanidine,MNNG)诱导的胃癌前病变(precancerous lesions of gastric cancer,PLGC)细胞模型的影响,并初步探讨其作用机制.方法:制备空白血清和平胃胶囊含药血清备用;MNNG诱导人胃黏膜上皮细胞系GES-1制备PLGC细胞模型,采用倒置显微镜观察细胞形态,免疫荧光法检测增殖细胞相关抗原Ki67的表达水平,进行模型评价.CCK-8法筛选含药血清最佳干预浓度及时间;采用荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;ELISA检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;采用相关试剂盒检测超氧化物歧化酶(superoxide dis-mutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性;采用新型荧光探针JC-10检测细胞线粒体膜电位的变化;采用实时荧光定量PCR检测Ki67和黑色素瘤分化相关基因7(melanoma differentiation-associated gene-7,MDA-7)的mRNA表达水平;采用Western blot法测定Ki67、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和MDA-7的蛋白表达水平.结果:与正常组相比,模型组和空白血清组ROS和MDA含量显著升高(P<0.01),SOD和GSH-Px的活性显著降低(P<0.01),线粒体膜电位显著下降(P<0.01),Ki67和IL-6蛋白表达显著升高(P<0.01),MDA-7蛋白表达显著下降(P<0.01);与空白血清组相比,模型组ROS和MDA含量,SOD和GSH-Px活性,Ki67和MDA-7 mRNA表达水平,Ki67、IL-6和MDA-7蛋白表达水平,以及线粒体膜电位均无显著差异(P>0.05);与空白血清组相比,平胃胶囊含药血清组中ROS和MDA含量显著降低(P<0.01),SOD和GSH-Px活性显著上升(P<0.05),线粒体膜电位显著升高(P<0.01),Ki67和IL-6蛋白表达水平显著下降(P<0.01),MDA-7的mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01).结论:平胃胶囊可显著减轻MNNG诱导的胃黏膜上皮细胞氧化应激损伤和炎症反应,调控促癌基因和抑癌基因的表达,从而发挥防治PLGC的作用.

一氧化氮(NO)是一种重要的血管舒张因子,具有调节血管平滑肌舒张、抑制血管平滑肌细胞增殖及减少血小板聚集和血栓形成的功能,参与调节肺动脉高压的发生发展,改善肺动脉高压.为实现NO持续、受控释放和靶点特异性,大量研究致力于开发纳米载体系统递送NO供体,用于肺动脉高压的日常给药治疗.本文概述了体内NO来源及其舒血管作用机制,总结了目前针对NO信号通路的3种肺动脉高压靶向治疗药物(磷酸二酯酶5抑制剂、鸟苷酸环化酶激动剂和吸入性NO),介绍了代表性的NO供体(如有机硝酸盐、金属亚硝基化合物、亚硝酸盐和N-重氮鎓二酸盐)以及治疗肺动脉高压的纳米载体制剂(直接递送NO气体的纳米粒子、基于亚硝酸盐的NO递送系统和基于N-重氮鎓二酸盐的NO递送系统)的研究进展.

Enopeptin A是一种缩酚酸肽类化合物,具有抗菌、抗病毒等生物活性.以本实验室保藏的链霉菌SIIA-H7264为出发菌,通过紫外(Uy)照射、甲基磺酸乙酯(EMS)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变以及常压室温等离子体(ARTP)诱变,获得l株高产突变株A-21,其发酵产物Enopeptin A的产量较出发菌株提高了3倍.对发酵条件、发酵培养基组分进行单因素及响应面优化试验,最终EnopeptinA的产量达到1750μg/mL,较初始工艺提高了2.98倍.

目的 观察胃上皮细胞GES-1经亚硝基化合物N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)短时间刺激后细胞所发生形态和功能特性的变化.方法 将MNNG刺激GES-1细胞0、4、8、12 h后,应用显微镜观察细胞形态学变化,平板克隆形成实验观察细胞增殖能力,Transwell迁移实验观察细胞迁移能力(穿膜细胞数),Western blotting法检测上皮-间质转化(EMT)相关蛋白E-cadherin和N-cadherin.结果 GES-1细胞随着MNNG刺激时间延长,细胞边缘变得不清晰,细胞变细长、变大.GES-1细胞经MNNG刺激0、4、8、12 h时,其细胞克隆数分别为(82.00±1.16)、(89.67±3.28)、(81.33±1.76)、(85.67±1.45)个,各时点GES-1细胞克隆数比较差异无统计学意义;穿膜细胞数分别为(83.00±2.89)、(149.00±5.20)、(265.70±6.06)、(491.00±8.74)个,刺激时间越长穿膜细胞数越多(P均＜0.05);随着MNNG刺激时间延长,GES-1细胞E-cadherin表达逐渐降低而N-cadherin表达逐渐升高(P均＜0.05).结论 以亚硝基化合物MNNG短时刺激能使胃上皮细胞的形态和迁移能力发生一定变化,并且促使胃上皮细胞发生EMT.

目的:研究铁皮石斛水提物对胃癌前病变大鼠尿液内源性代谢物的影响.方法:将Wistar大鼠随机分为正常组、铁皮石斛水提物(DOE)组、模型组及N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)+DOE低、中、高剂量组.DOE组和MNNG+DOE低、中、高剂量组大鼠预防性给予DOE2周后开始给予自由饮100 mg·L-1 MNNG水溶液,边给药边造模,并在前6周,每3d灌胃给予10％ NaC1 1 mL诱导.造模7个月后代谢笼收集大鼠尿液并处死大鼠取胃组织.采用UPLC-Q-TOF-MS检测大鼠尿液代谢谱的变化.结果:对比各组胃组织病理结果发现DOE能够减少肠化生,使病理程度停留在轻度至中度异型增生和轻度肠化生阶段.在正、负离子模式下分别筛选出6个和15个差异性标志化合物;代谢产物主要与卟啉代谢、色氨酸代谢、叶酸和蝶呤生物合成代谢、半乳糖代谢和花生四烯酸代谢有关,其中以卟啉代谢最为相关.结论:DOE能够阻断胃癌前病变的恶化,其机制可能与卟啉代谢、色氨酸代谢、叶酸和蝶呤生物合成代谢、半乳糖代谢和花生四烯酸代谢有关.

目的:采用N-亚硝基二乙胺(DEN)作为阳性化合物建立大鼠肝微核实验方法,同时结合彗星实验及外周血微核实验终点于同一个实验中,综合评价其遗传毒性.方法:实验设置阴性对照组(生理盐水)、DEN低(3.13 mg·kg-1)、中(6.25 mg· kg-1)、高(12.5 mg·kg-1)剂量组、Comet阳性对照组(EMS,100mg· kg-1)共5个给药组,每组5只雄性SD大鼠,连续ig给药,在d 14给药后约21 h进行末次给药,在末次给药后约3h进行外周血采样,进行微核实验,采用流式细胞术测定网织红细胞微核率,并麻醉动物进行彗星和肝微核实验肝脏的取样、处理,最后分别通过Comet Assay软件和荧光显微镜获得结果.结果:肝微核实验中,中、高剂量DEN染毒组肝脏的微核率与阴性对照组相比均显著增加,且呈剂量反应关系(r=0.98,P＜0.01);彗星实验中,所有DEN染毒组肝脏的尾DNA百分含量与阴性对照组相比均显著增加,且呈剂量反应关系(r =0.91,P＜0.05);外周血微核实验中,所有DEN染毒组与阴性对照组相比,外周血网织红细胞微核率均没有明显的升高.结论:本实验初步建立了大鼠肝微核重复剂量实验方法,在同一实验中进行肝微核实验、外周血微核实验以及彗星实验多终点的联合检测,不仅可节省实验动物数量,而且可提高实验效率,大大增加遗传毒性实验结果对致癌性的预测性.