目的:了解浙江省衢州地区儿童病毒性脑炎埃可病毒(Echovirus, ECHOV)优势血清型与变迁并分析ECHOV VP1基因分子特征。方法:采集53例病毒性脑炎患儿脑脊液标本进行病毒分离培养。采用荧光RT-PCR和PCR分别检测脑脊液标本中人肠道病毒(human enterovirus，HEV)包括ECHOV、柯萨奇病毒(coxsackie virus，CV)和新型肠道病毒(enterovirus，EV)，以及流行性乙型脑炎病毒(japanese encephalitis virus, JEV)、腮腺炎病毒(mumps virus, MuV)、西尼罗病毒(west nile virus，WNV)、基孔肯雅病毒(chikungunya virus，CHIKV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)和巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)。HEV阳性脑脊液标本采用RT-PCR法扩增HEV-B组全长VP1基因序列，测序后用多种生物信息学软件分析ECHOV VP1基因型、基因重组和遗传进化特征。结果:RD细胞分离培养出6株毒株，但Hep-2细胞分离培养结果均阴性。11份标本HEV通用荧光RT-PCR结果阳性，但其他病毒检测结果均阴性。11份HEV阳性标本中6份检出ECHOV，与分离培养结果一致，分别为4株ECHO6、1株为ECHO7和1株ECHO30血清型，柯萨奇病毒和EV检测结果均阴性。4株ECHO6病毒属于ECHO6-C2基因亚型，但分为ECHO6-41/46和ECHO6-45/48两个流行克隆，ECHO7和ECHO30分别属于ECHO7-C和ECHO30-C基因型。ECHO6与ECHO30病毒在进化过程中存在VP1基因重组。结论:ECHOV是该地区儿童病毒性脑炎主要病原体，且可能存在局部暴发流行。ECHO6与ECHO30病毒VP1基因存在重组可能性，ECHO6有成为ECHOV优势血清型的可能。

目的:了解2002-2018年浙江省病毒性脑膜炎病原学及分子流行病学特征。方法:从设立的监测点医院采集疑似病毒性脑膜炎患者样本2 173份，其中脑脊液1 718份、粪便455份，用荧光定量PCR方法检测脑脊液中人类肠道病毒（HEV）、腮腺炎病毒（MuV）、单纯疱疹病毒（HSV）、巨细胞病毒（CMV）和乙型脑炎病毒（JEV）核酸，粪便样本只检测HEV；用ELISA方法检测脑脊液中上述5种病毒IgM抗体；对HEV核酸阳性样本扩增病毒VP1基因和测序，确定病毒型别并进行进化分析。结果:在2002-2018年2 173份样本中检出HEV核酸阳性871份（40.1 %），其中脑脊液1 718份、阳性654份（38.1 %），粪便455份、阳性217份（47.7 %）；871份HEV核酸阳性样本，VP1扩增测序阳性670份，其中HEV-A 5份、HEV-B 665份，涉及23个病毒血清型，分别为柯萨奇病毒（CV）A组CVA4、CVA6、CVA9、CVA10，CVB组1~5，埃可病毒（EchoV；E）E3、E4、E6、E7、E9、E11、E14、E16、E18、E21、E25、E30、E33和肠道病毒（EV）-71，位于前3位的分别为E30、E6和CVB5，该3个血清型间隔若干年呈现病毒活动性增强的趋势。从2012-2015和2018年795份脑脊液中检出HEV核酸阳性374份、MuV 6份、HSV和CMV均为5份，对其中的368份脑脊液同时检测5种病毒IgM抗体，HEV抗体阳性2份、JEV 6份、MuV 1份。670份HEV中除1份EV-71外，EchoV 517份、CV 152份，两者之比为3.4∶1，两类病毒间隔3~5年存在优势株交替变化的趋势。VP1进化树显示，浙江省HEV位于HEV-A和HEV-B分支上，E30存在h和i基因亚型。 结论:浙江省病毒性脑膜炎的主要病原为HEV-B；EchoV检出率明显高于CV，两类病毒存在交替变化的趋势；优势血清型E30、CVB5和E6间隔若干年呈现病毒活动性增强的趋势；监测点HEV活动强度与病毒性脑膜炎暴发疫情的发生两者之间在时间上有较好的相关性。

目的:分析猴痘患者的流行病学、临床症状和实验室检查特征。方法:对义乌市中心医院2023年7月确诊的4例猴痘患者进行流行病学、临床症状和体征、实验室血液及生化分析，并取疱疹液及病变皮肤组织使用非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离培养和全基因测序鉴定。结果:4例患者均为男性，年龄24~35岁，发病前21 d内均有男男性行为。其中，1例患者患有艾滋病，1例患者患有梅毒。4例患者均出现会阴部皮损伴瘙痒，3例入院时查体发现有淋巴结肿大。实验室检测中，病例4血常规显示淋巴细胞异常，为4.57×10 9/L，病例1降钙素原升高，为0.25 ng/mL。3例患者细胞因子异常，其中病例2和3白细胞介素10(IL-10)升高，分别为7.11和9.42 ng/L，病例3 IL-6为66 ng/L，病例2 IL-4为3.24 ng/L。病例2心肌酶谱异常，乳酸脱氢酶为313 U/L，其他指标未见明显异常。在病变皮损组织及疱疹液中成功分离到猴痘病毒，全基因测序鉴定均为Ⅱb进化分支B.1.3亚型，对Vero细胞具有典型的病变效应。 结论:4例猴痘患者的临床症状较轻，男男性行为中密切接触可能在猴痘传播中起关键作用。病毒株均为Ⅱb进化分支B.1.3谱系。

目的:阐明2011年甘肃省幼儿急疹病例中人疱疹病毒6型(human herpesvirus-6，HHV-6)感染情况及病毒基因特征。方法:应用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，q-PCR)方法对2011年甘肃省收集的169份幼儿急疹病例的咽拭子标本进行HHV-6初筛，对HHV-6病毒核酸阳性标本进行 U90基因PCR扩增、序列测定以及病毒基因特征分析。 结果:在169份幼儿急疹病例标本中，有60份标本检测为HHV-6病毒核酸阳性，获得了10条HHV-6B U90基因序列。HHV-6阳性病例主要集中在2岁以下婴幼儿，病例年龄中位数为9月龄。通过系统发育分析发现，HHV-6B可分为分支a和b。其中分支a又可进一步分为3个亚分支(亚分支a-1、a-2和a-3)，不同亚分支之间呈现一定的地域聚集性。本研究获得的10条HHV-6B序列分散在系统发育树的不同分支上，分属于亚分支a-1和a-2以及分支b。在10条序列中未发现基因重组现象。 结论:甘肃省存在着多个HHV-6B分支/亚分支病毒同时流行，病毒呈现出序列多样性。通过本研究首次阐明了甘肃地区幼儿急疹病例中HHV-6B基因特征，填补了我国HHV-6B分子流行学研究的空白，同时也为全球HHV-6B研究积累了数据。

目的 了解2011—2016年柯萨奇病毒A12型(CV-A12)青岛分离株的基因特征及所致重症手足口病临床特点.方法 人横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞和人喉癌(human laryngeal carcinoma,Hep-2)细胞分离自2011—2016年青岛地区儿童手足口病及部分疱疹性咽峡炎和流感样病例咽拭子标本中非EV-A71、非CV-A16毒株,半巢式反转录PCR扩增肠道病毒部分VP1序列,结合序列分析鉴定CV-A12毒株;对全部CV-A12分离株进行VP1基因全长序列扩增及基因序列测定,以MEGA7.0软件进行遗传进化及分子特征分析;收集CV-A12所致重症手足口病临床资料并分析其特征.结果 青岛市手足口病、疱疹性咽颊炎和儿童流感样病例中CV-A12分离率分别为0.3％(18/6798)、1.2％(2/169)和0.1％(1/676).CV-A12感染所致手足口病在2013年及以前以轻症病例为主(84.6％,11/13),2013年以后以伴有神经系统症状的住院重症病例为主(100％,5/5).VP1区遗传进化分析显示,全球CV-A12分为A、B两个基因型,2011—2016年青岛地区毒株均属于B基因型且88.9％(16/18)位于B2亚型;2013年后致手足口病重症病例毒株均为B2亚型B2b分支毒株.结论 CV-A12是青岛儿童手足口病、疱疹性咽颊炎和流感样疾病的病原之一;B2亚型毒株为近年来青岛CV-A12主要流行毒株,其感染所致手足口病能导致神经系统损害.

目的 了解2012-2015年深圳市手足口病重症患儿柯萨奇A6型肠道病毒(CVA6)VP1～VP4基因特征.方法 对2012-2015年深圳市重症手足口病样本中所有CVA6阳性样本进行VP1～VP4全长序列扩增和测序,运用DNASTAR6.0和MEGA6.02软件进行系统进化分析.结果 深圳市2012—2015年共有4例重症手足口病是由CVA6病毒感染引起的,临床表现均为发热、疱疹和无菌性脑炎等中枢神经系统症状.其中2013年深圳市CVA6重症株与2012年深圳重症株核苷酸的同源性为98.8％ ～98.9％,氨基酸同源性为99.3％ ～99.8％,共有2个氨基酸突变(VP2区的G73E和VP1区的S13G).2015年深圳市CVA6重症株与2013年重症株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.0％和99.3％,共发现6个氨基酸突变(分别为VP2区的E73G和VP1区的T5A、S27N、A30V、N137S和V242I).进化分析表明,2012-2015年深圳市引起无菌性脑炎的CVA6重症株均属于D3亚型,其中深圳市2012年CVA6重症株与2012年长沙市分离株(KJ156349)进化关系最近,深圳市2013年CVA6重症株与上海市2013年CVA6分离株(KJ612513)进化关系最近,而深圳市2015年CVA6重症株与山东省2014年潍坊株(KX752785)属于同一进化分支.结论 2012-2015年引起深圳市重症手足口病的CVA6重症株均属于D3亚型,其中2015年CVA6重症株VP1区S27N、A30V的氨基酸突变位点均位于线性B细胞抗原表位区域,V242I氨基酸突变位点位于细胞受体PSGL-1结合区域,这可能会影响CVA6重症株与细胞受体的结合力及其对人群的感染力.

目的 分析深圳市龙华区疱疹性咽峡炎病原学特点,为辖区疱疹性咽峡炎预防和控制策略的制定和调整提供科学依据.方法 采用荧光定量RT-PCR方法对手足口病哨点医院送检的疱疹性咽峡炎临床诊断病例的肛拭子样本进行肠道病毒(enteroviurs,EVs)、肠道病毒71型(enteroviurs-A71,EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)核酸检测,并对非EV-A71非CV-A16的其他肠道病毒的VP1区序列进行测定,亚型鉴定和系统进化分析.结果 临床诊断病例肛拭子样本38份中实验室确诊病例29例,确诊率为76.32％(29/38),病原谱监测共发现有9种人肠道病毒(EV-A71、CV-A16、CV-A6、CV-A10、CV-A2、CV-A4、CV-A5、Ech09和CV-B4),其中构成比占前3位的病原体分别CV-A2(24.14％,7/29)、CV-A10(20.69％,6/29)和CV-A6(17.24％,5/29).实验室确诊病例中,男性有19例(65.52％,19/29),女性有10例(34.48％,10/29);3岁以下儿童25例(86.21％,25/29).病例发病时间主要集中在4-6月份,有23例(占79.31％,23/29).系统进化树分析结果显示,CV-A6属于D3进化分支,CV-A10(66.67％)属于C进化分支,CV-A2属于D进化分支.结论 深圳市龙华区应开展疱疹性咽峡炎常规监测,重点关注3岁以下儿童,并关注病原谱构成及重要病原体进化情况.

目的 对急性脑膜炎/脑炎综合征病例病原学进行研究,为患者早期诊治提供依据.方法 采集患者血液和脑脊液标本,并进行病原学检测.采用酶联免疫吸附试验对柯萨奇病毒、埃可病毒、单纯疱疹病毒抗体和乙型脑炎病毒IgM抗体检测.采用RT-PCR检测脑膜炎奈瑟氏菌、EB病毒、腺病毒等进行检测.采用全自动微生物鉴定系统进行菌种鉴定.采用RT-PCR分析肠道病毒的亚型.全自动蛋白分析仪检测脑脊液的C反应蛋白(CRP)、胱抑素C(Cys C)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、免疫球蛋白(IgG)和S100B蛋白(S100B)并进行组间对比分析.结果 350例患者中男202例,女148例,男女比为1.36∶1.按年龄划分:＜1岁47例、1～岁90例、5～岁91例、10～岁39例、15～岁14例、20～岁17例、30～岁21例、40～岁13例、50～岁11例、≥60岁7例.按季节划分:春季92例,夏季107例,秋季66例,冬季85例.按症状划分发热、头痛、腹泻、恶心、呕吐、精神萎靡、意识障碍、嗜睡、躯体形式障碍和脑膜刺激征患者例数分别为:317、186、31、232、167、259、96、103、51和87例.病原菌检出68株,其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、其他病原菌检出数分别为:12、9、9、7、6、5、5、4和11株.病毒检出66株,其中埃可病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒、腮腺炎病毒、EB病毒、巨细胞病毒和其他病毒检出数分别为:15、12、10、6、6、5和12株.肠道病毒亚型分布:埃可病毒33型6株、埃可病毒11型5株,埃可病毒30型3株,埃可病毒9型1株;柯萨奇病毒B5型8株,柯萨奇病毒B3型4株.病毒感染者和病原菌感染者的CRP、CysC、MMP-9和lgG数据组间比对差异有统计学意义(P＜0.05).结论 5岁儿童以下是主要患病人群.夏季患者例数较多,秋季患者例数较少.病毒感染者和病原菌感染者临床检验数据存在一定差异,有助于临床诊断.

目的 建立水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(gE)的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证.方法 以VZV全病毒抗原为免疫原,通过小鼠杂交瘤融合技术筛选可稳定分泌抗VZV-gE抗体的杂交瘤细胞株,间接ELISA法检测小鼠腹水抗体效价,经HiTrapTM MabselectTMSuRe 和 HiTrapTM Desalting纯化后,12％SDS-PAGE分析单克隆抗体纯度,Western blot法检测特异性,小鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定亚型.经表位叠加试验筛选捕获抗体及酶标抗体,棋盘滴定法确定捕获抗体(0.25、0.5、1、2、5和10μg/mL)和酶标抗体(1∶500、1∶1 000、1∶2000、1∶5000和1∶10000稀释)工作浓度后,建立VZV-gE含量的双抗体夹心ELISA检测方法.验证方法的线性范围、准确性、精密性和特异性.采用建立的方法检测3批7 L生物反应器培养1-14 d的CHO-VZV-gE细胞培养上清中gE含量.结果 共获得4株稳定分泌抗VZV-gE特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株,命名为mAb-B2、mAb-11、K9C7和K9F4,小鼠腹水抗体效价为106～107,纯化后纯度约为97％,均可与VZV全病毒蛋白发生特异性结合,轻链均为κ链,重链分别为IgG2b、IgG1、IgG2b及IgG2a.确定mAb-B2作为捕获抗体,HPR标记的mAb-11作为酶标抗体,两者最佳工作浓度分别为1.5 μg/mL和1:5 000稀释.gE抗原内部参考品浓度在1.95～1 000 ng/mL范围内,与A450呈良好的线性关系,四参数方程为:Y=(0.15～3.99)/[1+(X/67.4)1.49]+3.99,R2为0.999;准确性验证回收率为94.9％～114.0％;精密性验证变异系数(CV)均＜15％;除CHO-VZV-gE细胞培养上清、水痘减毒活疫苗和带状疱疹减毒活疫苗外,其他检测样品的A450均＜0.15,无交叉反应.3批CHO-VZV-gE细胞培养上清中gE含量随培养时间的延长逐渐升高,且在14 d内与培养时间呈正相关(R2=0.995 6,P=0.000 1).结论 建立的双抗体夹心ELISA法具有良好的准确性、精密性和特异性,可用于VZV疫苗中gE抗原含量的快速检测.