目的:基于药物转运体研究天麻脑保护活性成分对羟基苯甲醛(4-HBd)、对羟基苯甲醇(4-HBA)、3,4-二羟基苯甲醛(3,4-DD)跨血脑屏障(BBB)的转运方式.方法:建立符合要求的4-HBd、4-HBA及3,4-DD于HBSS缓冲液内的HPLC分析方法;用永生化人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3)及Transwell结构建立体外BBB转运模型,通过观察细胞形态、记录跨膜电阻值及荧光素钠转运实验加以评价,进行3个成分的跨膜转运研究;通过记录给予不同BBB关键外排转运体抑制剂(维拉帕米、ko143、MK571)后转运量的变化,对比各自外排率(ER)及渗透系数(Papp),明确4-HBd、4-HBA及3,4-DD跨BBB的转运方式及特征.结果:4-HBd、4-HBA、3,4-DD在2 h内的外排率分别在0.83～0.99、0.74～0.97、0.63～0.85之间,且不同时间点3个成分的吸收速率(PappAP-BL)与外排速率(PappBL-AP)相近,三者的Papp均大于1×10-6cm·s-1,故判断4-HBd、4-HBA及3,4-DD跨BBB入脑方式为脂溶扩散;加入P-gp抑制剂维拉帕米后,4-HBd外排率降低(P＜0.05),而4-HBA及3,4-DD外排率无明显变化,故推断4-HBd为外排转运体P-gp的底物.结论:4-HBd、4-HBA及3,4-DD跨BBB方式均为脂溶扩散,其中4-HBd为P-gp外排转运体的底物.

目的 探讨丙酮醛(MGO)介导人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3 的损伤作用及机制.方法 不同浓度MGO(0.25、0.50、0.75、1.00和1.25 mmol/L)作用hCMEC/D3细胞24 h,用CCK-8法检测hCMEC/D3 细胞活力;用试剂盒检测胞内乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性.线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)荧光探针检测线粒体膜电位水平,MitoSOX荧光探针观察线粒体活性氧(mROS)产生.结果 MGO组与对照组相比,hCMEC/D3 细胞活力呈浓度依赖性下降(P＜0.01),细胞内LDH活性显著升高(P＜0.01),同时SOD活性降低(P＜0.01),差异有统计学意义.与对照组相比,MGO处理12h后的hCMEC/D3细胞经JC-1染色红绿荧光比值降低,提示MGO诱导细胞线粒体膜电位下降.MitoSOX染色后,与对照组相比,MGO处理过的hCMEC/D3细胞的红色荧光表达数量增加,提示细胞内mROS过量生成.结论 MGO降低hCMEC/D3细胞活力及线粒体膜电位,并诱导胞内mROS过量生成.

目的 小核仁RNA宿主基因(SNHG)14 对H2O2 诱导的人脑微血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响及作用机制.方法 体外培养人脑微血管内皮细胞BB19,100 μmol/L H2O2 诱导分别作用于转染SNHG14 小干扰RNA、miR-181b模拟物及共转染SNHG14 小干扰RNA与miR-181b抑制剂的BB19 细胞后,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中SNHG14 和miR-181b mRNA表达,CCK-8 和流式细胞仪分别检测细胞增殖、凋亡,Western印迹检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2 和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达,试剂盒检测细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平.双荧光素酶报告实验验证SNHG14 与miR-181b调控关系.结果 干扰SNHG14 表达或过表达miR-181b后,H2O2 诱导的BB19 细胞增殖活性、Bcl-2表达及SOD和CAT活性明显升高,细胞凋亡率、Bax表达和MDA水平明显降低(P<0.05).SNHG14 靶向负调控miR-181b表达.而与仅干扰SNHG14 表达的细胞比较,同时干扰miR-181b和SNHG14 表达的BB19 细胞经H2O2 诱导后增殖活性、Bcl-2表达及 SOD 和 CAT 活性明显降低,细胞凋亡率、Bax 表达和 MDA 水平明显升高(P<0.05).结论 干扰SNHG14 表达可能靶向负调控miR-181b抑制H2O2 诱导的人脑微血管内皮细胞凋亡和氧化应激.

目的 探讨亚低温辅助治疗缺血性脑病的分子机制.方法 将 24 只雄性 SD大鼠随机分为阴性对照组、假手术组、实验组和亚低温实验组,每组各6 只.构建大鼠的缺血再灌注模型.检测各组大鼠脑组织内炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-8、IL-6]水平,人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3)、人外周血单核细胞系(THP-1)细胞中炎症因子转录水平,hCMEC/D3 细胞凋亡率,核因子κβ(NF-κβ)、天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)、Fas蛋白的表达水平.结果 实验组、亚低温实验组处理6、24、48 h的TNF-α、IL-8、IL-6 均高于阴性对照组,且实验组高于亚低温实验组,差异均有统计学意义(P<0.05).实验组与亚低温实验组处理 4、8 h的hCMEC/D3 细胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-8 mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05).实验组与亚低温实验组处理 2、4、8 h的THP-1 细胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-8 mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05).亚低温实验组处理 1、4h的hCMEC/D3 细胞凋亡率分别为 7.0%、17.0%,分别低于实验组的12.0%、28.0%,差异均有统计学意义(P<0.05).亚低温实验组、实验组NF-κB、Caspase-3、Fas表达量均高于阴性对照组,且实验组高于亚低温实验组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 亚低温处理通过降低NF-κβ、Caspase-3 和Fas的表达发挥对缺血性脑病的辅助治疗作用.

目的 探讨胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)来源的外泌体对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)的增殖和迁移的影响.方法 培养和分离人胶质瘤U87细胞系来源的胶质瘤干细胞(GSCs),对培养的肿瘤球细胞及其诱导分化的细胞采用免疫组织化学染色的方法鉴定.然后提取胶质瘤干细胞分泌的外泌体(GSCs-exo),分别添加不同浓度的GSCs-exo(20μg/ml、40 μg/ml、60μg/ml)处理人脑微血管内皮细胞(HBMECs).在处理结束后,采用CCK-8法检测GSCs-exo对血管内皮细胞增殖的影响、Transwell小室检测GSCs-exo对细胞迁移能力的影响.结果 肿瘤球细胞培养状态下呈悬浮生长,免疫组织化学荧光染色法证明培养的肿瘤球细胞中特异性表达CD133和Nestin,其诱导分化的细胞染色可见GFAP和Neun表达阳性.随着GSCs-exo浓度的升高,促血管内皮细胞的增殖能力逐渐增强,迁移能力也大大提高(P＜0.05).结论 在胶质瘤微环境中,胶质瘤干细胞来源的外泌体可以促进血管内皮细胞的增殖和迁移,GSCs-exo可能是胶质瘤血管形成的关键因素.

目的 研究HCG11和miR-543对血肿瘤屏障通透性的作用及可能机制.方法 应用Real-time PCR检测人脑微血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)和人胶质瘤微血管内皮细胞(glioma endothelial cells,GECs)中HCG 11和miR-543的表达以及二者的结合作用.应用Lipo3000将HCG11表达沉默和/或miR-543过表达质粒载体分别转染GECs,验证转染效率后,通过测量跨内皮细胞阻抗值(transendothelial electric resistance,TEER)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)渗透量,检测血肿瘤屏障通透性.应用Real-time PCR和Western blot检测紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5的表达.荧光素梅报告基因系统分析miR-543与HCG11的结合作用.结果 HCG11在GECs中表达显著增加,miR-543在GECs中表达显著降低;HCG11表达沉默、miR-543过表达均显著降低TEER值,增加HRP渗透量,降低ZO-1、Occludin和Claudin-5的蛋白表达水平.MiR-543与HCG11存在靶向结合作用.HCG11表达沉默显著增加miR-543的表达,增加血肿瘤屏障通透性.结论 HCG11通过靶向结合miR-543调节血肿瘤屏障通透性.

目的 构建长链非编码RNA心肌梗死相关转录物(MIAT)过表达载体pcDNA3.1-MIAT,并研究其对血肿瘤屏障通透性影响.方法 从与脑胶质细胞U87共培养的人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3(GECs)提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应技术扩增出MIAT基因片段,通过无缝连接技术克隆到pcDNA3.1载体中进行序列分析,转染重组质粒pcDNA3.1-MIAT到GECs中,real-time PCR检测转染效率,应用跨内皮电阻测量系统和辣根过氧化物酶渗漏实验分析血肿瘤屏障通透性的变化.结果 成功扩增出MIAT基因,成功构建pcDNA3.1-MIAT表达载体,Blast序列分析与GenBank中NR_00349一致.转染pcDNA3.1-MIAT后,96h转染效率最高,过表达MIAT组跨内皮阻抗值最低,辣根过氧化物酶流量最高,血肿瘤屏障通透性最高.结论 成功构建pcDNA3.1-MIAT表达载体,过表达MIAT使血肿瘤屏障通透性升高.

目的 探讨抑制miR-429改善体外血脊髓屏障(blood spinal cord barrier,BSCB)通透性的可行性及机制,为改善脊髓微环境提供新的基因治疗靶点.方法 首先,取永生化人脑微血管内皮细胞系(hCMEC/D3),应用miR-429拮抗剂antagomiR-429及其阴性对照antagomiR-429-NC进行转染,通过荧光显微镜观察以及实时荧光定量PCR检测miR-429表达,验证antagomiR-429转染效率.然后观察miR-429对体外BSCB通透性的影响.实验分为4组,其中空白对照组(A组)为正常hCMEC/D3细胞、Ha-sc细胞构建BSCB模型,低氧诱导组(B组)、低氧诱导+antagomiR-429-NC组(C组)、低氧诱导+antagomiR-429组(D组)分别采用正常、antagomiR-429-NC转染以及antagomiR-429转染的hCMEC/D3细胞,与Ha-sc细胞构建BSCB模型并低氧处理12h.通过辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)通量测定体外BSCB通透性,实时荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光染色观测内皮细胞中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5的表达水平.结果 荧光显微镜下观察antagomiR-429及antagomiR-429-NC成功转染至hCMEC/D3细胞,转染效率约为90％;实时荧光定量PCR检测antagomiR-429组miR-429相对表达量为0.109±0.013,明显低于antagomiR-429-NC组的0.956±0.004 (P＜0.05).HRP通透性测量、实时荧光定量PCR及Western blot检测显示,B、C组HRP通透性明显高于A、D组,ZO-1、Occludin和Claudin-5蛋白及mRNA相对表达量均明显低于A、D组(P＜0.05);B、C组间差异无统计学意义(P＞0.05),D组尚未达A组水平(P＜0.05).免疫荧光染色观察示D组ZO-1、Occludin和Claudin-5蛋白在细胞膜边界免疫荧光较B、C组增强,但尚未达A组强度.结论 通过抑制miR-429表达可促进微血管内皮细胞中ZO-1、Occludin和Claudin-5蛋白表达,进而改善因低氧导致的BSCB通透性增高.

目的:探究人参皂苷Rbl在脂多糖(LPS)诱导的人脑微血管细胞模型中对脑细胞膜通透性的影响.方法:采用噻唑蓝比色法(MTT)及乳酸脱氢酶(LDH)释放检测不同浓度人参皂苷Rbl对LPS刺激人脑微血管内皮细胞系(HBMEC)存活率的影响;采用EVOM法检测HBMEC细胞通透性;采用Griess法、ELISA法及DAF-FM DA荧光探针分别检测NO、ONOO-含量及eNOS、iNOS活性;Western blot法检测p-eNOS(ser1177)、iNOS蛋白的表达水平.结果:与正常对照组比较,LPS(5μg/mL)可明显降低HBMEC细胞存活率(P＜0.01);与LPS组比较,随着人参皂苷Rbl浓度的增加细胞存活率明显升高,且中、高剂量组(40、80μmol/L)具有显著性差异(P＜0.01、P＜0.01);LPS导致HBMEC单层细胞电阻值明显降低(P＜0.01),人参皂苷Rbl高剂量组(80μmol/L)可显著抑制LPS所致的细胞膜通透性升高(P＜0.05);LPS可明显降低HBMEC细胞NO含量(P＜0.01)升高ONOO-含量(P＜0.05),人参皂苷Rb1中、高剂量组(40、80 μmol/L)较LPS组具有显著升高NO含量,降低ONOO-含量的作用(P＜0.05);与正常对照组比较,LPS组可明显降低HBMEC细胞磷酸化eNOS (ser1177)蛋白的表达水平,而显著升高iNOS蛋白表达水平(P＜0.01).人参皂苷Rb1高剂量组(80 μmol/L)较LPS组可显著升高p-eNOS(ser 1177)蛋白的表达水平,降低iNOS蛋白的表达水平(P＜0.05).结论:人参皂苷Rb1可有效降低iNOS活性,升高eNOS活性继而减少NO水平及ONOO-含量,显著降低LPS导致的脑细胞膜通透性升高.

目的 探讨内皮细胞对髓母细胞瘤干细胞特性的影响及机制.方法 实验分为3组,A组:D341Med(D341髓母细胞瘤系);B组:D341Med+HBMECs[D341髓母细胞瘤系和人脑微血管内皮细胞(human brain microvasculature endothelial cells,HBMECs)共培养];C组:D341Med+HBMECs+DAPT[D341髓母细胞瘤系和人脑微血管内皮细胞以及γ-分泌酶抑制剂(DAPT)共培养],成球试验和流式细胞仪检测CD133+细胞,观察对肿瘤干细胞的影响.采用实时定量PCR和Western印迹法检测Notch(Notch 2、Jagded 1、Hes-1和Hey-2)mRNA和蛋白的表达,Transwell侵袭试验检测内皮细胞对肿瘤侵袭能力的影响,裸鼠成瘤试验观察肿瘤细胞的生长.结果 与A组相比,B组成球数目和CD133+细胞增加(P<0.01),Notch相关mRNA和蛋白表达水平增加(P<0.05);Transwell侵袭试验显示,穿膜细胞数明显增高(P<0.05);裸鼠的肿瘤体积增大(P<0.05).与B组相比,C组干细胞标记CD133+细胞急剧下降(P<0.05),Notch相关mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05);Transwell侵袭试验显示,穿膜细胞数明显下降(P<0.05);裸鼠的肿瘤体积缩小(P<0.05).结论 内皮细胞可能通过激活Notch通路调控髓母细胞瘤干细胞特性.