目的:基于药物转运体研究天麻脑保护活性成分对羟基苯甲醛(4-HBd)、对羟基苯甲醇(4-HBA)、3,4-二羟基苯甲醛(3,4-DD)跨血脑屏障(BBB)的转运方式.方法:建立符合要求的4-HBd、4-HBA及3,4-DD于HBSS缓冲液内的HPLC分析方法;用永生化人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3)及Transwell结构建立体外BBB转运模型,通过观察细胞形态、记录跨膜电阻值及荧光素钠转运实验加以评价,进行3个成分的跨膜转运研究;通过记录给予不同BBB关键外排转运体抑制剂(维拉帕米、ko143、MK571)后转运量的变化,对比各自外排率(ER)及渗透系数(Papp),明确4-HBd、4-HBA及3,4-DD跨BBB的转运方式及特征.结果:4-HBd、4-HBA、3,4-DD在2 h内的外排率分别在0.83～0.99、0.74～0.97、0.63～0.85之间,且不同时间点3个成分的吸收速率(PappAP-BL)与外排速率(PappBL-AP)相近,三者的Papp均大于1×10-6cm·s-1,故判断4-HBd、4-HBA及3,4-DD跨BBB入脑方式为脂溶扩散;加入P-gp抑制剂维拉帕米后,4-HBd外排率降低(P＜0.05),而4-HBA及3,4-DD外排率无明显变化,故推断4-HBd为外排转运体P-gp的底物.结论:4-HBd、4-HBA及3,4-DD跨BBB方式均为脂溶扩散,其中4-HBd为P-gp外排转运体的底物.

目的 微小核糖核酸-589-5p(miRNA-589-5p)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)3对氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞(HBMEC)损伤的影响,并探索其潜在的作用机制.方法 HBMEC细胞分为对照组、氧糖剥夺组;运用脂质体法将氧糖剥夺+miRNA-con组(转染miRNA-con)、氧糖剥夺+miRNA-589-5p组(转染miRNA-589-5p的模拟物序列)、氧糖剥夺+miRNA-si-con组(转染 miRNA-si-con)、氧糖剥夺+si-HDAC3 组(转染 si-HDAC3)、氧糖剥夺+miRNA-589-5p+pcDNA 组(共转染 miRNA-589-5p的模拟物序列和 pcDNA)、氧糖剥夺+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3 组(共转染 miRNA-589-5p mimics 和 pcDNA-HDAC3)转染至HBMEC,并行氧糖剥夺处理;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western印迹检测细胞中miRNA-589-5p、HDAC3 mRNA表达和HDAC3、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase-3)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2、核因子2相关因子(NRF)2、血红素氧合酶(HO)-1蛋白表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH);膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)试剂盒检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞荧光活性.结果 与对照组相比,氧糖剥夺组细胞miRNA-589-5p表达水平明显降低,HDAC3表达、LDH、细胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达、NRF2/HO-1信号通路关键基因NRF2核蛋白/PCNA、HO-1蛋白表达均显著降低(P＜0.05);过表达miRNA-589-5p或沉默HDAC3均可明显抑制氧糖剥夺对HBMEC细胞上述指标的调控.双荧光素酶报告实验显示,miRNA-589-5p明显抑制野生型HDAC3细胞的荧光活性,并负向调控HDAC3的蛋白表达.过表达HDAC3部分逆转过表达miRNA-589-5p对氧糖剥夺诱导HBMEC细胞的LDH、凋亡的抑制和NRF2/HO-1信号通路的激活作用.结论 miRNA-589-5p抑制氧糖剥夺对HBMEC细胞的损伤,其作用机制与靶向HDAC3,激活NRF2/HO-1信号通路有关.

目的 探讨番茄红素(LYC)调节RAS同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关激酶(ROCK)信号通路对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的脑血管内皮细胞(EC)凋亡的影响.方法 未做任何处理的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)设为NC组;采用ox-LDL处理的HBMECs分为ox-LDL组、LYC组(0.5 μmol/L的LYC处理HBMECs)、溶血磷脂酸(LPA)组(5 μmol/L RhoA/ROCK 信号通路激活剂 LPA 处理 HBMECs)、LYC+LPA 组(0.5 μmol/L 的 LYC 以及 5 μmol/L LPA 共同处理HBMECs);处理24 h后用于后续实验.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBMECs细胞因子水平;CCK-8法检测HBMECs增殖;流式细胞术检测HBMECs凋亡率;Western blot检测细胞血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)、平滑肌(SM)22a、BCL-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-Caspase-3)、RhoA/ROCK通路相关蛋白表达.结果 与NC组相比,ox-LDL组单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素(IL)-6、血管内皮细胞黏附分子 1(VCAM-1)、HBMECs 凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22a、RhoA、ROCK1 蛋白水平升高,OD 值、Bcl-2、CD31蛋白水平下降,差异有统计学意义(P＜0.05);与ox-LDL组相比,LYC组MCP-1、IL-6、VCAM-1、HBMECs凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22a、RhoA、ROCK1蛋白水平降低,OD值、Bcl-2、CD31蛋白水平升高,差异有统计学意义(P＜0.05),而LPA组趋势相反;LPA减弱了 LYC对ox-LDL诱导的HBMECs凋亡的改善作用.结论 LYC可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路来减轻HBMECs凋亡.

目的 探索绞股蓝总苷对氧糖剥夺诱导的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)氧化应激反应的影响.方法 体外培养HBMEC,使用不同绞股蓝总苷浓度 10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L干预HBMEC,通过CCK8 法筛选绞股蓝总苷最佳剂量.建立氧糖剥夺(OGD)模型,将细胞随机分为Control组、OGD组、OGD+GP(绞股蓝总苷)组.Control组用含 10%FBS的DMEM培养基常规培养24 h,OGD组、OGD+GP组进行OGD培养24 h,使用荧光显微镜检测活性氧(ROS)水平,Western Blot检测超氧化物歧化酶(SOD)、醌NAD(P)H脱氢酶 1(NQO1)蛋白水平,qRT-PCR检测SOD、NQO1 的mRNA水平.结果 与 Control组比较,5 组绞股蓝总苷浓度(10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L)干预后 HBMEC 活力无明显差异(P>0.05);与 OGD 组比较,绞股蓝总苷浓度为10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的干预后HBMEC活力差异有统计学意义(P<0.05),而绞股蓝总苷浓度为 100 mg/L干预后细胞活力较高,因此绞股蓝总苷最佳剂量为 100 mg/L.OGD 条件下,绞股蓝总苷降低HBMEC的ROS表达;与OGD组比较,使用绞股蓝总苷干预后,HBMEC的SOD和NQO1 蛋白及水平mRNA均升高(P均<0.05).结论 绞股蓝总苷对OGD后的HBMEC有抗氧化应激作用,其机制可能与降低ROS,上调SOD、NQO1水平有关.

目的 探讨丙酮醛(MGO)介导人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3 的损伤作用及机制.方法 不同浓度MGO(0.25、0.50、0.75、1.00和1.25 mmol/L)作用hCMEC/D3细胞24 h,用CCK-8法检测hCMEC/D3 细胞活力;用试剂盒检测胞内乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性.线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)荧光探针检测线粒体膜电位水平,MitoSOX荧光探针观察线粒体活性氧(mROS)产生.结果 MGO组与对照组相比,hCMEC/D3 细胞活力呈浓度依赖性下降(P＜0.01),细胞内LDH活性显著升高(P＜0.01),同时SOD活性降低(P＜0.01),差异有统计学意义.与对照组相比,MGO处理12h后的hCMEC/D3细胞经JC-1染色红绿荧光比值降低,提示MGO诱导细胞线粒体膜电位下降.MitoSOX染色后,与对照组相比,MGO处理过的hCMEC/D3细胞的红色荧光表达数量增加,提示细胞内mROS过量生成.结论 MGO降低hCMEC/D3细胞活力及线粒体膜电位,并诱导胞内mROS过量生成.

目的 小核仁RNA宿主基因(SNHG)14 对H2O2 诱导的人脑微血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响及作用机制.方法 体外培养人脑微血管内皮细胞BB19,100 μmol/L H2O2 诱导分别作用于转染SNHG14 小干扰RNA、miR-181b模拟物及共转染SNHG14 小干扰RNA与miR-181b抑制剂的BB19 细胞后,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中SNHG14 和miR-181b mRNA表达,CCK-8 和流式细胞仪分别检测细胞增殖、凋亡,Western印迹检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2 和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达,试剂盒检测细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平.双荧光素酶报告实验验证SNHG14 与miR-181b调控关系.结果 干扰SNHG14 表达或过表达miR-181b后,H2O2 诱导的BB19 细胞增殖活性、Bcl-2表达及SOD和CAT活性明显升高,细胞凋亡率、Bax表达和MDA水平明显降低(P<0.05).SNHG14 靶向负调控miR-181b表达.而与仅干扰SNHG14 表达的细胞比较,同时干扰miR-181b和SNHG14 表达的BB19 细胞经H2O2 诱导后增殖活性、Bcl-2表达及 SOD 和 CAT 活性明显降低,细胞凋亡率、Bax 表达和 MDA 水平明显升高(P<0.05).结论 干扰SNHG14 表达可能靶向负调控miR-181b抑制H2O2 诱导的人脑微血管内皮细胞凋亡和氧化应激.

目的 考察长链非编码RNA(lncRNA)LOXL1反义RNA 1(LOXL1-AS1)对氧糖剥夺(OGD)诱导的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)凋亡和炎性因子表达的影响与机制.方法 将HBMEC分为对照组(正常培养)、OGD组(OGD损伤)、OGD+si-NC组(转染si-NC+OGD损伤)、OGD+si-LOXL1-AS1组(转染si-LOXL1-AS1+OGD损伤)、OGD+miR-NC组(转染miR-NC+OGD损伤)、OGD+miR-761组(转染miR-761 mimic+OGD损伤)、OGD+si-LOXL1-AS1+阴性对照组(转染si-LOXL1-AS1与anti-miR-NC+OGD损伤)、OGD+si-LOXL1-AS1+miR-761抑制剂组(转染si-LOXL1-AS1与miR-761 inhibitor+OGD损伤).RT-qPCR检测LOXL1-AS1和miR-761表达,CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测炎性因子白细胞介素-6 IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平.双荧光素酶报告实验检测LOXL1-AS1和miR-761的互补结合.结果 与对照组相比,OGD组HBMEC的LOXL1-AS1表达量、凋亡率、Bax表达量、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,存活率、Bcl-2表达量减少(均P＜0.05).抑制LOXL1-AS1后,与OGD组或OGD+si-NC组相比,OGD+si-LOXL1-AS1组HBMEC的LOXL1-AS1表达量、凋亡率、Bax表达量、IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低,存活率、Bcl-2表达量增加(均P＜0.05).LOXL1-AS1靶向调控miR-761.过表达miR-761后,OGD+miR-761组HBMEC的存活率、Bcl-2表达量比OGD+miR-NC组增加,凋亡率、Bax表达量、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均比OGD+miR-NC组降低(均P＜0.05).OGD+si-LOXL1-AS1+miR-761抑制剂组HBMEC的存活率、Bcl-2表达量低于OGD+si-LOXL1-AS1+阴性对照组,凋亡率、Bax表达量、IL-6、IL-1β和TNF-α水平高于OGD+si-LOXL1-AS1+阴性对照组(均P＜0.05).结论 抑制LOXL1-AS1表达可通过靶向上调miR-761促进OGD诱导的HBMEC细胞存活并抑制凋亡和炎性因子表达.

目的 探讨亚低温辅助治疗缺血性脑病的分子机制.方法 将 24 只雄性 SD大鼠随机分为阴性对照组、假手术组、实验组和亚低温实验组,每组各6 只.构建大鼠的缺血再灌注模型.检测各组大鼠脑组织内炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-8、IL-6]水平,人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3)、人外周血单核细胞系(THP-1)细胞中炎症因子转录水平,hCMEC/D3 细胞凋亡率,核因子κβ(NF-κβ)、天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)、Fas蛋白的表达水平.结果 实验组、亚低温实验组处理6、24、48 h的TNF-α、IL-8、IL-6 均高于阴性对照组,且实验组高于亚低温实验组,差异均有统计学意义(P<0.05).实验组与亚低温实验组处理 4、8 h的hCMEC/D3 细胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-8 mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05).实验组与亚低温实验组处理 2、4、8 h的THP-1 细胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-8 mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05).亚低温实验组处理 1、4h的hCMEC/D3 细胞凋亡率分别为 7.0%、17.0%,分别低于实验组的12.0%、28.0%,差异均有统计学意义(P<0.05).亚低温实验组、实验组NF-κB、Caspase-3、Fas表达量均高于阴性对照组,且实验组高于亚低温实验组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 亚低温处理通过降低NF-κβ、Caspase-3 和Fas的表达发挥对缺血性脑病的辅助治疗作用.

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)血管生成的影响,并阐明其潜在的分子机制.方法:采用生物信息学方法预测MALAT1、不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)和血管内皮生长因子A(VEGFA)的结合位点.HBMECs进行OGD/R处理构建脑缺血细胞模型,分为对照组、OGD/R模型组、OGD/R+siNC组、OGD/R+沉默MALAT1(OGD/R+siMALAT1)组和OGD/R+siMALAT1+过表达VEGFA(OGD/R+siMALAT1+VEGFA)组.采用小干扰RNA(siRNA)沉默MALAT1的表达,采用pcDNA载体构建VEGFA过表达载体,将构建的siMALAT1和pcDNA VEGFA载体分别或同时转染至HBMECs中.利用管形成实验检测各组细胞血管形成能力,Western blotting法检测各组细胞中VEGFA蛋白表达水平.6周龄健康雄性C57BL/6 J小鼠20只,随机分为假手术组、大脑中动脉闭塞(MCAO)模型组、MCAO+NC空载体(MCAO+NC)组和MCAO+过表达MALAT1(MCAO+MATAL1)组,每组5只,除假手术组外,其余各组小鼠利用线栓法构建MCAO小鼠模型,MCAO+NC组和MCAO+MATAL1 组小鼠右脑室内分别注射NC空载体和MALAT1过表达载体.采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测各组小鼠脑梗死面积百分率,Western blotting法检测各组小鼠脑组织中VEGFA蛋白表达水平.结果:生物信息学预测,MALAT1与hnRNPK及hnRNPK与VEGFA均存在结合位点.管形成实验和Western blotting法检测,与对照组比较,OGD/R模型组细胞成管数明显增加(P<0.01),细胞中VEGFA蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与OGD/R模型组比较,OGD/R+siMALAT1组细胞成管数明显减少(P<0.01),细胞中VEGFA蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与OGD/R+siMALAT1 组比较,OGD/R+ siMALAT1+VEGFA组细胞成管数明显增加(P<0.01),细胞中VEGFA蛋白表达水平明显升高(P<0.01).在MCAO模型小鼠实验中,TTC染色和Western blotting法检测,与假手术组比较,MCAO模型组小鼠脑梗死面积百分率和脑组织中VEGFA蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与MCAO模型组比较,MCAO+MALAT1组小鼠脑梗死面积百分率明显降低(P<0.01),脑组织中VEGFA蛋白表达水平明显升高(P<0.01).结论:LncRNA MALAT1可增强靶基因VEGFA的稳定性并上调其表达,进而促进缺血性脑卒中小鼠的脑血管生成,为缺血性脑卒中的治疗提供了新的思路.

目的 探讨RNA结合蛋白MOV10在阿尔茨海默病人脑组织及Aβ处理的人脑微血管内皮细胞和神经元中的表达变化.方法 应用real-time PCR和Western blot检测MOV10的表达变化.结果 RNA结合蛋白MOV10在阿尔茨海默病人脑组织中,在Aβ处理的人脑微血管内皮细胞和神经元中高表达.结论 RNA结合蛋白MOV10可能参与调控阿尔茨海默病的病理过程.