目的:阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea and hypopnea syndrome, OSAHS)是一种睡眠疾病，对体内代谢有多方面的影响，生物标志物研究成为热点和方向。但是很多蛋白表达本身存在昼夜变化，本研究拟对早晚采样时间点蛋白差异变化进行探索性研究。方法:研究对象是经整夜睡眠监测确定为非OSAHS的无鼾成年男性28例。采集整夜睡眠监测前后的早晚唾液样本。每份唾液样本中都加入内参蛋白(牛胎球蛋白和酿酒酵母乙醇脱氢酶)，同步进行平行反应监测(parallel reaction monitoring，PRM)，通过靶向蛋白质组学方法定量分析98种与OSAHS相关的唾液蛋白。结果:唾液蛋白的个体差异较大，总计平均变异系数为95.9%，其95%置信区间为(84.7%，107.2%)。以差异倍数>2倍且 P<0.05的标准筛选早晚差异表达蛋白，得到早晨表达上调蛋白有13个，未见下调蛋白，表达无差异蛋白72个。无表达差异蛋白主要为细胞骨架蛋白及相关结合蛋白、氧化应激相关蛋白、免疫炎症相关蛋白和代谢相关蛋白等。表达差异蛋白功能涉及方面较广，包括机体免疫、血管生成、物质与能量代谢、神经发育和钙离子结合等。 结论:本研究发现部分唾液蛋白存在早晚明显差异，提示无鼾正常男性部分唾液蛋白的昼夜节律性变化。研究OSAHS患者生物标志物时，应考虑部分唾液蛋白固有的昼夜节律特性，规定时间段采样，并推荐早晚都进行采样。

目的 利用液态活检技术,寻找合适的外泌体miRNA肿瘤生物标志物,用于肺结节良恶性鉴别诊断.方法 选取2019年1月—12月安徽省第二人民医院初诊肺癌术后的24对肺癌组织及癌旁组织样本,筛选出差异性表达的miRNA标志物miR-19b和miR-126.选取2020年1月—2022年12月初诊肺恶性结节患者58例为观察组,良性结节患者31例为对照组,检测血浆外泌体miR-19b、miR-126在两组的表达量,以miR-16为内参,分析血浆外泌体miR-19b和miR-126表达量差异在肺结节良恶性鉴别中的应用价值.结果 肺癌组织中miR-19b表达水平为(45.91±13.73),与癌旁组织(11.61±3.87)相比显著升高(P＜0.05);miR-126表达水平为(0.70±0.22),与癌旁组织(2.56±0.75)相比显著降低(P＜0.05).miR-19b和miR-126在观察组血浆外泌体表达水平分别为(1.83±0.49)和(0.83±0.26),显著高于对照组[(0.93±0.31)和(0.40±0.12)](P＜0.05);血浆外泌体miR-19b在观察组和对照组鉴别的曲线下面积[AUC:0.808(95％CI:0.718～0.898,P＜0.001)],取 cutoff 值为 0.936,灵敏度为 82.8％,特异性为 64.5％,高于miR-126的检测.对miR-19b和miR-126相对定量值进行秩和检验,按肿瘤大小和肿瘤浸润性分组,miR-19b表达水平有显著性差异(P＜0.05),按肿瘤浸润性分组,miR-126表达水平有显著性差异(P＜0.05).结论 血浆外泌体miR-19b、miR-126的表达量值可辅助鉴别肺结节良恶性.

目的:探究血人参根和根瘤内生细菌的组成差异,筛选优势内生菌菌株.方法:通过对16S rRNA基因进行高通量测序,对血人参根及根瘤中内生菌进行物种注释、分类、物种多样性和组间差异分析.结果:血人参根和根瘤内生菌总计含有5 574个OTU,隶属于30门79纲192目324科587属.根部的内生菌总计有5 518个OTU,在门分类水平上相对丰度较高的主要为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteriota,在属水平上相对丰度较高的为游动放线菌属Actinoplanes和norank_f_Kineosporiaceae属,其平均相对丰度分别为18.60％、10.05％;根瘤中内生菌总计有895个OTU,在门分类水平上相对丰度较高的为变形菌门Proteobacteria,在属水平上慢生根瘤菌属Bradyrhizobium占据绝对优势,其平均相对丰度为97.87％.血人参根瘤中内生菌的Shannon、ACE及Chao指数均显著低于根中(P＜0.05).根瘤内参与氨基酸的转运和代谢,细胞的复制、重组和修复,细胞的生物发生等功能菌群相对丰度较高.结论:血人参根瘤中内生菌以埃氏慢生根瘤菌和大豆慢生根瘤菌为主,且与根部相比,物种多样性水平低、群落结构更为单一、物种分布不均匀.

目的 开发快速、简便、可大规模对病毒进行筛选的核酸检测方法.方法 通过集液滴生成、循环扩增、信号读取为一体的液滴数字聚合酶链反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)系统,以严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(se-vere acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的 ORF1ab和 N基因为靶序列,以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyc-eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参基因,进行核酸扩增并监测每个液滴的荧光信号.结果 一体式DDPCR仪实现了"样本进-结果出"的简易操作.其水油体系与 SARS-CoV-2 检测试剂盒中试剂兼容,至扩增结束液滴稳定未融合,实现了实时检测区分出大量液滴中不同的荧光信号.恒温扩增条件下,最早可在第 9min 观察到带有三重荧光信号(FAM、HEX、CY5)的液滴.扩增过程中的实时荧光信号通过拟合后与实时荧光定量聚合酶链反应扩增曲线类似,包括基线期、指数期和平台期.各基因几百个液滴的扩增曲线显示,各液滴中无特异性扩增,同时 Ct值分析结果显示,最早可在第 12min 得到扩增信号,达到鉴别目的.结论 一体式 ddPCR仪操作简便,液滴中反应迅速,可达到快速检测的目的.恒温扩增对反应设备要求较低,可大规模批量反应,同时拍照式信号采集可记录大量液滴的荧光信号,达到大规模筛选的目的.

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响.本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性.结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异.不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据.

目的 分析刚地弓形虫感染对小鼠脑组织转录本的N6-甲基腺苷(m6A)甲基化修饰水平的影响.方法 20只雌性C57BU6J小鼠随机分为TgCtwh6感染组(7只)、LHG感染组(7只)和对照组(TgCtwh6感染组、LHG感染组的对照各3只).TgCtwh6感染组、LHG感染组分别灌胃接种中国Ⅰ型wh6株(TgCtwh6)和中国Ⅲ型LHG株刚地弓形虫感染小鼠脑组织悬液0.2 ml(20个包囊/鼠),对照组灌胃等量的生理盐水.分别在接种后15、30和45 d,用抽签法随机抽取感染组小鼠各1只,麻醉后处死,取脑组织,于显微镜下分别记录大脑皮层区、海马区和嗅球区的包囊数.感染后45 d每组分别取3只小鼠的全脑组织,提取总RNA,制备基因组文库,进行转录组测序,筛选差异甲基化位点(DML),统计感染组和对照组的mRNA的差异m6A甲基化位点及其所在转录本;对甲基化位点所在转录本进行基因本体功能注释(GO)分析,京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,对甲基化差异转录本进行基因集富集分析(GSEA).选取甲基转移酶样3(METTL3)、肥胖相关蛋白(FTO)和YTH结构域3(YTHDF3)等3种m6A甲基化修饰蛋白基因,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为内参,实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测其相对转录水平.结果 感染组小鼠均感染成功.感染后45 d,大脑皮层、海马和嗅球的包囊数分别为(5 676±10)、(4 773±9)、(243±10)个.感染组和对照组共检出760 650个甲基化位点,其中GGACA、GGACC、GGACT、ACGAT等4种 m6A模体的甲基化水平分别占 16.8％(127 923/760 650)、4.6％(35 164/760 650)、3.8％(28 983/760 650)和0.4％(3 122/760 650);共检出高甲基化位点所在转录本127 016条,其中GGACA、GGACC、GGACT和ACGAT所在的转录本分别为71 727、27 754、24 556和2 979条.感染组与对照组小鼠脑组织转录组中ACGAT、GGACA、GGACC、GGACT等4种m6A模体的DML位点总数为9 233,其中高甲基化位点4 832个,低甲基化位点4 851个.GO分析结果显示,DML所在转录本显著富集于生物过程中的细胞过程、细胞组分中的细胞和分子功能中的结合等功能.DML所在转录本的KEGG富集分析结果显示,分子间相互作用网络主要富集在溶酶体、剪接体和多巴胺能突触信号通路等途径中.对生物过程的GO富集分析结果显示,DML所在的转录本中,生物过程相关的部分转录本主要富集于蛋白糖基化、神经元凋亡负调控、蛋白质的入核转运等过程.GSEA分析结果显示,对照组和两个感染组的组间差异甲基化高分富集于成纤维细胞增殖负调控通路和Hippo信号通路相关的转录本子集中,其中筛选出 ENSMUST00000105393、ENSMUST00000006523、ENSMUST00000055261和ENSMUST00000038658等4个关键转录本,分别编码共刺激因子配体(ICOSL)、富含半胱氨酸肠蛋白1(CRIP1)、MOB激酶激活剂1A201(MOB1A201)和MOB1A202,与对照组相比,TgCtwh6感染组、LHG感染组的这4个基因表达均上调.qRT-PCR结果显示,TgCtwh6感染组、LHG感染组小鼠脑组织mettl3mRNA相对表达水平分别为5.47±1.09、1.63±0.06,与对照组(1.01±0.11)比较差异均有统计学意义(t=4.05、5.03,均P＜0.05);ythdf3 mRNA相对表达水平分别为3.57±0.08、1.80±0.25,与对照组(1.01±0.11)比较差异均有统计学意义(t=18.95、2.85,均 P＜0.05);fto mRNA 相对表达水平分别为 0.41±0.04、0.60±0.12,与对照组(1.00±0.06)比较差异有统计学意义(t=7.67、2.99,均P＜0.05);qRT-PCR结果与转录组测序获得的转录趋势一致.结论 弓形虫慢性感染可导致小鼠脑组织转录本m6A甲基化修饰水平升高,并可能通过对icosl、crip1和mob1a等关键差异转录本的修饰调控,造成宿主脑组织内与精神行为相关的生物学进程和信号通路的改变.

本研究以皱环球盖菇Stropharia rugosoannulata不同发育时期(菌丝期、原基期、幼菇期、小菇期、成熟期)、不同组织部位(菌盖、菌柄、菌褶)和不同颜色菌盖(红色、黄色、白色)为试验材料,选择 10个内参基因(ACT、GAPDH、TEF、RPL4、PGI、PGM、RPB2、β-TUB、α-TUB、UBQ)并设计跨内含子的引物,采用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)技术进行扩增,利用 geNorm、NormFinder、BestKeeper 和 ΔCt 算法进行表达稳定性分析以及综合评价算法 ReFinder 进行加权评比,最终筛选适宜各类样本的内参基因.根据内参基因稳定性的最终排名,最适宜作为不同颜色菌盖内参基因的组合是UBQ和GAPDH,最不适宜的是ACT、PGI和TEF;最适宜作为子实体不同组织部位内参基因的组合是UBQ和RPB2,最不适宜的是ACT、RPL4 和TEF;最适宜作为不同发育时期内参基因的组合是ACT和RPB2,最不适宜的是GAPDH、α-TUB和β-TUB.

研究旨在探明梭梭(Haloxylon ammodendron)不同非生物胁迫下稳定表达的内参基因,为后续梭梭抗逆性相关基因功能研究奠定基础.采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术从梭梭转录组数据库中检测了GAPDH、EF1-α、UBC、RPL32、ALB、50S-1721、50S-1063、RPⅡ、H3、PP2A、SOD、HSC70、TUA 和TUB 14个候选内参基因在热胁迫、干旱、盐、ABA和昼夜节律条件下的表达变化,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件对梭梭候选内参基因的稳定性进行评价,最终筛选出合适的内参基因,并通过对梭梭磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)基因表达分析,验证不同内参基因对试验结果的影响.4种软件分析得到的最优内参基因存在差异,在RefFinder网站上综合排序分析表明,在ABA处理和昼夜节律下,ALB是最优内参基因,RPⅡ基因在干旱胁迫下表达最稳定,TUB和RPⅡ基因在盐胁迫下最适用,H3基因在热胁迫下表达最为稳定.各种胁迫下最适宜的内参基因为ALB和RPL32.计算几何平均值得14个候选内参基因的综合稳定性排名,其中排名前2位的基因分别为SOD和RPL32.综上,SOD和RPL32可作为梭梭qRT-PCR标准化的内参基因.

川赤芍与芍药共同作为《中国药典》著名药材赤芍的基原植物,具有重要的药用价值,且在花卉市场的潜力巨大.筛选稳定可靠的内参基因是开展川赤芍分子研究的必要前提.该研究从川赤芍的转录组数据中选取Actin和GAPDH 2 个内参基因作为候选基因,利用实时荧光定量技术(qRT-PCR)检测 2 个候选基因在川赤芍的不同组织(韧皮部、木质部、茎、叶、叶柄、子房)和不同生长时期(萌动期、开花期、休眠期)的表达水平,然后利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCT和RefFinder综合分析 2 个内参基因表达的稳定性,结果表明Actin和GAPDH在川赤芍不同组织和不同生长时期中的表达模式均稳定.该研究进一步检测川赤芍转录组数据中 8 个基因(Pv-TPS01、Pv-TPS02、Pv-CYP01、Pv-CYP02、Pv-CYP03、Pv-BAHD01、Pv-UGT01、Pv-UGT02)在不同组织中的表达水平,结果表明,以Actin和GAPDH 分别作为内参基因,8 个基因在川赤芍不同组织部位的表达趋势均一致,验证了Actin和GAPDH作为川赤芍内参基因的可靠性.综上,该研究发现Actin和GAPDH可作为川赤芍不同组织和不同生长时期中基因表达水平研究的内参基因.

目的 筛选血痕中与其形成时间(time since deposition,TSD)具有相关性的RNA生物标志物并构建血痕形成时间推断模型.方法 从文献筛选 12 个候选RNA生物标志物(ALAS2、B2M、HBA、HBB、PPIA、ACTB、GAPDH、SPTB、SNORD24、SNORD38B、5S rRNA、18S rRNA),以let-7g-5p为内参基因,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qRCR)技术检测 10 名健康无关个体在 7 个时间节点的 70 份血痕样本,候选RNA生物标志物在 0～180 d范围内的相对表达丰度,筛选与形成时间相关性高的RNA生物标志物,以此构建用于血痕形成时间推断的多元线性回归模型并验证.结果 通过GraphPad Prism和SPSS Statistic 22 软件对候选RNA生物标志物的?Cq值(?Cq = Cq 生物标志物-Cq let-7g-5p)进行正态分布分析和相关性分析,确认PPIA、ACTB、GAPDH、ALAS2、B2M、HBA、18S rRNA和HBB这 8 个RNA生物标志物与血痕形成时间具有相关性.根据模型构建需要,选择向后回归法分别基于8个、4 个、2个RNA生物标志物构建血痕形成时间推断多元线性回归模型,通过留一法对模型进行验证,选取实验样本和案件样本对模型推断效果进行测试,确定模型平均绝对偏差(Mean absolute deviation,MAD).结论 本研究构建和验证了用于血痕形成时间推断的基于多个RNA生物标志物的多元线性回归模型,并使用案件样本进行了测试,评估了模型的实战应用潜力.