开展氮沉降对森林土壤-微生物-胞外酶化学计量特征影响的研究,可为理解氮沉降对森林生态系统元素循环和养分限制的影响提供理论基础.本研究以云南松林为对象,于2019年开始进行氮沉降模拟试验,设置对照(CK,0g N·m-2·a-1)、低氮(LN,10 g N·m-2·a-1)、中氮(MN,20 g N·m-2·a-1)、高氮(HN,25 gN·m-2·a-1)4个处理,于2022年9月采集土壤样品(分为0～5、5～10、10～20 cm 土层)测定土壤有机碳、全氮、全磷、微生物生物量碳氮磷(MBC、MBN、MBP)以及碳氮磷获取酶活性.结果表明:与对照相比,氮沉降显著抑制了土壤有机碳含量、C∶N和C∶P,降幅分别为6.9％～29.8％、7.6％～45.2％和6.5％～28.6％;促进了土壤全氮含量和N∶P,增幅分别为10.0％～45.0％和19.0％～46.0％;对土壤全磷含量则无显著影响;除土壤C∶N和C∶P外,土壤养分含量及化学计量比均在0～5cm 土层最高.MN和HN处理显著抑制了土壤MBN,降幅为11.0％～12.7％,氮沉降下土壤MBC和MBP及相关计量比无显著变化;0～5 cm 土层的土壤微生物养分含量显著高于其余土层.氮沉降显著抑制了纤维素二糖水解酶和亮氨酸氨基肽酶活性(降幅为14.5％～16.2％和48.7％～66.3％);HN处理促进了 β-1,4-葡萄糖苷酶活性(增幅68.0％),但抑制了土壤酶化学计量碳氮比和氮磷比(降幅95.4％和88.4％);LN和MN处理促进了 β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性(增幅68.3％～116.6％),但抑制了土壤酶化学计量碳磷比(降幅14.9％～29.4％);碱性磷酸酶活性无显著变化;土壤酶活性均随土层加深而显著降低.相关性分析表明,土壤全氮、全磷、微生物养分与矢量角度(表征微生物氮或磷限制)均呈显著负相关,而矢量长度(表征微生物碳限制)与矢量角度始终呈显著正相关,代表微生物碳限制与磷限制之间协同促进.氮沉降在缓解云南松林微生物氮限制的同时逐渐向磷限制转变,此外,研究区还受到微生物碳限制,且微生物碳和磷限制的关系呈正比.

2020年,依据现代生命科学研究成果及发展趋势,笔者课题组首次提出中药道地性可表现为道地药材具有"优形、优质、优效"(excellent shape,high quality,and superior effect,简称"三优")特征,拓宽了传统药材辨状的范畴.近年来,随着对中药道地性自然属性、物质属性、药物属性研究的逐步深入,丰富和完善了道地药材"三优"的科学内涵."优质"(high quality)特征主要体现为道地药材具有"独特化学型",其可作为"优效"(superior effect)的物质基础,也可参与调控"优形"(excellent shape)的形成.与"形神合一"相似,在长期进化过程中,道地药材逐渐形成独特的环境适应性特征,表现为"形质合一".道地药材"三优"特征受到品种基因型和产区生态因子交互作用的影响,可体现为气候主导型、生产措施主导型、种质主导型.根据道地药材自然属性、物质属性、药物属性,可构建丹参等模式生物,并建立"三优"研究方法体系,包括基于"优质"特征的质量评价体系、"性效关系"表征方法体系、基于"优形、优质"特征的稳态综合控制体系等.未来道地药材研究应更加注重深入和广泛的基础性工作,需要建立综合性的药用模式植物研究平台,并构建药用模式植物突变体库,以便为其他药用植物的功能基因研究提供有力的模式生物.同时,针对道地药材"三优"特征的研究,提出了 3个热点研究方向,旨在揭示其遗传基础、生物学特性、生态适应性等方面的机制.这些研究将为优化药用植物的定向育种、规范化栽培以及提升药材质量提供科学依据,进一步推动道地药材的可持续利用和发展.

目的 建立超高效液相色谱串联—四极杆—静电场轨道阱质谱技术(ultra-performance liquid chromatogra-phy-linear ion trap quadrupole-Orbitrap-mass spectrometry,UPLC-Q-Orbitrap-MS)对铁皮石斛(Dendrobiumoffi-cinale Kimura&Migo)水提物石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种萃取组分进行定性表征的方法.方法 提取铁皮石斛水提物并依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,旋蒸浓缩后,得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取组分.样品经UPLC-Q-Orbitrap-MS分析,根据元素组成、分子量、质荷比、离子碎片等确定化合物信息并推导裂解规律,通过与文献、MzCloud、MzVault、PudChem、本地数据库比对确定鉴定结果.结果 在正负离子模式下共鉴定出化合物62种,包括黄酮类成分20种,联苄类成分6种,羧酸及其衍生物6种,脂肪酸及其衍生物6种,酚类成分4种,氨基酸及其衍生物3种,糖类成分2种,生物碱类、苯丙素、蒽醌、萜类化合物各1种,其他类成分3种,还检测到8种含量较高、质谱信号较强的未知成分.其中水提石油醚萃取物中鉴定出化合物7种,乙酸乙酯萃取物中鉴定出化合物36种,正丁醇萃取物中鉴定出化合物48种.通过与文献比对,62种化合物中有7种化合物为首次从铁皮石斛中提取得到.结论 该方法可快速有效分析铁皮石斛中多种化学成分,可为铁皮石斛质量控制及药效物质基础研究提供参考.

目的 动态表征急性脑缺血/再灌注(ischemia/reper-fusion,I/R)后小鼠皮层和海马部位神经细胞的损伤情况.方法 取体质量为25～28 g的雄性C57BL/6J小鼠,线栓法阻断小鼠的大脑中动脉,1 h后进行再灌注,制备急性I/R损伤小鼠模型.实验为Sham组、I/R-6 h组、I/R-24 h组和I/R-72 h组.采用Longa神经功能评分评估各时间点小鼠的神经功能;TTC染色检测脑梗死体积;苏木精-伊红染色观察脑组织病理损伤;尼氏染色检测神经细胞损伤;免疫荧光组织化学染色检测星形胶质细胞和小胶质细胞的活化情况,以及成熟神经元的损伤情况;透射电镜检测海马神经元的线粒体损伤;Western blot检测线粒体分裂-融合相关蛋白p-Drp1/Drp1、Mff、Fis1和OPA1的表达情况.结果 随着脑I/R时间的延长,小鼠的神经功能损伤、脑梗死体积,皮层和海马部位的神经细胞损伤、胶质细胞活化、神经元缺失、线粒体损伤逐渐加重;线粒体分裂相关蛋白表达逐渐增加,而线粒体融合相关蛋白表达逐渐降低.结论 随着脑I/R时间的延长,胶质细胞活化、神经元缺失、线粒体损伤等神经病理损伤逐渐加重,这可能与线粒体动力学失衡有关.

目的 采用UPLC-Q-TOF/MS技术结合整合定性策略对白及中菲类化学成分进行快速定性分析.方法 采用ACQUITY UPLC HSS T3 柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),以乙腈溶液(A)-体积分数为0.1%甲酸溶液(B)为流动相体系进行梯度洗脱,柱温为40℃,流速为0.4 mL·min-1;采用Xevo G2 Q-TOF质谱,ESI离子源,负离子检测模式;整合了质量亏损过滤技术、产物离子过滤技术、中性丢失过滤技术和化学结构-色谱保留关联技术,对白及的质谱测试结果进行数据挖掘,通过化学成分数据库建立、UNIFI平台自动筛查、对照品比对和人工校验核实等步骤对菲类化学成分进行表征.结果 在白及中共表征了104 种化学成分.结论 该方法能够快速准确的表征白及中菲类化学成分,为阐明白及的药效物质基础和建立质量控制标准提供了科学依据.

目的 通过对 144批不同产地、不同采收时间鱼腥草根部挥发性成分"印迹模板"的定量分析,阐明其特征,为中药印迹质量评价提供理论参考和实验依据.方法 采集全国不同产地不同采收期的鱼腥草,用水蒸气蒸馏法获取根部挥发油,通过GC-MS法获得指纹图谱并建立相应的成分数据库.对各批鱼腥草挥发性成分"印迹模板"进行定量表征,获得其分子连接性指数(molecu-lar connectivity index,MCI)、物芯指数(core index,CI)、总量统计矩参数、信息熵、信息量等参数.结果 各批样品化学成分种类、数目、含量有较大差异,各批样品间峰面积、信息量变化很大(RSD值分别为 68.67%、79.72%),峰数变化较大(RSD值为 22.03%);而信息熵、总量统计一阶矩、物芯指数(Xvp零阶、Xvp一阶、Xvp二阶)的变化不大(RSD值分别为 16.17%、13.32%、5.46%、6.38%、6.03%).结论 鱼腥草生长过程中以"印迹模板"为中心修饰而成的具体成分及含量是随时随域变化,整体表现为"变"与"不变"规律,其印迹性质量评价可为中药更全面准确的质量控制提供新方法.

目的:探讨巨噬细胞为适应肿瘤微环境(tumor micro-environment，TME)需要而在其自身极化层面上发生谱系变化模型的特征，为进一步研究TME中巨噬细胞的可塑性提供参考。方法:取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转基因并已建成近交系的Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU裸小鼠骨髓细胞，分别在巨噬细胞集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1，CSF-1)、IFN-γ＋LPS、IL-4诱导下，培养出M0、M1和M2亚型，倒置荧光显微镜观察GFP。免疫细胞化学染色法检测巨噬细胞标志蛋白和极化蛋白，并进一步与人脑胶质瘤干细胞SU3共培养。 结果:倒置荧光显微镜下，原始骨髓细胞和条件培养基培养出的M0、M1和M2都发出强烈的绿色荧光。瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色后，普通显微镜下能观察到巨噬细胞固有的可塑性。免疫细胞化学染色检测CD11C和CD206标志蛋白表达都呈阳性，CD68只在M1巨噬细胞上为弱阳性，CSF-1和CSF-1R在各亚型细胞上都呈强阳性。在共培养的干细胞球体中观察到了绿色荧光细胞浸润，并发生了吞噬反应。结论:本研究建立了绿色荧光裸小鼠的髓源性巨噬细胞谱系模型，包含M0、M1和M2亚型，都有巨噬细胞固有的可塑性，表达共同的标志蛋白和极化相关蛋白，具有巨噬细胞固有的吞噬功能，可用于与肿瘤细胞之间相生相克表征的研究，特别是需要示踪研究时，可通过巨噬细胞发出的绿色荧光进行识别。

目的:探究铁钯纳米颗粒修饰的碳纳米管(FePd@CNTs)对人乳腺癌MCF-7细胞的放射增敏作用。方法:用化学还原法制备FePd@CNTs，并通过透射电子显微镜、能谱仪进行表征。CCK-8法检测FePd@CNTs对人正常乳腺上皮MCF-10A细胞的相容性。CCK-8法、流式细胞术和克隆形成实验评估FePd@CNTs对人乳腺癌MCF-7细胞的放射增敏作用。结果:FePd纳米颗粒成功地通过化学还原方法被修饰在CNTs的表面。FePd@CNTs对MCF-10A细胞显示低细胞毒性(IC 50＝738.3 μg/m)，同时可有效增强X射线对MCF-7细胞的杀伤(增敏比为1.22)。 结论:FePd@CNTs具有对乳腺癌的治疗作用与放射增敏的潜力。

目的:探讨基于软骨脱细胞外基质微载体体外构建具有功能化和自我更新能力的软骨类器官。方法:取新鲜的猪关节软骨，将部分仅粉碎处理的软骨微粒设置为天然软骨组；利用物理离心化学萃取相结合的脱细胞方法，制备粒径合适的细胞外基质（ECM）微载体，设置为微载体组。通过旋转式生物反应器将人脐带干间充质干细胞（hUCMSCs）和人软骨细胞（hCho）按照3∶1的比例与微载体负载，体外构建软骨类器官，将诱导不同时间的类器官分为诱导0、7、14及21 d组。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染色观察、DNA定量评估微载体组和天然软骨组细胞残留情况；番红O、甲苯胺蓝染色观察微载体ECM保留情况，二甲氨基苯甲醛比色法测定微载体组和天然软骨组胶原蛋白含量；二甲基亚甲蓝（DMMB）比色法测定微载体组和天然软骨组糖胺聚糖（GAGs）含量。扫描电镜及能谱分析对微载体进行进一步表征；将添加体积分数10%胎牛血清（FBS）的杜尔伯克改良伊戈尔低糖培养基（DMEM）培养的hUCMSCs作为对照组，将微载体浸提液培养的hUCMSCs作为实验组，两组分别设置培养1、3、5 d共3个时间点的亚组，细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8）检测两组生物相容性。活死染色检测诱导0、7、14及21 d组的软骨类器官细胞活性，Ki67荧光染色鉴定诱导14 d软骨类器官的自我更新能力。RT-PCR测定诱导7、14、21 d组的软骨类器官，包括软骨形成相关标记物聚蛋白聚糖（ACAN）、Ⅱ型胶原（COL2A1）、性别决定区Y框蛋白9（SOX9）及软骨肥大、矿化相关标记物Ⅰ型胶原（COL1A1）、Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）的表达水平；比色法和DMMB法测定诱导0、7、14及21 d组的类器官分泌胶原蛋白和GAGs能力。结果:DAPI荧光染色结果显示，天然软骨组具有大量细胞核，而微载体组则基本无细胞核。微载体组DNA含量为（7.8±1.8）ng/mg，较天然软骨组的（526.7±14.7）ng/mg显著降低（ P<0.01）。番红O、甲苯胺蓝染色可见微载体着色较深且均一，保留大量软骨ECM成分。微载体组胶原蛋白含量为（252.9±1.4）μg/mg，GAGs含量为（173.4±0.8）μg/mg，均显著低于天然软骨组的（311.9±2.2）μg/mg、（241.3±0.7）μg/mg（ P<0.01）。扫描电镜显示，微载体表面有凹凸不平相互交错的胶原纤维网络。能谱分析结果显示，C、O、N元素均匀分布在微载体，表明该微载体成分组成均匀。微载体生物相容性良好，培养1、3 d时，对照组和实验组CCK-8实验结果比较，差异均无统计学意义（ P>0.05）；培养5 d，实验组 A值为0.53±0.02，优于对照组的0.44±0.03（ P<0.05）。诱导0、7、14及21 d组中，hUCMSCs和hCho贴附在微载体表面且细胞活性好，活死比例分别为（70.6±1.1）%、（80.5±0.6）%、（94.5±0.9）%、（90.8±0.5）%（ P<0.01）；诱导14 d时，软骨类器官有大量Ki67阳性细胞。RT-PCR显示，诱导7 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为1.00±0.09、1.00±0.24、1.00±0.18、1.00±0.03、1.00±0.06、1.00±0.13；诱导14 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为4.16±0.28、5.09±1.25、5.65±1.05、0.47±0.01、1.68±0.02、0.21±0.06；诱导21 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为13.42±0.92、3.07±0.21、1.84±1.08、2.72±0.17、2.91±0.18、3.32±1.20。与诱导7 d组比较，诱导14 d组ACAN、COL2A1、SOX9、RUNX2表达水平均升高（ P<0.05），COL1A1表达水平降低（ P<0.05），OCN表达水平差异无统计学意义（ P>0.05）；与诱导7 d组比较，诱导21 d组ACAN、COL1A1、RUNX2表达水平均显著升高（ P<0.01），COL2A1、SOX9、OCN表达水平差异均无统计学意义（ P>0.05）；与诱导14 d组比较，诱导21 d组ACAN、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平均升高（ P<0.05或0.01），COL2A1表达水平差异无统计学意义（ P>0.05），SOX9表达水平降低（ P<0.05）。诱导0、7、14及21 d组胶原蛋白含量分别为（219.15±0.48）μg/mg、（264.07±1.58）μg/mg、（270.83±0.84）μg/mg、（280.01±0.48）μg/mg，GAGs含量分别为（171.18±1.09）μg/mg、（184.06±1.37）μg/mg、（241.08±0.84）μg/mg、（201.14±0.17）μg/mg。与诱导0 d组比较，诱导7、14、21 d组胶原蛋白和GAGs含量均显著升高（ P<0.01）。在诱导7、14、21 d组中，诱导7 d组胶原蛋白含量最低（ P<0.01），诱导21 d组胶原蛋白含量最高（ P<0.01）；诱导7 d组GAGs含量最低（ P<0.01），诱导14 d组GAGs含量最高（ P<0.01）。 结论:物理化学方法结合制备的微载体脱细胞成功，其基质保留较多，成分均一且无细胞毒性。基于微载体负载hUCMSCs与hCho体外成功构建软骨类器官，具有细胞活性好、自我更新能力、软骨形成相关基因表达强及分泌胶原蛋白和GAGs等特点，诱导14 d时构建的软骨类器官成软骨活性最佳。

目的:探讨SD鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源外泌体(Exos)修复骺板缺损的相关机制。方法:通过超离心提取鼠BMSCs来源的Exos，制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)负载的Exos(PLGA-Exos)支架，扫描电镜对支架进行表征。提取鼠软骨细胞，探究PLGA-Exos/RAW264.7细胞/软骨细胞共培养体系中巨噬细胞及软骨细胞相关基因的表达。将24只SD大鼠随机均分为A、B、C 3组，构建胫骨近端骺板缺损模型，将PLGA负载的BMSCs-Exos缓释棒(A组)及无Exos负载的PLGA棒(B组)分别填塞于骺板缺损区，C组为对照组(无填塞)。术后6周获取鼠胫骨标本，通过影像学X线分析、苏木精-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及巨噬细胞表型蛋白[M1型：诱导型一氧化氮合酶(iNOS)；M2型：Arg-1]染色，评估骺板缺损的修复效果。两组间比较采用独立样本 t检验。 结果:PLGAs支架为三维多孔结构，孔隙分布均匀，具有较高的连通性。Exos被成功加载至PLGA中。PCR结果发现，在炎症微环境中，与对照组比较，BMSCs-Exos调控巨噬细胞高表达M2表型蛋白Arg-1(7.12±1.01比1.00±0.03， t＝10.47， P<0.01)，且促进软骨细胞COL-2及Sox9基因mRNA表达(8.25±0.74比1.00±0.12， t＝16.84， P<0.01；4.64±0.16比1.00±0.01， t＝38.64， P<0.01)。术后6周胫骨标本影像学及组织学分析显示，A组骺板缺损区可见结构致密、与正常骺板结构及功能相似新生透明软骨组织，B组骺板缺损区新生组织由大量的纤维组织及少量的透明软骨组成，C组骺板缺损区骨桥形成。骺板损伤区巨噬细胞相关的表型蛋白免疫组织化学染色显示，A组M2型巨噬细胞表型蛋白Arg-1染色呈阳性显色反应，M1型巨噬细胞表型蛋白iNOS染色为阴性；B组少量细胞质基质被Arg-1抗体染为弱阳性，iNOS染色为阴性；C组Arg-1抗体染色为阴性，而iNOS染色呈阳性反应。 结论:在炎症微环境中，BMSCs-Exos调控巨噬细胞向M2型编程，促进骺板缺损修复。