目的:探究孕期慢性应激对子代雌性大鼠抑郁行为及海马组织印记基因胰岛素样生长因子-2 (insulin-like growth factor-2，IGF-2)/长链非编码RNA(lncRNA)H19甲基化的影响。方法:32只SPF级雌性SD大鼠按照随机数字表法分为模型组和对照组，模型组大鼠采用慢性不可预知性温和应激(chronic unpredictable mild stress model，CUMS)方法建立抑郁模型，对照组正常饲养。应激刺激第7天时，雌雄鼠合笼交配。在应激刺激前1 d和应激刺激第1、7、14、21、28天对两组母鼠行内眦静脉采血，测定血浆皮质酮浓度；在雌性仔鼠出生后第28天和出生后第42天时，每组随机抽取8只，行内眦静脉采血后测定血浆皮质酮浓度；在出生后第42天时，分别通过糖水偏爱实验、悬尾实验和强迫游泳实验测定两组雌性仔鼠的抑郁样行为。采用RT-PCR和Western blot法检测仔鼠海马组织中IGF-2/H19及相关转移酶表达情况。利用Methyl Target技术，对IGF-2差异性甲基化区域(differentially methylated region，DMR)片段2的19个CpG位点，H19印记控制区(imprinting control region，ICR)片段1中8个CpG位点和H19-ICR片段2的15个CpG位点，同时捕获测序，计算每个CpG位点甲基化水平。采用SPSS 26.0，采用重复测量方差分析、 t检验和非参数检验对相关数据进行统计分析。 结果:(1)重复测量方差分析结果显示，母鼠血浆皮质酮的时间与组别的交互效应不显著( F＝2.997， P＝0.066)，时间主效应显著( F＝4.44， P＝0.010)，组别主效应显著( F＝41.40， P＝0.001)。组间因素的单独效应分析，在应激第14、21、28天，模型组母鼠血浆皮质酮浓度均高于对照组母鼠(均 P<0.001)。(2)在糖水偏爱实验中，模型组雌性仔鼠的液体总消耗[11.10(10.38，11.58)mL，13.55(12.00，15.77)mL， Z＝－3.055， P＝0.002]、1%蔗糖水消耗[(5.50±1.30)mL，(8.56±2.04)mL， t＝－3.582， P＝0.003]及1%蔗糖偏爱百分比[(51.35±8.69)%，(62.11±8.05)%， t＝－2.576， P＝0.022]均低于对照组。(3)模型组雌性仔鼠悬尾实验中静止持续时间[(126.95±39.89)s，(54.30±25.00)s， t＝4.375， P＝0.001]和强迫游泳实验中持续不动时间[(7.97±6.66)s，(1.85±2.12)s， t＝2.478， P＝0.037]均长于对照组。(4)模型组雌性仔鼠海马组织IGF-2 mRNA[(0.46±0.24)，(1.00±0.00)， t＝3.821， P＝ 0.019]、H19 mRNA[(0.60±0.25)，(1.00±0.00)， t＝3.574， P＝0.007]表达均低于对照组；模型组雌性仔鼠IGF-2蛋白相对表达低于对照组[(0.77±0.04)，(1.00±0.00)； t＝9.876， P＝0.01)；CCTC结合因子(CCTC-binding factor，CTCF)的mRNA[(1.29±0.12)，(1.00±0.00)， t＝－4.850， P＝0.003]和蛋白相对表达水平[(1.90±0.28)，(1.00±0.00)， t＝－5.513， P＝0.005]均高于对照组。(5)模型组雌性仔鼠海马组织IGF-2 DMR区域3个CpG位点甲基化水平均低于对照组( t＝－3.21，－3.00，－3.34，均 P<0.05)，分别位于chr1215831028、chr1215831055和chr1215831205；IGF-2 DMR片段甲基化水平低于对照组( t＝－3.453， P＝0.048)；模型组雌性仔鼠甲基转移酶DNMT3A mRNA( t＝5.102， P＝0.002)、DNMT3A( t＝10.213， P<0.001)和DNMT3B( t＝4.169， P＝0.014)蛋白相对表达水平均低于对照组。 结论:孕期慢性应激致雌性仔鼠出现抑郁、绝望状态，其机制可能与甲基化转移酶表达降低引起印记基因IGF-2 DMR甲基化水平降低有关。

目的:单细胞RNA测序解析普通小鼠和糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面中CD34 +细胞的类型与功能。 方法:该研究为实验研究。构建CD34 +细胞谱系追踪小鼠，实现CD34 +细胞在荧光条件下可视化。取6只7~8周龄雄性CD34 +细胞谱系追踪小鼠（设为糖尿病组），腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病模型，于小鼠13周龄时在其背部制备全层皮肤缺损创面；另取6只13周龄雄性CD34 +细胞谱系追踪小鼠（设为对照组），在其背部制备全层皮肤缺损创面。伤后4 d，分别收集对照组3只小鼠和糖尿病组2只小鼠创面组织，消化制备单细胞悬液，采用荧光活化细胞分选法筛选出CD34 +细胞后进行单细胞RNA测序，采用R语言的Seurat 4.0.2程序通过降维可视化和细胞聚类分析CD34 +细胞类型并筛选注释各CD34 +细胞亚群的标记基因，对2组小鼠创面组织间CD34 +成纤维细胞（Fb）、平滑肌细胞、角质形成细胞（KC）、类软骨细胞的差异表达基因（DEG）进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析，探索细胞功能。 结果:伤后4 d，2组小鼠创面组织中CD34 +细胞均包含7种细胞类型，具体为内皮细胞、Fb、KC、巨噬细胞、T细胞、平滑肌细胞和类软骨细胞，其中Fb细分为5个亚群。与对照组比较，糖尿病组小鼠创面组织中的CD34 +内皮细胞、Fb亚群1、Fb亚群4、KC、类软骨细胞占比升高，CD34 +Fb亚群2、Fb亚群3和平滑肌细胞占比下降。注释CD34 +类软骨细胞、内皮细胞、Fb亚群1、Fb亚群2、Fb亚群3、Fb亚群4、Fb亚群5、KC、巨噬细胞、平滑肌细胞、T细胞的标记基因分别为转移相关肺腺癌转录本1、脂肪酸结合蛋白4、Gremlin 1、补体成分4B、H19印记母源表达转录本、Dickkopf Wnt信号通路抑制剂2、纤维调节蛋白、角蛋白5、CD74分子、G蛋白信号调节蛋白5、可诱导T细胞共刺激分子。KEGG和GO富集分析显示，与对照组比较，糖尿病组小鼠伤后4 d创面组织中CD34 +Fb差异表达显著的DEG显著富集于炎症反应、细胞外基质（ECM）组装、细胞增殖调控、衰老相关条目（ P值均<0.05），CD34 +平滑肌细胞差异表达显著的DEG显著富集于细胞迁移、凋亡过程、转录的正调控、吞噬体等条目（ P值均<0.05），CD34 +KC差异表达显著的DEG显著富集于线粒体功能、转录、神经退行性疾病相关条目（ P值均<0.05），CD34 +类软骨细胞差异表达显著的DEG显著富集于节律调控、ECM、病毒感染等相关条目（ P值均<0.05）。 结论:CD34 +细胞在普通小鼠和糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合过程中均存在高异质性，2种小鼠创面间CD34 +细胞亚群差异表达显著的DEG显著富集的相关功能与创面愈合过程紧密相关。

目的:探讨产前可疑Beckwith-Wiedemann综合征（Beckwith-Wiedemann syndrome, BWS）胎儿的遗传学检测，以提高该综合征的产前遗传学诊断率。方法:1例既往孕18周超声发现胎儿脐膨出、胎盘增厚引产孕妇，此次妊娠孕13周超声再次发现胎儿脐膨出、胎盘增厚。行绒毛活检取样术后，应用单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism array, SNP array）芯片对全基因组拷贝数变异分析，之后应用甲基化特异性多重连接探针扩增（methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification, MS-MLPA）技术检测染色体11p15区域 H19和 KCNQ1基因的甲基化状态和拷贝数变化。同时采集胎儿父母外周血行染色体高分辨G显带核型分析和SNP array检测。 结果:胎儿绒毛SNP array提示11p15.5区域有176 kb杂合缺失；MS-MLPA提示印记控制区域2甲基化缺失， KCNQ1（L02903）基因拷贝数减少50%。胎儿父母的SNP array检测和染色体G显带核型分析均未发现异常。诊断该例胎儿为BWS。 结论:孕早期超声发现胎儿脐膨出、胎盘异常增厚等宫内异常表现时，应选择相应的遗传学检测，建议产前诊断选择MS-MLPA和SNP array，避免漏诊BWS。

目的:研究长链非编码RNA(lncRNA)H19和胰岛素样生长因子2(IGF2)基因在乳腺癌组织中的表达水平,分析其印记状态.方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测乳腺癌组织及癌旁组织中H19和IGF2 mRNA表达水平,分析H19和IGF2 mRNA在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达差异,利用单核苷酸多态性(SNP)区分等位基因表达情况(纯合或杂合),基因组DNA中IGF2(Apa Ⅰ位点)或H19(Alu Ⅰ位点)为杂合则进行印记分析,确定H19和IGF2在乳腺癌组织中的印记状态,即印记保持(MOI)或印记丢失(LOI).分析乳腺癌组织中H19和IGF2表达与分子分型的关系.结果:RT-qPCR法检测,乳腺癌组织中H19和IGF2 mRNA表达水平高于癌旁组织(P＜0.01),H19 mRNA表达水平与IGF2 mRNA表达水平呈正相关关系(r=0.567,P＜0.01).不同分子分型乳腺癌患者癌组织中H19 mRNA表达水平均高于癌旁组织(P＜0.05或P＜0.01).H19和IGF2在乳腺癌组织中均存在LOI,IGF2的LOI发生率为36.7％,高于H19的LOI发生率(4.3％).RT-qPCR法检测,IGF2 LOI组乳腺癌组织中IGF2 mRNA表达水平明显高于IGF2 MOI组(P＜0.01).结论:乳腺癌组织中H19和IGF2 mRNA表达水平明显高于癌旁组织,IGF2的LOI发生率高于H19的LOI发生率,IGF2的LOI可能是乳腺癌发病的关键因素之一.

目的:探讨大鼠脊神经结扎术后脊髓背角小胶质细胞中微核糖核酸-195 (microRNA-195,miR-195)的表达及其对自噬水平的影响与调节机制.方法:32只成年雄性SD大鼠随机分为脊神经结扎组(SNL组)和假手术组(S组),每组16只,SNL组结扎L5段神经制备脊神经结扎模型,造模后1d、3d、5d、10d两组各处死4只大鼠,分离脊髓腰膨大,采用Percoll梯度离心法分离脊髓背角小胶质细胞,Real-time PCR检测两组各时间点脊髓背角小胶质细胞的miR-195表达水平.取12只成年雄性SD大鼠,处死后取脊髓腰膨大,分离脊髓背角小胶质细胞,分为两组,一组采用脂质体法转染miR-195模拟物,另一组加入转染试剂,检测两组小胶质细胞自噬体膜标记蛋白轻链3(light chain 3,LC3)的表达水平;再取小胶质细胞分为三组,分别将含有野生型及突变型自噬相关基因14(ATG14)3'非编码区(3'UTR)的报告基因质粒、pRL-TK质粒miR-195模拟物和对照转入HEK 293细胞培养48h,荧光显微镜下观察miR-195的直接作用靶点,并检测三组ATG14蛋白的表达.取24只健康SD大鼠脊髓腰膨大,分离脊髓背角小胶质细胞,分为三组分别转染miR-195模拟物、抑制物和转染试剂,培养48h,采用免疫蛋白印记(Westem blot)法检测三组ATG14蛋白的表达水平;再取小胶质细胞分为三组,分别转染pEGFP-LC3、pEGFP-LC3+miR-195模拟物及pEGFP-LC3+miR-195模拟物+pCMV-ATG14培养48h,染色后荧光显微下观察自噬斑点数量.结果:SNL组各时间点大鼠脊髓背角小胶质细胞中miR-195表达均明显上调,与同时间点S组比较均有显著性差异(P＜0.05).转染miR-195模拟物后,LC3的表达水平(0.61±0.07)较对照组(1.21±0.08)显著性降低(P＜0.05).转入野生型ATG14 3'UTR的报告基因质粒的HEK 293细胞的荧光强度较对照显著性减弱(0.65±0.04 vs 1.01±0.01,P＜0.05),突变型与对照无显著性变化(0.99±0.03 vs1.00±0.02,P＞0.05).转染miR-195模拟物后小胶质细胞中ATG14的表达显著性降低(P＜0.05);转染miR-195抑制物后ATG14的表达显著性升高(P＜0.05).转染pEGFP-LC3与pEGFP-LC3+miR-195模拟物较转染pEGFP-LC3+miR-195模拟物+pCMV-ATG14时自噬数量降低(P＜0.05).结论:miR-195在大鼠脊神经结扎模型脊髓背角小胶质细胞中高表达,降低自噬蛋白LC3表达;ATG14蛋白受miR-195负调控,miR-195可能通过降低ATG14的表达抑制小胶质细胞自噬.

目的:分析印记基因H19和SNRPN印记控制区的各CpG位点甲基化状态与男性精液参数的关联.方法:选取2014年4至9月于空军总医院男科就诊的符合纳入排除标准的205例男性为研究对象,采用焦磷酸测序法定量分析H19和SNRPN基因的各CpG位点的甲基化状态,采用典型相关分析印记基因H19和SNRPN的各CpG位点的甲基化水平与精液参数两组变量的整体相关性.结果:H19基因的CpG2和CpG3甲基化水平与精子密度和精子活动力的相关性具统计学意义;SNRPN基因的CpG5、CpG6、CpG7甲基化水平与精子正常形态率的相关性具统计学意义.结论:印记基因H19和SNRPN印记控制区特定CpG位点甲基化状态与精液参数有关联.

目的 探讨Russell-Silver综合征(RSS)发病机制.方法 采集6例男性,年龄6~8岁的临床表型疑似RSS患儿,以及2例患儿父母、5例健康男性儿童的外周血2 mL,分离单个核细胞并提取基因组DNA,应用焦磷酸测序技术进行分析,检测染色体11 p 15.5上印记基因控制区域(ICR)1的H19基因的甲基化水平.应用甲基化特异性多重连接探针扩增技术(MS-MLPA)对1例焦磷酸测序结果阳性且为RSS患儿的甲基化水平进行验证分析并对相应区域的基因拷贝数进行检测.结果 焦磷酸测序结果显示,6例患儿在H19-差异甲基化区域(DMR)的6个CpG位点的甲基化率为11 %~29 %;患儿父母及正常对照组对应位点的甲基化率为44 %~59 %.焦磷酸测序结果阳性的1例患儿对应的MS-MLPA结果显示,H19基因的4个位点甲基化率在10 %左右,明显低于正常水平.KCNQ1OT1基因的4个位点甲基化率约为50 %,在正常范围内.所测样本的基因拷贝数均在正常范围内.结论 RSS患儿的ICR 1的H19-DMR存在甲基化水平异常.

目的:观察二至天癸颗粒治疗肾阴虚不孕症的疗效及其对患者胚胎着床期子宫内膜H19表达的影响.方法:将70例肾阴虚不孕症患者随机分为观察组和对照组,每组各35例.观察组在超促排卵长方案基础上接受二至天癸颗粒治疗,对照组超促排卵长方案基础上接受安慰剂治疗.观察两组患者治疗前后中医证候积分变化情况,比较两组患者HCG注射日子宫相关情况、H19双等位基因表达率、生化妊娠率和临床妊娠率.结果:两组患者治疗前中医证候积分比较,差异无统计学意义(t=0.388 2,P=0.699 1);人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)注射日,观察组中医证候积分显著低于对照组,差异具有统计学意义(t =4.311 7,P=0.000 1).HCG注射日,观察组A型子宫内膜比例显著高于对照组,子宫动脉阻力指数、搏动指数显著低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05);两组患者子宫内膜厚度比较,差异无统计学意义(P＞0.05).观察组生化妊娠率、临床妊娠率显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).观察组胚胎着床期子宫内膜H19双等位基因表达率显著低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:二至天癸颗粒治疗肾阴虚不孕症的疗效确切,并且其可以改善子宫内膜印记基因H19的表达.

目的 对印记基因H19在三种不同质量的精子中的甲基化状态以及精卵结合后形成胚胎的甲基化状态进行比较,初步探索精子甲基化状态与受精后胚胎甲基化状态的关系.方法 收集在云南省第一人民医院生殖医学科行IVF－ET治疗中废弃的精子91份和D3期低质量胚胎171份,依据WHO第5版根据精子参数将精子样本分为3组,分别分析3组的精子及受精后胚胎H19的甲基化状态.结果 B组在精子中和胚胎中H19甲基化状态异常比例显著高于另外2组(P＜0.05).结论 印记基因H19甲基化状态异常主要集中在异常参数精子组中,提示其异常状态与精子质量降低有关;通过IVF、ICSI受精后的胚胎都出现同等比例的异常状态,没有显著差异;异常精子的胚胎未出现异常,这可能与胚胎自身的自我修复功能有关;而个别正常精子受精后的胚胎出现甲基化印记异常的原因可能与体外培养条件有关,也有可能与卵子质量本身有关.

印记基因H19作为发现较早的母系印记之一,于胚胎发育早期高度表达,并主要集中于内胚层和中胚层,在调节胚胎的生长发育和子代行为方面发挥着重要作.越来越多的研究表明,印记基因H19的印记控制区中CpG岛甲基化状态的改变会导致男性精液质量和女性卵母细胞质量的下降,从而影响人类的生育力,而且印记基因H19本身便与胚胎的生长发育有关.文章对印记基因H19甲基化情况在辅助生殖技术中的研究进展进行综述.