[目的]水稻的抽穗期对水稻地域适应性及水稻产量至关重要,对水稻抽穗期基因进行鉴定及功能分析,可以为水稻育种提供优异的基因资源.[方法]通过BSA-seq方法对一个黄化早抽穗突变体hz1(huangzao 1)进行基因定位克隆及连锁分析;利用RT-qPCR技术分析目的基因HZ1 的表达谱,并用水稻原生质体瞬时转化查明HZ1 的亚细胞定位;对突变体的抽穗期、叶绿素含量、过氧化氢含量等生理指标进行测定,详细分析其表型变化.[结果]田间表型观察发现hz1表现早抽穗,长日照(long-day,LD)及短日照(short-day,SD)条件下hz1 的抽穗期相同,分别比野生型(wild type,WT)早抽穗 43 d和 26 d,表明hz1 是一个光周期不敏感的突变体.同时hz1 表现黄化表型,相比WT,叶绿素含量下降.遗传分析表明hz1 由隐性单基因控制,F2 混池高通量测序将目的基因定位于水稻第 6 染色体上 17.8 Mb区间内,分析发现该区间内一个T-DNA插入位点LOC_Os06g40080 与hz1 目标性状完全连锁,LOC_Os06g40080 为已知的SE5 基因,编码血红素加氧酶 1(heme oxygenase 1,HO1).HZ1/SE5 在叶片中高表达,在LD及SD条件下具有昼夜节律性表达.亚细胞定位发现HZ1/SE5 蛋白定位于叶绿体中.表达调控分析表明HZ1/SE5主要通过调控水稻成花素Hd3a和RFT1 的表达来调控水稻的抽穗期;并通过调控叶绿素合成途径相关基因的表达水平影响水稻叶绿素水平变化.[结论]黄化早抽穗突变体hz1 由于血红素加氧酶编码基因SE5 突变导致其对光周期不敏感,HZ1/SE5 基因通过调控水稻成花素基因及叶绿素合成途径相关基因的表达而影响水稻的抽穗期及叶片的黄化.

叶绿素是水稻光合作用的重要色素,叶绿素的合成决定光合作用的效率,影响植物的产量和品质.在本研究中,发现糖原合成酶激酶OsGSK2过表达植株Go-2成熟期呈现叶片深绿色的表型.相比野生型,Go-2植株叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量显著升高.透射电镜观察结果显示,相比野生型,Go-2植株叶绿体类囊体片层增多.酵母双杂交"一对一"实验证实OsGSK2与Golden2-Like转录因子OsGLK1存在互作,并进一步通过双分子荧光互补实验确认OsGSK2与OsGLK1存在互作.在水稻原生质体中检测双荧光素酶活性发现,相比单转OsGLK1,OsGSK2与OsGLK 1共转显著提高下游靶基因的表达水平.荧光定量PCR结果表明,相比野生型,在Go-2植株中OsGLK1直接调控的靶基因OsPORB、OsCAO1、LHCB6等转录水平显著上调.研究结果初步揭示了OsGSK2与OsGLK1互作调控水稻叶绿素合成和叶绿体发育的分子机理,进一步拓展了水稻糖原合成酶激酶的分子功能,丰富了水稻叶色调控的分子网络,为水稻高光合分子育种提供了理论依据.

目的 选育他克莫司高产菌株,优化培养基配方,提高发酵产量.方法 采用原生质体融合技术对2株筑波链霉菌进行基因组重排,并经响应面设计对发酵培养基配方进行优化.结果 以紫外灭活作为遗传标记经过4轮基因组重排育种后,摇瓶筛选获得3株高产菌株,其中菌株FK22-71菌丝球松散、椭圆状,发酵浸泡液颗粒状.该菌株稳定高产,采用响应面设计优化后的配方在50 L罐发酵产量平均达1684 mg/L.结论 基因组重排技术应用于他克莫司高产菌株选育,可大幅提高发酵产量,为其工业化发酵生产奠定了基础.

茯苓Wolfiporia hoelen是一种食药兼用的大型真菌,在我国栽培历史悠久,但由于长期无性繁殖,导致菌种退化,栽培产量下降,严重影响产业发展.为解决茯苓育种的难题,我们前期建立了茯苓同核体鉴定方法,明确了其交配系统,建立了单孢同核体杂交育种体系,但是部分茯苓菌株子实体形成困难或子实体贴生,导致担孢子收集困难,因此原生质体单核化的研究具有重要意义.本研究以两株存在较大遗传差异且同核体类型不同的菌株 776 和 775 为材料,核荧光染色表明超过60%的原生质体具有细胞核,原生质体再生率分别为11.0%和7.6%,不易生长的再生菌株中既有同核也有异核菌株.原生质体单核化获得了两个菌株的同核体菌株,比例可达到10%以上,菌株776 获得了两种交配型的同核体菌株(5:3),不存在偏分离(χ2=0.5),但菌株 775 原生质体单核化仅获得了一种交配型的同核体菌株,表现出严重的交配型偏分离.通过杂交菌株与两亲本对峙试验及基于rpb2 的杂合位点验证,证实获得了原生质体同核体杂交菌株 25 株,原生质体同核体与单孢同核体杂交菌株 50 株,表明茯苓原生质体同核体杂交育种的可行性.

香菇菌丝转色是决定栽培香菇产量和品质的关键因素之一.弄清菌丝转色过程中黑色素合成途径和关键基因对于解析香菇菌丝转色机理具有重要意义.本研究利用一组可亲和配对的香菇原生质体单核菌株SP3、SP30全基因组数据进行同源比对,对香菇黑色素合成途径进行注释并对黑色素合成关键基因进行挖掘.结果显示,香菇基因组中缺少庚烯酮水解酶基因、小柱孢酮脱水酶基因和对羟苯丙酮酸双加氧酶基因,推测香菇菌株不存在典型的 DHN-黑色素和脓黑色素合成途径,但可以合成DOPA黑色素、GHB黑色素、PAP黑色素和儿茶酚黑色素.同时进一步对香菇黑色素合成中限速酶——酪氨酸酶进行生物信息学分析,研究表明香菇菌株SP3、SP30中酪氨酸酶基因编码蛋白为稳定的亲水蛋白,含有 2 个与酪氨酸酶催化活性相关的铜离子结构域,不含有分泌型信号肽,不含跨膜结构域且定位在细胞质.该研究结果为香菇黑色素合成遗传基础、菌丝转色机理及影响因素研究提供了重要参考.

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要致病菌.研究果生刺盘孢RNA结合蛋白基因CfNOP12 的生物学功能,阐述果生刺盘孢致病的分子机制,为油茶炭疽病的防治提供理论基础.根据同源重组原理,在果生刺盘孢中敲除目标基因 CfNOP12,PCR 验证获得正确的突变体ΔCfnop12;进一步构建PYF11::CfNOP12 回补质粒,导入突变体原生质体中,筛选成功互补菌株ΔCfnop12-C.对这些菌株进行生物学表型测定,发现突变体ΔCfnop12 营养生长速率显著下降,分生孢子的产量及附着胞形成率显著降低;在含有细胞壁胁迫剂的 PDA培养基上,突变体ΔCfnop12 的抑制率相较于野生型和回补菌株显著升高,在低温条件下,突变体的生长速率表现出明显下降;野生型和回补菌株几丁质聚集在菌丝顶端,突变体ΔCfnop12 尖端几丁质分布不正常;相比于野生型和回补菌株,突变体致病力显著降低.综上所述,潜在RNA结合蛋白基因CfNOP12 参与调控了果生刺盘孢生长发育、低温胁迫响应和致病力.

为优化巨大侧耳原生质体的制备条件,该研究以两株不同温型的巨大侧耳菌株PG46 和PG79 为材料,采用单因素和正交试验方法对原生质体制备的菌丝体菌龄、稳渗剂种类、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间进行研究.结果表明:(1)在单因素实验中,巨大侧耳原生质体制备的适宜条件为菌龄5d,溶壁酶浓度2.5%,0.6 mol?L-1甘露醇,32℃(PG46)或 27～35℃(PG79)酶解 4 h.(2)正交试验验证并优化了单因素实验结果,组合 2(菌龄 5d,溶壁酶浓度 2.5%,0.6 mol?L-1的甘露醇,32℃酶解 4h)可同时作为PG46 和PG79 原生质体制备的最适条件,原生质体产量分别为 11.22×106 CFU?mL-1和 7.28×106 CFU?mL-1.(3)F-test检验中,各因素对原生质体制备的影响程度依次为菌龄>溶壁酶浓度>酶解温度>酶解时间(PG46),菌龄>酶解时间>酶解温度>溶壁酶浓度(PG79).综上所述,两株不同温型巨大侧耳菌株的原生质体制备条件基本一致,菌龄对两菌株原生质体得率的影响程度最显著.该研究结果可为后续巨大侧耳的杂交育种、遗传转化、全基因组测序等工作奠定基础,进一步推动巨大侧耳分子遗传学的发展.

目的:克隆丹参SmRopGEF1 基因,研究其编码蛋白的亚细胞定位及其对逆境胁迫的应激反应和激素诱导下的表达水平.方法:根据前期丹参转录组测序结果设计SmRopGEF1 基因特异引物,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增 SmRopGEF1 基因序列;使用生物信息学方法分析 SmRopGEF1 蛋白序列特征及进化关系;构建pET28a-SmRopGEF1 原核表达载体并转化至大肠埃希氏菌中诱导表达,构建 35S启动的SmRopGEF1 的绿色荧光蛋白原生质体瞬时表达载体,利用激光共聚焦显微镜观察SmRopGEF1 的亚细胞定位;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测逆境胁迫(低温、盐及干旱)和激素诱导(生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯)下的基因表达量.结果:丹参SmRopGEF1 基因开放阅读框(ORF)全长为 1701 bp,编码 566 个氨基酸,蛋白相对分子质量是 62 362.99.生物信息学分析显示SmRopGEF1 蛋白含有 1 个PRONE保守结构域,系统进化树分析表明SmRopGEF1 蛋白与芡欧鼠尾草和一串红RopGEF1 蛋白为高同源蛋白.成功构建pET28a-SmRopGEF1 原核表达载体并在大肠埃希氏菌Rosetta(DE3)菌株中表达、纯化出SmRopGEF1 重组蛋白.亚细胞定位的结果显示SmRopGEF1 存在于植物细胞的细胞核中.qRT-PCR 实验结果表明盐胁迫和冷胁迫能够显著提高 SmRopGEF1 的表达量;干旱胁迫后丹参愈伤中SmRopGEF1 表达量下降.茉莉酸甲酯诱导后SmRopGEF1 表达量升高.结论:克隆了丹参SmRopGEF1 基因,其在抗逆胁迫中起到重要作用并且可能参与茉莉酸甲酯信号转导.研究结果丰富了丹参防御反应机制的研究,为选育丹参抗逆优良品种、提高丹参的产量与品质提供了参考.

为明确致病疫霉的致病机理需要建立高效的病原菌原生质体制备和再生体系.通过对马铃薯晚疫病菌制备和再生过程的研究,采用两种裂解酶Driselase和Cellulase R-10,以不同菌龄、裂解酶、裂解酶的浓度和裂解酶的反应时间为研究条件,得到原生质体制备的最佳条件为:以培养18 d的菌丝体为材料,用10 mg/mL Driselase处理菌丝60 min后,原生质体产量达9.5×104个/g;以0.1 mol/L氯化钙和0.4 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂,以黑麦V8固体再生培养基得到的原生质体再生率最高达3.1％.

以秀珍菇单核菌丝为材料,用溶壁酶进行原生质体的制备,考察各因素对原生质体产量的影响,用单因素试验和正交试验确定最佳条件.结果表明,菌龄为8 d菌丝体,0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L Tris-HCl为稳渗剂,酶解温度29℃、酶浓度1.6％的条件下酶解160 min.原生质体产量达到3.5×107 CFU/mL,原生质体再生率达到1.4％.