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转录辅激活因子Mediator 1调控小鼠皮肤毛发再生的作用机制研究
编辑人员丨4天前
目的:探讨转录辅激活因子Mediator 1(Med1)对小鼠皮肤毛发再生的影响及可能机制。方法:将C57BL/6J品系来源的Med1 flox/flox小鼠与K14-Cre小鼠交配,通过Cre-Loxp系统获得Med1表皮特异性敲除小鼠,即表达K14-Cre的Med1 flox/flox小鼠(敲除组),不表达K14-Cre的Med1 flox/flox小鼠即为对照组,每组3只,共同饲养8周左右行背部脱毛实验,连续12 d观察毛发再生情况。12 d后,处死两组小鼠并切取其背部脱毛和未脱毛皮肤组织,提取组织总RNA,实时定量PCR检测毛发角蛋白基因、维生素D受体/β联蛋白通路相关基因、毛囊增殖与静息状态维持相关基因的表达。制备小鼠背部脱毛和未脱毛皮肤组织石蜡切片,免疫荧光染色检测小鼠皮肤毛囊隆突部位干细胞数量。组间比较采用两独立样本 t检验。 结果:脱毛后0 ~ 12 d,与对照组相比,敲除组小鼠脱毛区皮肤毛发再生延迟。实时定量PCR检测显示,敲除组脱毛皮肤组织中毛发角蛋白基因Ha1、Krt2-16及维生素D受体/β联蛋白通路相关基因S100a3、Dlx3、Tubb3和毛囊增殖与静息状态维持相关基因Lhx2、Sox9、Nfatc1 mRNA相对表达量(22.09 ± 12.32、2.07 ± 0.20、0.02 ± 0.01、12.36 ± 2.12、1.75 ± 0.46、0.39 ± 0.02、4.42 ± 0.76、0.44 ± 0.07)均显著低于对照组(70.53 ± 9.46、7.76 ± 0.49、0.05 ± 0.01、26.16 ± 2.96、2.60 ± 0.14、0.71 ± 0.09、11.93 ± 0.42、0.75 ± 0.04; t值分别为5.40、18.64、3.89、6.57、3.04、6.10、15.03、6.18,均 P < 0.05)。免疫荧光染色显示,无论在脱毛还是未脱毛皮肤组织中,敲除组毛囊隆突部位CD34 +K15 +毛囊干细胞数量均远低于对照组。 结论:Med1基因敲除可能通过下调维生素D受体/β联蛋白通路下游基因及毛囊增殖与静息状态维持相关基因Sox9、Nfatc1、Lhx2的表达,减少毛囊干细胞数量,导致毛囊分化障碍,毛发再生延迟。
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编辑人员丨4天前
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单细胞测序和数字PCR技术筛选单核细胞差异基因集对脓毒症早期诊断的临床意义
编辑人员丨4天前
目的:验证脓毒症中特异分化的单核细胞亚群,并筛选及构建用于早期诊断脓毒症的单核细胞差异基因集。方法:选择广东省人民医院2020年6月至2021年3月收治的脓毒症患者,提取外周血单个核细胞(PBMC),应用单细胞测序技术和拟时序分析对单核细胞差异亚群进行验证。利用生物信息学手段分析差异亚群中的基因表达,并筛选出差异基因用于初步构建候选差异基因集。利用数字聚合酶链反应(PCR)技术分别在脓毒症患者PBMC以及脓毒症人髓系白血病单核细胞株(THP-1)模型中对候选差异基因进行验证,并利用韦恩图构建最终的单核细胞差异基因集。使用基因表达数据库(GEO)对差异基因集进行外部数据验证。结果:①细胞注释及拟时序分析结果显示,NEAT1 +CD163 +单核细胞的分化明显区别于其他亚群,并在脓毒症早期就已经出现,是脓毒症病理过程中的特征亚群。②从NEAT1 +CD163 +单核细胞的基因表达中筛选出22个与脓毒症相关的差异基因,经过数字PCR进一步验证后,最终筛选出碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子(BATF)、原癌基因JUNB、癌胚抗原相关细胞黏附分子4(CEACAM4)、第9号染色体上95开放阅读框(C9orf95)、G蛋白α亚基15(GNA15)、补体C3A受体1(C3AR1)、转录生长因子β1(TGFB1)、线粒体载体同源物1(MTCH1)8个基因,用于构建最终的单核细胞差异基因集。③外部验证结果显示,由于C9orf95基因在GEO数据库的GSE154918及GSE133822两个数据集中均无数据,因此在验证时将其排除。在GSE154918数据集,单核细胞差异基因集中BATF、JUNB、CEACAM4、GNA15、C3AR1、TGFB1、MTCH1的表达在脓毒症组均较健康对照组明显升高(log 2表达量:BATF为12.78±0.08比11.39±0.35,JUNB为16.88±0.07比16.04±0.03,CEACAM4为14.73±0.08比13.77±0.05,GNA15为13.16±0.06比12.30±0.04,C3AR1为14.62±0.13比12.87±0.05,TGFB1为16.95±0.05比16.57±0.36,MTCH1为14.80±0.02比14.61±0.15,均 P<0.05);在GSE133822数据集,基因集中BATF、CEACAM4、GNA15、C3AR1的表达在脓毒症组明显高于健康对照组(log 2表达量:BATF为8.66±0.16比7.92±0.14,CEACAM4为9.20±0.16比8.36±0.20,GNA15为10.66±0.18比10.13±0.16,C3AR1为11.49±0.27比10.48±0.16,均 P<0.05),而JUNB、TGFB1、MTCH1的表达在两组人群中差异无统计学意义。基因集差异分析(GSVA)显示,在GSE154918及GSE133822两个数据集中,脓毒症组单核细胞差异基因集的富集分数均显著高于健康对照组(GSE154918:0.38±0.04比-0.44±0.02,GSE133822:0.56±0.02比0.20±0.05,均 P<0.01)。受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析显示,单核细胞差异基因集在GSE154918及GSE133822两个数据集中对脓毒症早期诊断的ROC曲线下面积(AUC)及95%可信区间(95% CI)分别为0.993(0.980~1.000)和0.944(0.873~1.000),提示其具有可靠的诊断价值。 结论:通过单细胞测序技术及数字PCR技术筛选得到的BATF、JUNB、CEACAM4、GNA15、C3AR1、TGFB1、MTCH1单核细胞差异基因集对脓毒症患者具有良好的早期诊断效能,或许能够为早期诊断脓毒症提供新思路。
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编辑人员丨4天前
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阿扎胞苷对黑素瘤A375细胞HOXA9基因表达及生物学行为的影响
编辑人员丨4天前
目的:研究甲基转移酶抑制剂阿扎胞苷(5-azaC)对黑素瘤A375细胞中同源框A9(HOXA9)基因表达及细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法:1、5、10、20 μmol/L 5-azaC分别作用于体外培养的A375细胞,以未经药物干预的常规培养A375细胞作为对照组,甲基化特异性PCR检测不同浓度5-azaC处理后HOXA9基因启动子区甲基化状态,筛选5-azaC最佳浓度进行后续实验。细胞计数试剂盒(CCK8)检测5-azaC对A375细胞增殖能力的影响,Transwell及细胞划痕实验分析5-azaC对A375细胞侵袭及迁移能力的影响,实时荧光定量PCR及Western印迹检测5-azaC作用后A375细胞中HOXA9 mRNA及蛋白表达水平。两组间比较采用独立样本 t检验。 结果:对照组A375细胞中HOXA9基因启动子区表现为甲基化状态,经5-azaC处理后,A375细胞中HOXA9基因启动子区甲基化与非甲基化状态并存,且随5-azaC处理浓度的增加,HOXA9基因去甲基化程度越高,因此选择20 μmol/L 5-azaC浓度处理A375细胞72 h作为5-azaC处理组,用于后续实验。与对照组相比,5-azaC处理组A375细胞增殖能力显著降低(72.46% ± 2.19%比100%, t = 28.09, P < 0.001),侵袭细胞数量显著减少[(242.70 ± 29.19)个比(466.00 ± 22.65)个, t = 10.47, P < 0.001],迁移能力减弱(27.56% ± 2.74%比35.69% ± 2.50%, t = 3.79, P = 0.019),HOXA9 mRNA表达量升高(1.73 ± 0.28比1.01 ± 0.15, t = 3.93, P = 0.017),HOXA9蛋白表达量增多(0.62 ± 0.03比0.50 ± 0.01, t = 3.82, P = 0.019)。 结论:5-azaC能够降低黑素瘤细胞株A375的增殖、侵袭、迁移能力,且该过程可能机制之一是5-azaC反转HOXA9基因启动子区甲基化状态,激活基因表达,从而参与调控黑素瘤细胞生物学行为。
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编辑人员丨4天前
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利用CRISPR/Cas9技术对 VSX2绿色荧光报告基因人诱导多能干细胞系的构建
编辑人员丨5天前
目的:构建表达视觉系统同源框2( VSX2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。 方法:根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理,设计 VSX2的小向导RNA(sgRNA),构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒;2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系,采用嘌呤霉素筛选获得单克隆,扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型;采用核型分析法分析报告细胞系核型;采用STR法排除细胞交叉污染;采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达;通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力;应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官,并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。 结果:电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有 VSX2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明,BC1- VSX2 eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明,BC1- VSX2 eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性,包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明,由BC1- VSX2 eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性;eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。 结论:成功构建1株表达 VSX2-eGFP报告基因的hiPSCs,该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化,为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。
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编辑人员丨5天前
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ATF6与IRE1XBP1在氧糖剥夺/复氧损伤HT22细胞中的交互作用
编辑人员丨5天前
目的:研究转录激活因子6(ATF6)与需肌醇酶1-X-框结合蛋白1(IRE1-XBP1)在氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤小鼠海马神经元(HT22)细胞中的交互作用。方法:复制OGD/R损伤HT22细胞模型,观察OGD/R后不同时间点(0、3、6、12、24 h)内质网应激(ERS)、细胞活性和凋亡的变化。将对数生长期的HT22细胞分为空白对照组、对照+ATF6激动剂AA147组、对照+IRE1抑制剂4μ8c组、OGD/R模型组、OGD/R+AA147组、OGD/R+4μ8c组(AA147组和4μ8c组于全程添加10 μmol/L AA147或16 μmol/L 4μ8c)。采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测各组HT22细胞ERS相关蛋白〔葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化需肌醇酶1(p-IRE1)、磷酸化真核细胞翻译起始因子2α(p-eIF2α)〕以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、活化caspase-3的表达;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ERS相关基因以及ATF6〔同型半胱氨酸内质网应激泛素样结构域1(Herpud1)、蛋白二硫键异构酶家族成员4(Pdia4)、Lin-12样抑制子/增强子(Sel1L)〕和剪接型X-框结合蛋白1〔XBP1s,包括DnaJ热休克蛋白成员B9(Erdj4)、Sec24相关基因家族成员D(Sec24d)、信号受体序列3(Ssr3)〕介导的转录反应相关基因的mRNA表达;采用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞活性;采用免疫荧光法检测活化caspase-3表达。结果:与空白对照组比较,ERS相关蛋白p-IRE1和p-eIF2α的蛋白表达量分别在OGD/R 12 h、OGD/R 3 h升高(p-IRE1/β-actin:2.09±0.10比1.00±0.00,p-eIF2α/β-actin:1.39±0.11比1.00±0.00,均 P<0.01),ERS相关基因ATF6、XBP1s、非剪接型X-框结合蛋白1(XBP1u)、转录激活因子4(ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的mRNA表达量在OGD/R后不同时间点也明显升高,表明ERS在OGD/R作用的HT22细胞中被激活。与OGD/R模型组比较,OGD/R+AA147组p-IRE1蛋白表达量无改变,但XBP1s和XBP1u的mRNA表达量明显下降〔XBP1s(2 -ΔΔCt):0.76(0.71,0.92)比1.13(1.03,1.29),XBP1u(2 -ΔΔCt):0.29±0.05比0.52±0.04,均 P<0.01〕,而XBP1s介导的转录反应相关基因表达量无明显改变。与OGD/R模型组比较,在使用4μ8c后短链ATF6(sATF6)和GRP78的蛋白表达量无明显改变,ATF6介导的转录反应相关基因的mRNA也无明显改变。提示ATF6的激活能抑制XBP1s和XBP1u的mRNA表达,但ATF6与XBP1s介导的转录反应无交互作用。与空白对照组比较,HT22细胞活性在OGD/R 3 h时显著降低〔(44.64±5.12)%比(99.13±5.76)%, P<0.01〕,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值和活化caspase-3/caspase-3比值分别在OGD/R 3 h和OGD/R 0 h显著升高(Bax/Bcl-2比值:6.15±1.65比1.00±0.00,活化caspase-3/caspase-3比值:17.48±2.75比1.00±0.00,均 P<0.01),表明凋亡在OGD/R作用的HT22细胞中被激活。与OGD/R模型组比较,OGD/R+AA147组细胞活性显著下降〔(36.52±17.78)%比(69.90±9.43)%, P<0.01〕,Bax/Bcl-2比值和活化caspase-3/caspase-3比值明显升高(Bax/Bcl-2比值:2.06±0.31比1.10±0.25,活化caspase-3/caspase-3比值:3.35±0.59比0.55±0.09,均 P<0.01)。 结论:在OGD/R损伤HT22细胞中,ATF6和XBP1s介导的转录反应无明显交互作用,但AA147激活的ATF6能抑制XBP1s和XBP1u的mRNA表达并促进应激HT22细胞中死亡的发生。
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编辑人员丨5天前
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一个杂合缺失变异致遗传性蛋白C缺陷症家系的表型和基因型分析
编辑人员丨5天前
目的:分析1个遗传性蛋白C(protein C,PC)缺陷症家系的表型和基因变异。方法:对先证者及家系成员(共4代11人)采用发色底物法检测血浆蛋白C活性(protein C activity,PC:A),酶联免疫吸附法检测蛋白C抗原(protein C antigen,PC:Ag)含量。PCR法对先证者蛋白C基因(protein C, PROC)的9个外显子及侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后进行直接测序;对发现的疑似变异用克隆测序予以验证,并对家系其他成员相同变异位点进行检测。分别用生物信息学软件Mutation Taster和ClustalX-2.1-win分析变异的致病性和保守性;用Swiss-PdbViewer软件分析蛋白质三维模型和变异氨基酸之间的相互作用。 结果:先证者PC:A和PC:Ag分别降至46%和50%,其奶奶、大姑、表姐和弟弟的PC:A和PC:Ag也有不同程度的下降,为正常参考值的50%左右。基因分析显示,上述5名成员 PROC第9外显子均存在c.1212-1212delG(p.Met364Trp fsX15)杂合缺失变异,该缺失变异导致第364位的甲硫氨酸(Met)变成色氨酸(Trp)后框移了15个氨基酸,并在第378位产生提前的终止密码子,最后形成截短蛋白。MutationTaster评分结果为1.000,预示该杂合缺失变异为致病变异;保守性分析显示15个框移的氨基酸在9种同源物种中均位于保守区域;蛋白质模型分析显示该缺失变异破坏了PC的催化结构域,从而影响PC的功能。 结论:先证者 PROC第9外显子存在c.1212-1212delG(p.Met364Trp fsX15)杂合缺失变异,可能是导致该家系PC:A和PC:Ag减少的主要原因。
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编辑人员丨5天前
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2021年湖南省人民医院新生儿副肠孤病毒的遗传进化分析
编辑人员丨5天前
目的:初步了解湖南省人民医院新生儿中副肠孤病毒的流行情况,分析其遗传进化特征。方法:2021年6~9月份在湖南省人民医院采集住院新生儿粪便标本,采用TaqMan real-time qPCR和RT-PCR方法进行人副肠孤病毒(human parechovirus, HPeV)的筛查和分型,采用高通量测序和RT-PCR方法扩增其全基因组,序列测定后进行系统发育分析。结果:共采集新生儿粪便样本123份,其中HPeV阳性为22份,阳性率为17.89%,分型结果显示所有毒株均属于HPeV-1基因型;扩增获得1株HPeV基因组全长为7 269 bp,命名为Hunan/HPeV/2021,该基因组具有典型的HPeV基因组结构;序列比对结果显示该毒株与GenBank中已知的HPeV-1型的基因组核苷酸序列具有最高同源性,为86.6%~91.9%;其编码的唯一的长开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为6 540 nt,与已知相似序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.3%~92.6%和97.3%~98.3%;系统发育分析显示该病毒株属于HPeV-1型进化分支,与我国流行的HPeV-1型毒株聚为同一分支。结论:在湖南省人民医院新生儿中HPeV具有较高的检出率且均为HPeV-1型。
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编辑人员丨5天前
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DLG3基因p.S434S同义变异致智力障碍家系分析及产前诊断1例
编辑人员丨5天前
目的:对1个智力障碍家系进行致病基因鉴定及产前诊断。方法:家系3代17人,4例男性罹患智力障碍,2019年10月先证者之姐于孕8周时就诊于河南省人民医院要求遗传咨询。签署知情同意书后,采集家系成员外周血,采用全外显子组测序分析先证者(Ⅱ-9,男)及父母基因编码序列,筛选候选致病变异,运用Sanger测序进行候选变异与表型共分离分析。采用同源重组构建候选变异表达载体,进行体外剪接实验,应用逆转录聚合酶链反应、TA克隆和Sanger测序分析候选致病变异对剪接的影响。明确智力障碍的遗传学病因后,采用goldeneyeTM20A基因分型系统和Sanger测序为先证者之姐(Ⅱ-7)进行产前诊断。结果:全外显子组测序结果显示先证者携带 DLG3基因c.1302G>A(p. S434S)半合子同义变异,该变异与家系内患者表型共分离,先证者之母(Ⅰ-1)为该变异杂合携带者。体外剪接实验结果显示c.1302G>A变异明显影响RNA的正常剪接,88.24%的转录本剪接异常,导致阅读框移码,蛋白功能受损。产前诊断胎儿(Ⅲ-7)羊水未检测到该变异,男胎活产,现1岁6月龄,精神行为发育未见异常,继续随访中。 结论:DLG3基因c.1302G>A同义变异是导致该家系X连锁智力障碍的原因。
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编辑人员丨5天前
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外泌体源性长链非编码RNA同源框基因A-反义转录本3通过吸附微小RNA-29b-3p调节前列腺癌去势抵抗的作用机制
编辑人员丨5天前
目的:探讨外泌体来源长链非编码RNA(lncRNA)同源框基因A-反义转录本3(HOXA-AS3)对前列腺癌(PCa)去势抵抗的作用机制。方法:建立PC-3与LNCaP共培养体系,用双荧光素酶报告基因检测、荧光定量聚合酶链反应(PCR)和挽救实验等验证HOXA-AS3参与PCa去势抵抗和进展的机制。采用动物实验和人PCa组织切片,探究HOXA-AS3在由雄激素依赖性向非依赖性的转化过程中的作用。采用两样本 t检验和单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计分析。 结果:ASO-NC转染组LNCaP细胞侵袭数量显著低于ASO-miR-29b-3p转染组[(116.00±5.10)个比(146.33±4.78)个, t=6.135, P<0.05],NC转染PC-3组显著高于miR-29b-3p mimic转染组[(394.33±11.95)个比(111.67±7.41)个, t=28.425, P<0.05]。LNCaP-HOXA-AS3-exo中HOXA-AS3显著高于LNCaP-exo(1.46±0.08比1.01±0.02, t=7.634, P<0.05),而PC-3-HOXA-AS3-ASO-exo中HOXA-AS3显著低于PC-3-exo(0.53±0.06比1.00±0.09, t=5.943, P<0.05)。转染miR-29b-3p-mimic组的野生型HOXA-AS3、野生型STAT3-3和野生型Mcl-1组的细胞荧光素酶活性低于对照组(1.00±0.04比0.51±0.02、1.00±0.02比0.56±0.04、1.00±0.02比0.57±0.02, t=18.058、15.857、26.081, P<0.01)。同时转染pcDNA3.1-STAT3和Mcl-1-promotor载体组免疫荧光强度高于对照组(1.72±0.05比1.00±0.03, t=18.717, P<0.05),并且cytochrome c和Caspase-9的表达低于对照组(0.46±0.01比0.81±0.01、0.28±0.01比0.59±0.01, t=92.492、97.212, P<0.01)。 结论:HOXA-AS3通过吸附miR-29b-3p调节STAT3/Mcl-1/cytochrome c/Caspase-9轴,调节PCa的去势抵抗。
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编辑人员丨5天前
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2020—2021年山东省水痘-带状疱疹病毒基因特征分析
编辑人员丨5天前
目的:分析2020—2021年山东省水痘-带状疱疹病毒(VZV)的基因特征。方法:于2020年1月到2021年12月收集85份山东省疑似水痘患者的疱疹液样本,采用实时荧光定量PCR检测VZV核酸,筛查疑似样本。通过PCR和Sanger法测序检测阳性样本的开放阅读框(ORF)ORF22片段和ORF38片段的6个单核苷酸多态性(SNP)位点,确定病毒基因型别;检测ORF38片段和ORF62片段的4个SNP位点鉴别疫苗株和野毒株。从GenBank数据库上下载VZV各基因型参考序列,采用Sequencher软件和Mega7软件进行序列分析。结果:85份疑似水痘样本中,有80份样本为VZV阳性,均为野毒株,属于clade 2遗传分支。80株序列与clade 2代表株相比,ORF22片段的核苷酸与氨基酸的同源性分别为99.5%~100%和98.5%~100%。其中病毒毒株SD20-1、SD20-5、SD20-6、SD20-8、SD20-9、SD20-10、SD20-11、SD20-12、SD20-13、SD20-30和SD20-31均在37990位点发生A?G的碱基突变,导致所编码氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸;SD21-1在38059位点发生C?A的碱基突变,导致编码苏氨酸变为天冬酰胺。结论:2020—2021年山东省VZV基因型均属于clade 2型别的野毒株。
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编辑人员丨5天前
