目的:探索开发一种靶向CLL-1的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）并验证其功能。方法:通过流式细胞术检测急性髓系白血病（AML）细胞系和AML原代细胞CLL-1靶点的表达水平。构建CLL-1 CAR载体并制备出相应慢病毒，感染激活后T细胞生产出CAR-T细胞，并通过体外和体内实验验证CLL-1 CAR-T细胞的功能。结果:AML细胞系和原代AML细胞中均表达CLL-1。制备的CLL-1 CAR-T细胞转导率为77.82%，在AML细胞系以及AML原代细胞中，CLL-1 CAR-T细胞能明显特异性杀伤表达CLL-1的靶细胞系和原代肿瘤细胞。相对于未转导的T细胞，CLL-1 CAR-T细胞在杀伤靶细胞和原代肿瘤细胞时分泌IL-6、IFN-γ等细胞因子水平更高（ P值均<0.001）。在AML人源性异种移植小鼠模型中，相对于未转导的T细胞，CLL-1 CAR-T细胞表现出有效的抗白血病活性并延长小鼠存活时间[未达到对22（95% CI 19~24）d， P=0.002]。 结论:靶向CLL-1的CAR-T细胞成功开发并具有较好的肿瘤杀伤作用。

目的:比较不同培养方法建立不同类型的人诱导多能干细胞（hiPSC）的嵌合情况,筛选高异种嵌合能力的hiPSC。方法:2022年9月至2023年10月,中山大学附属第一医院显微创伤手外科根据文献报道的方法,使用100只雌性C57小鼠、20只雄性C57小鼠和10只多重免疫缺陷鼠（NOD/SCID），通过不同的化学小分子诱导培养方法建立8细胞期胚胎样细胞（8CLC）、潜能扩展多能干细胞（EPS）、原始态多能干细胞（Na?ve iPSC）、形成态多能干细胞（Formative iPSC）和始发态多能干细胞（Primed iPSC）。利用形态学观察、细胞免疫荧光、实时荧光定量PCR和畸胎瘤形成进行细胞系鉴定。将各种不同的细胞系使用CRISRR/CAS 9基因编辑技术标记GFP,筛选并扩增阳性细胞后,进行小鼠囊胚期注射,每次注射10个细胞形成嵌合胚胎，并将嵌合胚胎进行体外胚胎培养,观察评估嵌合情况。所有计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示,各亚组间的比较均先采用ANOVA单因素方差分析,再通过Bonferroni法进行两两比较, P<0.05表示差异有统计学意义。 结果:依据形态学、细胞免疫荧光、实时荧光定量PCR、畸胎瘤形成实验的鉴定与验证,成功培养出了8CLC、EPS、Na?ve、Formative、Primed这5种代表胚胎发育不同阶段的iPSC细胞系。小鼠囊胚期注射后进行体外培养,发现8CLC和Na?ve iPSC相比其他细胞系,第3天（两细胞系分别为74.28%和56.00%）和第5天（分别为62.85%和40.00%）的GFP阳性率更高,差异有统计学意义（ P<0.05）。 结论:8CLC和Na?ve iPSC作为供体细胞更有利于人-鼠异种嵌合胚胎的体外培养,有益于提高人-鼠异种嵌合后胚胎的嵌合率。

目的:探讨带感觉功能上臂外侧嵌合骨皮瓣修复手指复合组织缺损的临床效果。方法:回顾性研究。纳入2016年11月—2019年11月徐州仁慈医院手外科收治的6例手指软组织缺损伴指骨、神经缺损患者。其中，男4例，女2例；年龄33～61岁，平均47.3岁；右手2例，左手4例；拇、示、中指各1例，环指3例；皮肤缺损面积1.0 cm×1.5 cm～2.5 cm×3.0 cm，骨缺损长度1.5～2.5 cm。6例患者均采用一期创面彻底清创，创面缺损伴指骨、神经缺损先行异种皮覆盖创面，克氏针维持骨折稳定性；二期带感觉功能的上臂外侧嵌合骨皮瓣游离移植修复治疗，皮瓣设计面积1.5 cm×2.0 cm～3.0 cm×3.5 cm，骨瓣切取大小为1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm～3.0 cm×1.5 cm×1.0 cm。术后采用中华医学会手外科学会手部功能评定标准评价手功能，英国医学研究委员会（BMRC）制定的感觉分级方法评价皮瓣感觉恢复效果，Michigan手部功能问卷评定标准评定患指外观满意度。结果:本组6例患者手术均顺利完成，术后随访3～7个月，平均13.5个月。6例皮瓣全部成活，骨折均愈合，骨瓣平均愈合时间3～6个月，平均3.5个月。供区直接缝合，创面均一期愈合。手部功能优5例、良1例，手指感觉恢复至S4级4例、S3+级2例，患指外观满意度评价非常满意1例、满意4例、一般1例。结论:带感觉功能的上臂外侧嵌合骨皮瓣游离移植，可同时修复手指软组织缺损和指骨缺损，对供区影响小，术后手指感觉功能恢复好，是修复手指复合组织缺损的备选方案之一。

目的:探索不同放疗方式与嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞协同治疗大肿块型淋巴瘤的疗效.方法:建立大肿块型淋巴瘤异种移植小鼠模型,使用低、中、高剂量的X射线对小鼠进行照射,测量照射后各组小鼠肿瘤体积的变化情况.再将低、中、高剂量的X射线分别与CAR-T细胞联用对小鼠进行治疗,记录不同的联用方式治疗后肿瘤体积的变化情况和各组小鼠的生存时间,使用流式细胞术检测各组小鼠外周血和肿瘤内CAR-T细胞占比的差异,观察治疗后各组小鼠的不良反应.结果:单纯X射线治疗无法控制巨块型淋巴瘤小鼠的肿瘤进展,而分别将低、中、高剂量的X射线与CAR-T细胞联用则均能使小鼠的肿瘤体积缩小.与低剂量联合组相比,中、高剂量联合组小鼠的肿瘤体积缩小更显著且未见重新增大的迹象(F组间=1 052.364,F 时间=14 861.095,F交互=49.864,均 P＜0.001;组间均 P＜0.05),此外,中剂量联合组[HR=21.880(3.884～124.600),Log-rank x2=12.090,P＜0.01]和高剂量联合组[HR=21.880(3.884～124.600),Log-rankx2=12.090,P＜0.01]小鼠生存期也均明显延长.中、高剂量X射线可能更利于CAR-T细胞的瘤内浸润,与低剂量联合组相比,中(t=28.200,P＜0.05)、高(t=23.960,P＜0.05)剂量联合组在治疗后第14天的瘤内CAR-T细胞比例均明显增加.不同联用方式的不良反应大多在可耐受范围内.结论:与低剂量X射线相比,中、高剂量X射线能与CD19 CAR-T细胞协同更有效地治疗大肿块型淋巴瘤.

目的 基于衔接蛋白DAP12 的多链嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)开发靶向 CD30 的 CAR-T 细胞药物,研究CD30 CAR-T对霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞的体外和体内临床前药效.方法 通过基因合成和分子克隆技术,设计构建靶向CD30 的CAR质粒,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染T细胞,其中靶向 CD30 的多链 CAR-T 为 CD30-KIRS2/Dap12-BB组,单链二代CAR-T为CD30-41BBζ组,未做病毒侵染的T细胞为NTD组,利用流式细胞术检测CAR阳性率情况,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放检测细胞的杀伤活性,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子干扰素γ(IFN-γ)的分泌水平,进一步通过小鼠异种移植瘤模型检测CD30 CAR-T在小鼠体内抗肿瘤活性.结果 靶向CD30 的多链CAR-T和单链二代 CAR-T进行对比,研究发现多链CAR-T与单链 CAR-T 的杀瘤作用相似.但值得注意的是,多链CAR-T 的IFN-γ 分泌水平更高(P<0.001).更重要的是,在小鼠的肿瘤模型实验中,多链 CAR-T 实现了肿瘤的完全消退.结论 靶向CD30 的多链CAR-T在抗肿瘤活性方面优于传统单链CAR-T.

目的:构建猪-小鼠肝细胞嵌合模型,探讨猪肝细胞在无T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)介导排斥条件下的移植及再生的相关条件,评估猪肝细胞在异种受体中的定居、增殖和功能因子分泌情况,为提高猪源化小鼠模型中猪肝细胞的重建效率提供依据.方法:采用脾脏内注射法将猪肝细胞移植至Fah-/-Rag2-/-IL2Rg-/-(FRG)小鼠体内,构建移植模型.将 16 只FRG小鼠随机分为对照组、空白对照组、实验组和绿色荧光蛋白(GFP)基因实验组,每组4只.空白对照组小鼠停止给予2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,4-环己二酮(NTBC),监测体质量;对照组4只小鼠注射猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降20%时,给予NTBC 3 d;实验组小鼠注射猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降 20%时,给予NTBC 3 d;GFP基因实验组小鼠注射携带GFP基因猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降 20%时,给予NTBC 3 d.观察各组小鼠体质量、生存情况.检测各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,流式细胞术检测各组小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+细胞表达情况,ELISA法检测各组小鼠血清中猪白蛋白表达水平,免疫组织化学法检测各组小鼠猪肝细胞再生效率.结果:与剪碎后再以胶原酶消化的方式比较,两步灌注法消化过程更温和、对细胞损伤更小,细胞活性可以达到92%.停止给予NTBC后,对照组小鼠体质量进行性降低,生命活力逐渐降低.连续停药第28天小鼠开始出现死亡现象.小鼠肝组织中出现肝细胞肿大、细胞浆疏松透亮和细胞核溶解等不可逆细胞损伤.空白对照组小鼠停药后血清中ALT水平逐渐升高.对照组停药小鼠重新给予NTBC后,体质量逐渐恢复至正常水平.流式细胞术,停止给予NTBC后,小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+细胞完全缺失.免疫组织化学染色,实验组小鼠肝组织中未见深色Fah+阳性细胞,移植小鼠肝组织中可见深色Fah+阳性细胞,猪肝细胞再生效率为(11±4)%.GFP基因实验组小鼠可见同一视野经三色激光分别激发,猪肝细胞再生效率为(10±2)%.结论:成功构建了猪源化FRG小鼠肝脏嵌合模型,建立了长效稳定扩增猪肝细胞的小鼠模型.

非法植入基因编辑罪中"情节严重"的司法认定是本罪的关键,能反映违法程度提升的主观与客观要素.主观不法要素主要指编辑目的,客观不法要素包括行为不法与结果不法,行为不法要考虑编辑阶段、脱靶与嵌合体风险大小、可遗传性等,结果不法指可能造成的损害后果.因此,异种基因编辑胚胎互植行为、造成被编辑胚胎及其所发育婴儿重伤或死亡的均属于"情节严重".造成被编辑胚胎及其所发育婴儿轻伤害结果、脱靶或嵌合体风险大的同种植入行为,是否构成犯罪,需结合"利弊""必要性""可容许性"明确"情节严重"内涵与类型有助于合理规制非法植入基因编辑罪.

为了研究人类造血功能异常,学者们不断改进和发展白血病干细胞的异种移植模型.构建理想的异种移植模型,真实地模拟疾病,在研究人类白血病的分子机制及完善其治疗方案中尤为重要.人造血淋巴系统小鼠(humanized hematolymphoid system mice,HHLS)是异种移植了人源血细胞或组织的免疫缺陷鼠或者表达人类基因的人鼠嵌合体(mouse-human chimaeras)或称人源化小鼠(humanized mice).理想的人源化小鼠即是人类移植物在空间和功能上完全替代小鼠的内源性造血和免疫系统.要实现这一目标,需要满足三个基本要求:首先,受体小鼠需要具有先天或者后天的免疫缺陷,以防止小鼠内源性免疫系统对人体移植物的异种移植排斥;第二,小鼠体内需要产生适合人类细胞生存的微环境;第三,人类细胞需要从小鼠体内获得支持性交叉反应信号.本文对HHLS模型的最新研究进展作一综述.

目的:制备靶向EGFRvⅢ的第三代CAR-T(EGFRvⅢ/3CAR-T),检测其在体外和体内对EGFRvI+ U87胶质瘤细胞的特异性杀伤效应.方法:用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染HEK293T细胞包装EGFRvⅢ/3CAR慢病毒(LV-EGFRvⅢ/3CAR),感染健康人CD3+T细胞,Western blotting和流式细胞术检测T细胞中EGFRvⅢ/3CAR的表达水平,51Cr释放法检测EGFRvⅢ/3CAR-T对EGFRvⅢ+ U87细胞的体外杀伤效应,ELISA法检测EGFRvⅢ/3CAR+T的IFN-γ分泌水平.构建裸鼠异种胶质瘤移植模型,检测EGFRvⅢ/3CAR-T对移植瘤的体内杀伤活性.结果:EGFRvⅢ/3CAR慢病毒包装成功,滴度值为5×106 TU/ml.Western blotting在相对分子质量58 000处检测到EGFRvⅢ/3CAR表达,未转导组无相同分子量蛋白表达.流式细胞术检测结果显示EGFRvⅢ/3CAR转导效率平均为52.3％,51Cr释放法检测EGFRvⅢ/3CAR-T特异性杀伤作用与E∶T值(E∶T为4∶1、为8∶1、16∶1、32∶1)呈正比关系.ELISA法检测到细胞因子IFN-γ分泌量为(1 836±148.2) pg/ml,与NTT和GFP+T细胞相比差异有统计学意义(P＜0.01).EGFRvⅢ/3CAR+T细胞的特异性杀伤活性及IFN-γ分泌均依赖于EGFRvⅢ在U87细胞中的表达水平.体内肿瘤生长检测结果显示,注射后3周EGFRvⅢ/3CAR+T组肿瘤体积较GFP+T细胞和PBS组差异有统计学意义(P＜0.01).结论:EGFRvⅢ/3CAR-T在体外和体内均能发挥靶向杀伤EGFRvⅢ+脑胶质瘤细胞的作用,为后续临床试验提供依据.

近年来,肿瘤免疫调控机制逐渐清晰,随着嵌合抗原受体T细胞免疫疗法获美国FDA批准上市,揭开了肿瘤免疫治疗的新篇章.在肿瘤免疫治疗药物临床前评价过程中,传统的免疫缺陷动物模型存在较多的限制和缺陷,无法模拟人体内肿瘤微环境,也无法针对免疫治疗药物的作用机制反映出药物的靶点毒性.近年来,由于基因编辑技术及干细胞培养技术的不断进步,实验动物的人源化技术取得了巨大的进步.本文总结了目前可用于肿瘤免疫治疗药物研究的3种人源化动物模型(重建人免疫系统动物模型、重建人免疫系统+人源肿瘤组织异种移植动物模型和基因修饰的人源化动物模型)的特点和应用范围,希望为研究者在肿瘤免疫治疗药物临床前开发过程中选择合适的动物模型提供参考.