目的:通过在单细胞水平分析小鼠磨牙细胞间异质性，构建牙髓细胞发育的时空图谱，进一步揭示牙齿发育的过程和调控机制。方法:分别收集出生后0、3 d的C57BL/6小鼠下颌第一磨牙各10颗，制备单细胞悬液，采用单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术进行测序。从本课题组前期研究中提取出生后7 d小鼠磨牙scRNA-seq数据，与0、3 d数据进行合并分析。使用Seurat程序对测序数据进行质控、标准化、降维和聚类分析；Monocle程序进行拟时序分析，预测发育轨迹；Scillus程序进行基因本体分析，对细胞功能进行注释。使用原位杂交技术对标记基因进行体内定位，明确不同亚群细胞的体内分布和时空变化。结果:Seurat分析显示小鼠磨牙细胞具有26个细胞亚群，可分为牙髓细胞、牙囊细胞、上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞、管周细胞、胶质细胞和红细胞等八大类细胞，其中牙髓细胞包含5个亚群：成熟牙髓细胞，标记基因为柯萨奇病毒腺病毒受体（coxsackie virus and adenovirus receptor，Cxadr）；牙乳头细胞，标记基因为SPARC相关模块化钙结合蛋白2（SPARC related modular calcium binding 2，Smoc2）；周期细胞，标记基因为Ⅱ型DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase Ⅱ alpha，Top2a）；前成牙本质细胞，标记基因为棕榈酰蛋白羧酸酯酶（notum palmitoleoyl-protein carboxylesterase，Notum）；成牙本质细胞，标记基因为牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，Dspp）。随着牙胚发育，成熟牙髓细胞的比例逐渐增加，周期细胞和成牙本质细胞比例逐渐降低。原位杂交染色和基因本体分析结果显示，Cxadr+成熟牙髓细胞定位于牙冠上部，主要功能为成骨和“细胞外结构组织”；Smoc2+牙乳头细胞位于根尖，主要功能与“细胞外结构组织”和器官发育相关；Top2a+周期细胞位于牙冠下部，进行有丝分裂；Notum+前成牙本质细胞邻近上皮根鞘，和Dspp+成牙本质细胞的主要功能同为生物矿化。Monocle分析显示牙髓细胞有2条发育轨迹，从Smoc2+牙乳头细胞起始，经过Top2a+周期细胞，再分化为Cxadr+成熟牙髓细胞或成牙本质细胞。结论:scRNA-seq技术能在转录组水平充分揭示细胞间的异质性，为研究器官发育过程和调控机制提供了有力工具。

背景:甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl,Gel-MA)与经处理牙本质基质(treated dentin matrix,TDM)在一定比例下经过紫外线交联后形成的复合水凝胶支架具有良好的孔隙率、机械性能、溶胀性能及生物降解率,这为临床上年轻恒牙的牙髓再生提供了新的思路和方法.目的:探究1∶2质量比Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架对人牙髓干细胞增殖能力及成骨/成牙本质分化能力的影响.方法:将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中,采用CCK-8实验检测人牙髓干细胞在复合水凝胶支架中的增殖能力.将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中并进行成骨诱导,采用碱性磷酸酶染色及茜素红染色观察矿化结节的形成情况,采用RT-PCR检测成牙相关因子(牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白)和成骨相关因子(骨钙素、Runt相关转录因子2)的基因表达.结果与结论:①CCK-8检测结果显示,前7 d的牙髓干细胞增殖能力明显升高,第10天时速度减缓;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节生成强于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05);③RT-PCR结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞中牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因表达量明显高于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05),且14 d基因表达量明显高于7 d(P<0.05).结果表明,培养在1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上的牙髓干细胞表现出较好的增殖能力,能够强化牙髓干细胞的成骨、成牙本质分化能力.

目的:探索巨噬细胞(Mφ)极化对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成牙骨质分化的影响及作用机制.方法:将THP-1 人单核细胞分别诱导为M0、M1和M2型Mφ,用RPMI 1640基础培养基或不同极化状态Mφ来源的上清液与成牙骨质诱导液等比例混合制备条件培养基(CM-Control、CM-M0、CM-M1和CM-M2)用于培养hPDLSCs,将条件培养基培养的hPDLSCs形成的细胞膜片包裹人脱矿牙本质基质(TDM)移植至裸鼠皮下进行异位牙骨质形成实验.以CM-Control组作为对照,通过HE染色实验观察类牙骨质样组织的形成;免疫荧光染色(IMF)和qRT-PCR,检测成牙骨质分化标记物骨涎蛋白(BSP)、牙骨质附着蛋白(CAP)和牙骨质蛋白-1(CEMP-1),氧化-抗氧化体系标记物超氧化物歧化酶1(SOD1)和核转录因子红系2相关因子2(NRF2)以及线粒体自噬标记物PTEN诱导假定激酶1(PINK1)和微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)的表达水平.结果:体内实验中,CM-M2组形成的类牙骨质样组织更多,CAP、CEMP-1蛋白表达量更高且伴随SOD1蛋白和PINK1、LC3蛋白表达水平升高,NRF2蛋白未见明显差异.体外实验中,CM-M2组BSP(P＜0.01)、CAP(P＜0.001)和CEMP-1(P＜0.01)的mRNA水平上升,SOD1的mRNA水平上升(P＜0.05),而NRF2的mRNA水平无统计学差异(P＞0.05),PINK1的mRNA水平上升(P＜0.05).结论:M2型Mφ可能通过上调hPDLSCs的氧化-抗氧化体系和线粒体自噬水平促进hPDLSCs的成牙骨质分化潜能.

目的:探讨连接蛋白43(connexin 43,Cx43)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)成牙本质分化过程中的作用和机制.方法:建立SD大鼠上颌第一磨牙损伤模型,免疫荧光(im munofluorescence,IF)染色检测Cx43在牙髓组织损伤后修复中的表达模式变化.分别采用0、1、10、100和1 000 ng/mL LPS刺激hDPCs 6 h,筛选最适浓度,随后抑制和过表达hDPCs中Cx43的表达.实时定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹法检测Cx43和成牙本质分化相关因子牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dental matrix protein-1,DMP-1)、成骨相关转录因子(osterix,Osx)表达及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)活性变化.进一步对hDPCs施以特异性Cx43通道抑制剂,检测Cx43介导的通道活性在hDPCs成牙本质分化中的作用,初步探讨Cx43调节LPS诱导的hDPCs成牙本质分化的作用和机制.采用SPSS 26.0软件包对数据进行统计学处理.结果:IF结果显示,在健康牙髓组织中,Cx43主要表达于成牙本质细胞层,牙损伤3～24h,Cx43表达减弱,随后逐渐上调,直至正常水平;损伤后3天～2周,表达呈下调趋势,并且表达于成牙本质细胞层和固有牙髓中.以10 ng/mL LPS刺激hDPCs 6 h,可显著上调DSPP的mRNA表达(P＜0.01).抑制Cx43,可显著上调hDPCs内LPS诱导的DSPP、DMP-1和Osx mRNA表达(P＜0.05);过表达Cx43,则显著抑制LPS诱导的成牙本质分化相关因子表达(P＜0.01)和DSPP荧光强度.以10 ng/mL LPS激活hDPCs内ERK信号,过表达Cx43可显著减弱LPS诱导的ERK信号活性(P＜0.01).抑制Cx43介导的半通道,促进LPS诱导的hDPCs成牙本质分化相关因子mRNA表达和ERK信号活性(P＜0.05);而阻断Cx43介导的细胞间通道,则抑制成牙本质分化.结论:Cx43参与调控牙髓组织的损伤后修复,并且其表达整体呈下调趋势;抑制Cx43或阻断HC,可促进LPS诱导的ERK信号活性和hDPCs成牙本质分化.

目的:探讨活化α7乙酰胆碱受体(alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)联合钙离子(calcium ion,Ca2+)对LPS刺激的人牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)牙/骨向分化的影响.方法:分离培养DPSC,流式细胞术对DPSC进行表面标志物表达鉴定.CCK-8检测α7-nAChR激动剂PNU-282987和Ca2+对DPSC增殖的影响.通过碱性磷酸酶(alkaline phos-phatase,ALP)活性和染色筛选PNU-282987促进DPSC表达ALP活性的最佳浓度.用大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)模拟炎性微环境刺激DPSC.采用免疫印迹分析(Western blot,WB)、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)和茜素红染色等方法检测牙/骨向分化的相关蛋白:Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COL-I)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialoprotein,DSPP)、骨钙素(osteopontin,OPN)、ALP、核心转录因子-2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX),相关基因(COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX)和矿化基质表达情况.Fura-2AM用于检测细胞内Ca2+流动情况.结果:CCK-8实验显示,PNU-282987浓度低于10 μmol/L时对细胞增殖无抑制作用,且此浓度处理LPS刺激的DPSC后ALP活性增加最明显;Ca2+浓度低于2 mmol/L对细胞增殖无抑制作用;Western blot和RT-qPCR实验显示,PNU-282987及Ca2+处理后的LPS刺激的DPSC牙/骨向分化相关蛋白(COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX)和相关基因(COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX)的表达及矿化基质形成均明显上调,二者联合后上调最显著(P<0.001).Fura-2 AM钙离子探针结果显示DPSC细胞内Ca2+浓度增加.结论:10 μmol/L PNU-282987联合2 mmol/L Ca2+可以促进LPS刺激的DPSC的牙/骨向分化能力.

目的 探讨Chir99021 对大鼠牙髓干细胞(DPSCs)成骨诱导分化的影响及机制.方法 原代分离大鼠DPSCs,利用荧光免疫法进行验证.设置不同浓度的Chir99021,通过CCK-8 检测细胞增殖情况挑选最适浓度.利用茜素红染色验证细胞成骨诱导分化.最后通过Real-time PCR、Western blotting检测成骨诱导分化相关基因与蛋白无翅型MMTV整合位点家族成员 1(Wnt1)、无翅型 MMTV 整合位点家族成员 3A(Wnt3a)、β-连环蛋白(β-catenin)、轴抑制蛋白2 抗体(Axin2)、骨钙素(OCN)、牙本质基质蛋白1(DMP1)的mRNA和蛋白表达情况.结果 牙本质涎磷蛋白(DSPP)和干细胞标记物波形蛋白(vimentin)阳性表达,说明大鼠 DPSCs 分离成功.大鼠DPSCs成骨诱导后钙沉积物显著上升,加入糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的小分子抑制剂Chir99021 后钙沉积物明显减少.大鼠 DPSCs 成骨诱导分化后 Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN 和 DMP1 表达明显上升,而加入Chir99021 后Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN和DMP1 蛋白表达均显著下降.结论 Chir99021 对诱导 7d后的大鼠DPSCs成骨诱导分化有一定的抑制作用.

背景:牙髓-牙本质再生一直是近几年研究的热点及难点,构建复合生物支架材料为牙髓-牙本质再生提供了新的思路与方法.目的:观察甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质支架对人牙髓干细胞增殖、迁移与成骨分化的影响.方法:将不同质量的经处理牙本质基质分散至甲基丙烯酸酐改性明胶溶液中,使甲基丙烯酸酐改性明胶与经处理牙本质基质的质量比分别为2∶1、1∶1、1∶2,采用冷冻干燥法制备甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质支架,检测支架的微观形貌、吸水率及机械性能.采用不同质量比的支架浸提液、DMEM培养基(对照组)分别培养人牙髓干细胞,检测细胞增殖与迁移情况.采用不同质量比的支架浸提液+成骨诱导液、DMEM培养基+成骨诱导液(对照组)分别培养人牙髓干细胞,碱性磷酸酶染色分析成骨能力.结果与结论:①扫描电镜下可见3组支架均具有多孔结构,随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,支架的孔隙率升高,组间两两比较差异有显著性意义(P＜0.05);随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,支架的吸水率升高,组间两两比较差异有显著性意义(P＜0.05);随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,支架的抗压强度、剪切强度增大.②CCK-8检测显示培养3,5,7 d,2∶1、1∶1、1∶2支架组细胞增殖吸光度值均高于对照组(P＜0.05),并且随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,细胞增殖吸光度值升高(P＜0.05);细胞划痕实验显示2∶1、1∶1、1∶2支架组细胞迁移率均大于对照组(P＜0.05),并且随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,细胞迁移率增大(P＜0.05).③碱性磷酸酶染色显示,2∶1、1∶1、1∶2支架组细胞成骨分化能力均强于对照组,并且随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,细胞成骨能力增强.④结果表明,甲基丙烯酸酐改性明胶与经处理牙本质基质质量比为1∶2的支架最适合牙髓干细胞的增殖与分化.

目的 探讨低浓度氟化钠对人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)成骨/成牙本质分化的影响.方法 本研究已通过单位伦理委员会审查批准.原代培养hDPCs,采用MTT法检测不同浓度氟化钠对hDPCs增殖的影响;选取合适浓度的氟化钠加入成骨/成牙本质分化诱导培养液中,对hDPCs进行体外诱导,通过茜素红染色检测hDPCs成骨/成牙本质分化能力的变化,RT-qPCR检测分化相关基因的mRNA表达;同时通过RT-qPCR和Western blot检测hDPCs成骨/成牙本质分化过程中内质网应激相关基因的表达.结果 低浓度氟化钠(0.1 mmol/L)在体外可刺激hDPCs增殖,高浓度氟化钠(5～10 mmol/L)可抑制hDPCs增殖(P＜0.05).选取0.1 mmol/L氟化钠体外混合成骨/成牙本质分化诱导培养后hDPCs的茜素红染色增加,成骨/成牙本质分化相关基因牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)mRNA表达水平升高(P＜0.05).同时在此过程中RT-qPCR检测出mRNA水平hDPCs内质网应激相关基因:剪切x盒结合蛋白1(splicing x-box binding protein-1,sXBP1)、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)以及活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)表达升高(P＜0.05);Western blot检测出氟化钠混合成骨/成牙本质分化培养后细胞磷酸化真核起始因子-2α(phosphorylated eukary-otic initiation factor-2α,p-eIF2α)、磷酸化蛋白激酶样内质网激酶(phosphorylated the RNA-activated protein kinase-like ER-resident kinase,p-PERK)和ATF4蛋白表达增加(P＜0.05).结论 低剂量氟化钠促进人牙髓细胞的成骨/成牙本质分化并伴有内质网应激水平的升高.

目的:观察微小RNA(miRNA)-148a-3p对人牙髓干细胞(DPSCs)增殖活力及成骨分化的影响,并探讨可能机制.方法:取对数期DPSCs,分为空白组、NC组、inhibitor组、inhibitor+XAV939[无翅型MMTV整合位点家族蛋白(Wnt)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路抑制剂]组.空白组不处理,NC组转染阴性对照质粒miR-148a-3p NC,inhibitor组转染miR-148a-3p inhibitor,inhibitor+XAV939组转染miR-148a-3p inhibitor并加入XAV939(40 μmol/L).转染48 h后qRT-PCR法检测miR-148a-3p表达量;MTT法检测增殖活力;ELISA法检测碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法检测矿化能力;双荧光素酶实验验证miR-148a-3p靶向基因;Western blot法检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-catenin、Runt相关转录因子2(Runx2)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP-1)以及Wnt1蛋白相对表达量.结果:与空白组、NC组比较,inhibitor组24 h、48 h、72 h吸光度值,GSK-3β蛋白表达量降低,ALP活性值,矿化结节面积占比,β-catenin、Runx2、DSPP、DMP-1 以及 Wnt1 蛋白表达量升高(P＜0.05);与 inhibitor组比较,inhibitor+XAV939组24 h、48 h、72 h吸光度值,GSK-3β蛋白表达量升高,ALP活性值,矿化结节面积占比,β-catenin、Runx2、DSPP、DMP-1以及Wnt1蛋白表达量降低(P＜0.05).结论:抑制miR-148a-3p表达可提升DPSCs增殖活力并促进其成骨分化,推测其作用机制与负向调控下游的靶基因Wnt1有关.

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子 1α(PGC-1α)在人根尖牙乳头干细胞(hSCAPs)定向分化中的作用.方法:hSCAPs矿化诱导 0、3、7 d,实时荧光定量PCR检测PGC-1α的基因表达水平.转染小干扰RNA(siRNA)构建稳定低表达PGC-1α的hSCAPs,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测PGC-1α的表达水平,采用碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色分别检测ALP活性和矿化水平的变化,Western blot和实时荧光定量PCR检测成牙/骨向分化相关蛋白和基因的变化.结果:PGC-1α的基因表达水平在hSCAPs定向分化过程中逐渐上调.与对照组相比,低表达PGC-1α的hSCAPs其ALP表达量下降,矿化结节减少,牙本质涎磷蛋白(DSPP)、ALP、Runt相关转录因子 2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)等成牙/骨向分化相关指标表达水平下调(P＜0.05).结论:沉默PGC-1α表达可抑制hSCAPs定向分化.