目的 利用蛋白质组学寻找抑制冠心病血瘀证的关键蛋白,并基于核因子(nuclear factoer,NF)-κB炎性信号通路和内皮细胞活化模型验证关键蛋白纤维连接蛋白(fibronectin 1,Fn)对冠心病血瘀证的作用.方法 将冠心病血瘀证组患者和健康组受试者的血清进行相对定量和绝对定量的等比标记(isobaic tag for relative and absolute quantitation,ITRAQ)蛋白质组学分析,将差异蛋白进行GO和KEGG功能富集,从与冠心病密切相关的富集通路中筛选出关键蛋白Fn.利用 60 μg/mL的氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)构建内皮细胞活化模型,在内皮细胞活化模型中加入 5 μg/cm2、10 μg/cm2、20 μg/cm23个浓度的血浆Fn或敲减内皮细胞来源Fn的方法进行干预.分组为空白组、模型组、对照组、FnEC-KD 组、Fn5 组、Fn10 组、Fn20 组.细胞免疫荧光法和免疫印迹法检测各组 NF-κB 核位移和 NF-κB 蛋白表达水平,ELISA 检测培养上清的细胞间黏附分子(intercellular cell adhesion molecule,ICAM)-1、血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule,VCAM)-1、前列环素 I-2(Proataglandin-I-2,PGI2)、内皮素的蛋白含量.结果 血清蛋白质组学结果显示健康组和冠心病血瘀证组存在 121 种差异蛋白,51 种血瘀证组下调蛋白集中在补体与凝血级联、肌动蛋白细胞骨架的调节、细胞外基质-受体相互作用途径,70 种血瘀证组上调蛋白集中在补体与凝血级联、肌动蛋白细胞骨架的调节、血小板活化、吞噬体途径.Fn与冠心病密切相关且在血瘀证患者中下调.细胞实验发现各组NF-κB总蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与空白组比较模型组NF-κB 核位移增强,ICAM-1、VCAM-1、内皮素表达上调,PGI2 分泌下调(P<0.05);与模型组比较,Fn5 组、Fn10 组、Fn20 组NF-κB 核位移减弱,VCAM-1、ICAM-1、内皮素分泌下调(P<0.05),PGI2 分泌显著上调(P<0.05);与模型组比较,FnEC-KD 组NF-κB 核位移减弱,VCAM-1、ICAM-1、内皮素表达含量明显降低(P<0.05),PGI2 表达明显增加(P<0.05).结论 血浆Fn抑制内皮细胞活化和功能障碍,内皮细胞来源的Fn促进内皮细胞活化和功能障碍.

目的:定量分析SD大鼠非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)模型中视神经组织蛋白表达变化，并对差异蛋白进行生物信息学分析。方法:选取10只8周龄体质量200~250 g的SPF级雄性SD大鼠，采用孟加拉玫瑰红联合激光光动力方法建立NAION模型，最终选取4只造模成功的大鼠作为NAION模型组，同时取4只体质量和周龄相匹配的健康、无眼疾SD大鼠作为正常对照组。于造模后7 d，分离各组大鼠球后视神经，采用酶切法进行样本制备，采用同位素标记相对和绝对定量标记结合液相色谱-串联质谱技术对组织蛋白进行质谱鉴定和定量检测，选取组间表达倍数大于1.5倍且差异有统计学意义( P<0.05)的蛋白为差异蛋白，并对差异蛋白进行生物信息学分析。 结果:造模后3 d，NAION模型组大鼠视盘隆起，荧光素眼底血管造影图像显示视盘区有荧光素钠渗漏，模型建立成功。共鉴定出1 291个可定量蛋白，其中差异蛋白80个。与正常对照组比较，NAION模型组中表达上调的蛋白5个，表达下调的蛋白75个。V型胶原α1链(Col5A1)和cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基β(Prkacb)、G蛋白相关支架蛋白(Dlg1)等蛋白表达升高；神经微丝蛋白(Nefm)、微管相关蛋白1b(Map1b)、Ras相关蛋白(Rala)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶N2(Pkn2)、血小板活化因子乙酰水解酶IB亚基(Pafah1b1)等蛋白表达降低。差异蛋白主要参与细胞骨架的调节、细胞对缺氧的反应、轴突生成及延伸、突触调节、神经元凋亡调控、轴浆运输等生物学进程。京都基因与基因组通路富集分析结果显示，差异蛋白主要参与代谢通路、突触囊泡循环、血小板活化等信号通路。结论:神经生长、能量代谢、轴浆运输及凋亡等信号通路相关蛋白的表达共同参与NAION中神经细胞的凋亡。

目的:探讨金属硫蛋白-1G(MT1G)在肝细胞癌(HCC)恶化过程中发挥的调节作用及调节机制。方法:利用无标记定量蛋白质组学技术比较MT1G过表达与参照细胞株之间蛋白质组差异；利用细胞计数试剂盒(CCK-8)、胸腺嘧啶核苷类似物染色试剂盒(EDU法)观察细胞表型变化；利用蛋白质印迹法(Western blot)检测相关信号通路关键因子表达量变化。样本间的比较采用 t检验进行统计分析。 结果:首先成功构建出MT1G过表达细胞株。经质谱(MS)鉴定结果表明与参照细胞比共有182种蛋白在MT1G过表达细胞中出现表达量差异有统计学意义(阈值≥5.0倍或≤0.2倍，且 P<0.05)。GO分析显示这些差异表达蛋白(DEPs)可能参与细胞周期调控和磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路。定量聚合酶链反应(PCR)验证表明与参照细胞比，MT1G在MT1G过表达细胞中上调表达，差异均有统计学意义(294.9±33.3)倍( t＝8.837， P<0.01)；吡多醛激酶(PDXK)上调表达(34.02±2.59)倍( t＝13.148， P<0.01)；UBX结构域蛋白7(UBXN)上调表达(19.08±0.47)倍( t＝40.652， P<0.01)；跨膜蛋白9家族成员4(TM9S4)上调(8.91±0.43)倍( t＝20.485， P<0.01)，这些结果与MS鉴定结果趋势一致，差异均有统计学意义。CCK-8和EDU染色结果揭示MT1G过表达可以显著抑制HCC细胞的增殖，而这种抑制作用是通过抑制Akt和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化实现的。 结论:MT1G通过调节PI3K-Akt信号通路活性抑制肝细胞癌细胞的增殖。

目的:通过多组学联合生物信息方式分析探索外泌体介导的多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）的潜在发生机制，为PM/DM提供诊断新靶标和治疗新思路。方法:收集2021年1月至2023年6月来自无锡市第二人民医院的PM/DM患者及健康体检者的血清外泌体样本，基于HiSeq高通量测序技术和同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）定量蛋白组学技术对PM/DM组与健康对照组血清外泌体中的微RNA（miRNA）和蛋白组分开展测序分析，并使用R语言进行limma差异分析，基因本体（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）、基因富集分析（GSEA）功能分析及免疫相关性分析，筛选核心基因并建立miRNA-靶基因-转录因子共表达分子网络。最后使用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）对核心基因进行实验验证。统计学方法以 t检验进行数据分析，并绘制受试者工作特征（ROC）曲线评价核心基因的检验效能。 结果:初步筛选出42个上调差异蛋白，61个下调差异蛋白，以及22个上调差异miRNA，19个下调miRNA，最终确定7个核心基因，13个关联差异miRNA以及4个转录因子。根据功能分析认为核心基因组织蛋白酶G（CTSG）、髓过氧化物酶（MPO）、组蛋白H1-5涉及的中性粒细胞胞外诱捕网的形成、NF-κB通路等炎症相关途径在外泌体介导的PM/DM发生机制中起重要作用。肥大细胞、未成熟树突状细胞、自然杀伤细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞2等免疫细胞在疾病的血清外泌体中表达程度较高。健康对照和PM/DM组MPO[（1.08 ±0.47）和（2.05 ±0.62）， t=-3.50， P=0.004]、CTSG[（1.11 ±0.51）和（2.27 ±1.10）， t=-2.72， P=0.022]、H1-5[（1.03 ±0.25）和（1.81 ±0.73）， t=-2.89， P=0.019]相对表达量比较差异具有统计学意义，ROC曲线中，MPO[AUC（95% CI）=0.92（0.78，1）]、CTSG[AUC（95% CI）=0.81（0.59，1）、H1-5[AUC（95% CI）=0.84（0.64，1）]表明3个核心基因精度良好。 结论:本研究鉴定了PM/DM血清外泌体中的关键差异分子，并构建了miRNA-靶基因-转录因子的调控网络，确定了PM/DM通过血清外泌体介导的致病机制是经由中性粒细胞胞外诱捕网的形成、NF-κB通路这两大关键通路实现的，CTSG、MPO、H1-5为其通路中的核心基因，并明确了与其相关miRNA及转录因子，这些因子或可成为PM/DM诊断和治疗的潜在靶点和生物标志物。

目的:应用蛋白质非标记定量技术和生物信息学分析筛查脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）患者血浆外泌体蛋白分子标志物。方法:收集2021年1月至2022年6月南京医科大学第一附属医院SCI患者及健康对照人群血浆标本各50份。使用超速离心法分离血浆外泌体，通过透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和Western blot对外泌体进行鉴定。利用Label-Free定量蛋白质组学分析血浆外泌体差异表达蛋白（differentially expressed proteins，DEPs），并基于基因本体（Gene Ontology，GO）和基因功能和基因组信息（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库对DEPs进行表征、注释和富集分析。利用血浆外泌体标本对筛选出的DEPs进行Western blot和酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）验证。结果:根据美国脊柱损伤协会脊髓损伤分级：A级14例、B级19例、C级12例、D级5例。SCI患者的血浆外泌体与对照组外泌体均呈现典型的杯状形态，直径30~200 nm。经蛋白质非标记定量技术共鉴定出493种外泌体蛋白，筛选出126种蛋白质差异表达，其中38种上调、88种下调。GO注释显示了DEPs主要参与蛋白质激活级联、补体激活和免疫反应等功能。KEGG富集分析显示了DEPs参与补体和凝血级联反应、蛋白酶体和神经退行性疾病通路等生物学途径。根据蛋白质组学和生物信息学分析初步筛选出2个候选蛋白：APOB和S100A9。Western blot结果显示30份SCI患者血浆外泌体中S100A9蛋白相对表达量（1.62±0.19）较30份对照组（0.86±0.24）升高，差异有统计学意义（ t=8.55， P<0.001），而APOB蛋白相对表达量（1.06±0.13和1.02±0.23）比较差异无统计学意义（ t=0.46， P=0.653）。ELISA试验结果显示S100A9在不同程度SCI患者血浆外泌体中表达[A级（197.7±11.7）pg/ml、B级（151.7±15.2）pg/ml、C级（136.3±14.7）pg/ml]差异有统计学意义（ F=69.94， P<0.001），SCI严重程度越高，S100A9在血浆外泌体中的表达越高（A级与B级， q=13.11， P<0.001；A级与C级， q=15.66， P<0.001；B级与C级， q=4.19， P=0.005）。 结论:S100A9是评估SCI严重程度的潜在有效血浆外泌体分子标志物。

目的 利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tag for relative and absolute quantification,iTRAQ)蛋白质组学技术,分析糖尿病增殖期视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者与糖尿病无视网膜病变患者(diabetes patients without retina diseases,NDR)之间蛋白表达的差异,寻找PDR的候选血清标志物.方法 收集 2016 年至 2017 年首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科住院的PDR患者 21 例,以及性别年龄匹配的NDR患者 21 例.患者血清样本混匀后提取蛋白,采用iTRAQ标记,并进行液相质谱-串联质谱检测(liquid chromatograph-mass spectrometer and mass spectrometer,LC-MS/MS)分析,筛选出差异蛋白行基因本体论(Gene Ontology,GO)数据库功能富集及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)通路显著性富集分析.对相对定量结果 进行独立样本t检验,通过差异倍数(fold change,FC)和P值判定蛋白表达量变化.结果 以差异倍数>1.2 倍(上/下调),P值≤0.05 为标准,筛选出差异蛋白 29 个,其中PDR组上调蛋白 8 个,下调蛋白 21个.通过对差异蛋白的GO功能显著性富集分析,结果 显示,差异基因的功能可分为生物过程、细胞组分和分子功能三个板块.差异表达基因功能涉及生物调节、细胞组成、细胞代谢过程、细胞结合和催化活性等方面.KEGG通路显著性分析显示,上调最为明显的血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)参与肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)、肾素分泌等通路,上调蛋白——胰岛素样生长因子I(insulin like growth factor I,IGF-1)参与HIF-1、FoxO、mTOR、PI3K-Akt和AMPK等多条与代谢相关的信号通路.下调显著的蛋白——肌球蛋白 6(myosin-6)参与心肌细胞收缩和信号传导通路.结论 采用iTRAQ蛋白质组学分析显示,PDR患者与NDR患者存在多种蛋白表达差异,ACE、IGF-1和Myosin-6有望作为糖尿病视网膜病变候选血清诊断标志物,未来可能为PDR的诊断和治疗提供新的靶点.

目的 观察电针对阿尔茨海默病(AD)大鼠学习记忆能力的影响,基于蛋白质组学探讨其潜在作用机制.方法 36只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、心经穴组,每组12只.于双侧海马CA1区注射β淀粉样蛋白1-42建立AD大鼠模型,假手术组注射等体积生理盐水.心经穴组予相应穴位电针刺激,20 min/次,针刺6 d休息1 d,连续7周.Morris水迷宫实验评估大鼠学习记忆能力,串联质谱标签(TMT)标记定量蛋白质组学技术和生物信息学分析筛选差异表达蛋白及潜在功能,通过平行反应监测(PRM)验证差异蛋白表达.结果 各组大鼠游泳速度比较差异无统计学意义(P>0.05).与假手术组比较,模型组Morris水迷宫实验逃避潜伏期显著延长(P<0.01);与模型组比较,心经穴组第2～4日逃避潜伏期均显著缩短(P<0.01).TMT标记定量共鉴定出209个差异表达蛋白,其中有12个蛋白在3组间均有显著变化.GO注释涉及金属离子输运、钠离子传输、钠离子跨膜转运等生物过程,突触、突触前、突触囊泡等细胞组分,溶质:钠协同转运蛋白活性,有机酸:钠协同转运蛋白活性,氨基酸:阳离子转运体活性,氨基酸:钠转运蛋白活性等分子功能;KEGG分析显著富集于突触囊泡通路.PRM验证结果表明,电针心经穴可降低钠和氯依赖的GABA转运蛋白3(GAT3)表达,与TMT标记定量检测结果一致.结论 电针心经穴可改善AD大鼠学习记忆能力,可能是通过调控突触囊泡通路上的突触转运体GAT3表达发挥神经保护作用.

[背景]慢性过量氟暴露会导致中枢神经系统出现损伤,造成一定程度的学习记忆功能损害,然而其损伤机制尚不明确,仍需进一步探究.[目的]应用 4D非标记定量蛋白质组学技术探究慢性过量氟暴露致大脑损伤的差异表达蛋白及其潜在的作用机制.[方法]选取SPF级成年SD大鼠 24只,雌雄各半,采用随机数字表法分为对照组与染氟组,每组 12只.其中,对照组饮用自来水(氟含量<1 mg·L-1),染氟组饮用氟化钠溶液(氟含量10 mg·L-1),两组均饲以普通鼠饲料(氟含量<0.6 mg·kg-1).饲养 180 d后称SD大鼠的体重,随后取部分脑组织分别行苏木素-伊红(HE)染色和尼氏体染色的病理学检查,其余脑组织速冻后于-80℃保存.每组脑组织样本随机挑选 3份进行蛋白质组学检测,筛选出差异表达蛋白并进行亚细胞定位分析,随后进行基因本体(GO)功能分析、京都基因和基因百科全书(KEGG)通路分析、聚类分析及蛋白相互作用网络分析获得关键蛋白.最后选用脑组织样本提取蛋白行蛋白免疫印迹实验检测关键蛋白的表达水平.[结果]饲养 180 d后,染氟组SPF级成年SD大鼠的体重较对照组明显降低(P<0.05).HE染色结果显示染氟组大鼠脑皮质未见明显形态变化,海马区见神经元丢失、神经元排列层次不整齐、部分神经元嗜酸性变和胞体固缩.尼氏染色结果显示染氟组大鼠脑皮质及海马区神经元染色变浅(尼氏体减少).蛋白质组学检测共鉴定出 6927个蛋白,经过筛选在对照组与染氟组中获得差异表达蛋白 206个,包括 96个表达上调蛋白和 110个表达下调蛋白,差异蛋白主要定位于细胞质(30.6%)、细胞核(27.2%)、线粒体(13.6%)、质膜(13.6%)和胞外(11.7%).GO分析结果显示差异表达蛋白主要参与铁离子运输、多巴胺神经元分化的调控和炎症反应中呼吸爆发的负调控等生物过程,行使亚铁结合、铁氧化酶活性、细胞因子活性等分子功能,位于滑面内质网膜、膜的固定成分、氯化物通道复合体等细胞组分.KEGG显著富集通路为次级代谢产物的生物合成、碳代谢和多样环境中的微生物代谢等.差异蛋白相互作用网络分析结果显示葡萄糖-6-磷酸异构酶(Gpi)连接度最高.经蛋白免疫印迹实验检测,Gpi在染氟组成年SD大鼠脑组织中表达水平较对照组降低(P<0.05).[结论]慢性氟中毒大鼠脑组织中存在多种差异表达蛋白,其功能与次级代谢产物的生物合成、碳代谢和多样环境中的微生物代谢有关;Gpi可能参与慢性过量氟暴露致脑神经损伤.

目的 探讨高细胞亚型甲状腺乳头状癌(TC-PTC)临床病理学特征,并研究高细胞亚型PTC蛋白质谱,通过生物信息学分析,筛选与鉴定高细胞亚型甲状腺乳头状癌差异表达蛋白,寻找TC-PTC潜在生物标志物.方法 收集2021年1月至2021年6月期间新疆医科大学附属肿瘤医院67例甲状腺乳头状癌患者术后标本,经病理诊断确诊,TC-PTC17例,经典型甲状腺乳头状癌(CPTC)50例,对比分析两组的临床病理学特征.同时收集其中17例TC-PTC,15例CPTC新鲜手术切除标本,另收集15例良性甲状腺结节(BTN)新鲜标本,应用蛋白质非标记定量技术(la-bel-free)结合液相色谱与串联质谱技术(LC-MS/MS),鉴定和筛选高细胞亚型甲状腺乳头状癌差异表达蛋白,GO及KEGG分析差异蛋白的生物学功能及富集的信号通路.结果 TC-PTC组更易出现多发病灶、侵犯甲状腺被膜及淋巴结转移,差异无统计学意义(P＞0.05),TC-PTC组具有更大的肿瘤体积,差异有统计学意义(P＜0.05).3组共分离和鉴定肽段数34 294个,蛋白质总数4 739个.与CPTC组及BTN组相比,TC-PTC组显著高表达的蛋白14个(FC≥1.3,P＜0.05),其中6个蛋白是TC-PTC特定表达蛋白,分别是:NRP1、MTM1、COG1、SRP19、PRR15、CDC2L5.利用GO及KEGG通路分析,发现差异蛋白主要参与代谢、基因表达及翻译、生物合成等生物学过程,发挥结合、酶调节活性、催化活性等分子功能;主要富集于核糖体生物合成、蛋白酶体系统、剪接体组成、磷酸戊糖途径等信号通路.进一步根据文献复习,我们筛选出4个可能与TC-PTC发生进展相关的蛋白,分别是:CD73、SNRPA1、NAPRT、NRP1.结论 TC-PTC临床生物学行为更具有侵袭性和更高的临床T分期;TC-PTC与CPTC、BTN间存在高表达的差异蛋白,筛选的差异蛋白可能成为高细胞亚型甲状腺乳头状癌潜在分子标志物和治疗靶点.

蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征,是探索生命奥秘的有效手段,相关的实验技术已被广泛应用于各个领域.传统的蛋白组学技术包括凝胶电泳、质谱分析、蛋白质芯片等,但由于这些技术存在灵敏度低、操作繁琐、可重复性差等缺点已无法适应当今蛋白质研究的需要;这就促使了蛋白组学技术的改进和革新.同位素标记的相对和绝对定量(iTRAQ)技术是目前进行蛋白定性定量常用的、发展较快的新技术,该技术灵敏度高、准确率和可重复性好,能够同时检测多个样本,并且对样本进行精准高效的分析.文章梳理了iTRAQ技术的优缺点,对该技术近几年在医药基础和临床研究应用的情况进行整理和分析,探讨该技术在医药领域的应用前景.