目的 通过计算机虚拟筛选从HERB数据库草药成分中筛选出靶向新型冠状病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)、木瓜样蛋白酶(papain-like protease,PLpro)和受体结合域(receptor binding domain,RBD)的新型潜在抑制剂并阐述其相互作用机制.方法 以从HERB数据库中获得的天然化合物为筛选对象,综合运用药效团模型、分子对接、ADME-T预测、分子动力学模拟和分子力学泊松-玻尔兹曼表面积(molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area,MM-PBSA)等计算方法,获取靶向新型冠状病毒中Mpro、PLpro和RBD等多个靶点的潜在抑制剂,并采用酶活性抑制实验评价其植物提取物对 Mpro 的抑制效果.结果 化合物 HBIN006454、HBIN032286 和 HBIN031053 对 SARS-CoV-2 的 Mpro、PLpro 和 RBD 靶点均具有较高的结合亲和力.其中,巴戟天中的HBIN031053具有更好的类药性和药动学特性,且与各靶点所形成的复合物在分子动力学模拟中均表现出良好的稳定性.MM-PBSA分析结果进一步揭示了在HBIN031053-Mpro、HBIN031053-PLpro以及HBIN031053-RBD的结合中发挥关键作用的氨基酸残基,并深入阐述了其抑制病毒蛋白酶活性的机制.酶活性抑制实验表明,巴戟天提取物对Mpro有抑制效果.结论 天然化合物HBIN031053可作为靶向SARS-CoV-2中Mpro、PLpro和RBD等靶点的潜在新型抑制剂.

目的:探究食欲素-A(orexin-A)和α4β2-N型乙酰胆碱受体(α4β2-nAChR)选择性激动剂RJR-2403分别对新生大鼠离体脊髓腹角神经元自发动作电位影响的差异.方法:应用8～12d新生SD大鼠,麻醉后游离出颈端至骶部的脊髓,保留腰骶膨大节段并制备切片.切片孵育30min,采用木瓜蛋白酶消化19～22 min,转常温孵育45～60 min.沿中央管切取脊髓腹角,使用口径从大到小的巴斯德吸管急性机械分离神经元,静置20 min待细胞贴壁,在倒置显微镜下利用膜片钳记录良好的神经元,联合药理学方法进行功能性研究.在电流钳记录模式下,观察orexin-A和RJR-2403分别对离体脊髓腹角神经元自发放电(动作电位)的影响,并比较多种参数的差异.结果:①本研究应用急性分离的脊髓腹角神经元进行膜片钳记录,所记录的神经元胞体完整,形态多样,能发出较多突起且有分支;②给予orexin-A前的腹角神经元自发动作电位的频率[(3.55±0.66)Hz]低于给药后[(8.26±3.31)Hz](P＜0.01),给药前动作电位幅值[(95.28±7.21)mV]高于给药后[(85.15±5.80)mV](P＜0.05),静息电位和动作电位半幅时程无明显变化;③应用RJR-2403前,腹角神经元的静息电位[(-66.67±43.38)mV]高于给药后[(-60.48±3.38)mV](P＜0.01),给药前放电频率[(2.74±1.60)Hz]低于给药后[(8.94±3.14)Hz](P＜0.001),给药前动作电位幅值[(84.96±4.85)mV]高于给药后[(73.77±5.42)mV](P＜0.01),给药前半幅时程[(4.34±1.52)ms]低于给药后[(5.39±1.80)ms](P＜0.01).结论:Orexin-A和RJR-2403对脊髓腹角神经元自发动作电位均具有正性调制作用,但对于静息电位、半幅时程存在不同作用,可能源于促代谢型受体和促离子型受体介导的作用差异.

目的 发现严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)木瓜样蛋白酶(PLpro)的宿主互作分子,探索其生物学意义.方法 邻近蛋白标记结合质谱分析筛选宿主互作分子DEAD-box解旋酶3(DDX3);免疫荧光法分析PLpro与DDX3的胞内共定位;免疫共沉淀法分析PLpro与DDX3的相互作用,以及PLpro对DDX3与IκB激酶ε(IKKe)和TANK结合激酶1(TBK1)、DDX3与线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)互作的影响;荧光素酶报告基因法检测PLpro对β干扰素(IFN-β)通路的影响和对底物的酶切效率.结果 DDX3能够与PLpro发生细胞内共定位和相互作用;PLpro可能抑制DDX3-MAVS复合体形成,抑制DDX3-IKKε-TBK1之间的相互作用,负调控Ⅰ型干扰素通路;DDX3过表达情况下,PLpro/PLP-TM对底物位点的切割效率显著升高,而DDX3表达降低时,切割效率则显著降低.结论 DDX3可能是PLpro的宿主相互作用分子之一;PLpro负调控DDX3活化的IFN-β表达,为病毒复制提供有利的免疫环境,提升蛋白酶切割活性,共同促进病毒复制.

[目的]研究乌梅木瓜汤对抗生素诱导的肠道菌群失调小鼠肠道菌群及消化酶活性的影响.[方法]将32只BALB/c小鼠随机分为4组,分别为正常组、模型组及乌梅木瓜汤低、高剂量给药组,每组8只.除正常组外其余三组小鼠均采用混合抗生素灌胃8 d诱导肠道菌群失调模型.造模成功后,乌梅木瓜汤低、高剂量组分别灌胃乌梅木瓜汤[3.77、7.54 g/(kg·d)]连续8 d,正常组与模型组给予等量无菌水,记录小鼠体质量的变化.末次给药后收集各组小鼠粪便,分别采用16S rRNA高通量测序技术、福林酚比色法、DNS比色法检测分析小鼠肠道菌群及酶活性的变化.[结果]与正常组相比,模型组小鼠肠道菌群多样性显著降低(P＜0.01或P＜0.05),变形菌门、疣微菌门、克雷伯氏菌属、大肠杆菌-志贺菌属等菌丰度显著升高(P＜0.01或P＜0.05),厚壁菌门、脱硫菌门、norank_f_Muribacu-laceae属、乳杆菌属丰度显著降低(P＜0.05),蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶活性显著升高(P＜0.01).与模型组相比,乌梅木瓜汤干预明显改善菌群失调小鼠肠道菌群多样性(P＜0.05),显著降低蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶活性(P＜0.01或P＜0.05),可显著增加菌群中norank_f_Muribaculaceae属、乳杆菌属等有益菌的丰度,减少变形菌门、克雷伯氏菌属、大肠杆菌-志贺氏菌属等条件致病菌的群落丰度性(P＜0.01或P＜0.05).[结论]乌梅木瓜汤可改善菌群失调小鼠肠道菌群结构及多样性,降低致病菌丰度、升高有益菌丰度,降低肠道消化酶活性,对菌群失调小鼠肠道微生态的平衡具有积极作用.

目的 建立可同时检测液态乳中11种营养成分(硫胺素、核黄素、烟酰胺、烟酸、泛酸、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、生物素、胆碱、左旋肉碱)的超高效液相色谱-串联质谱法.方法 液态乳样品采用20 mmol/L甲酸铵溶液震荡并于100 ℃水浴加热30 min后,经木瓜蛋白酶和酸性磷酸酶45℃孵育16 h,离心取下层液体进行测定.色谱柱为 ACQUITYTM HSS T3(3.0 mm× 150 mm,1.8 μm),以 2 mmol/L 甲酸铵 0.1％甲酸水溶液和0.1％甲酸乙腈为流动相,采用内标法定量检测.结果 11种营养成分在12 min内可以有效分离,线性相关系数(R2)均大于0.995,方法检出限为0.05～0.50 μg/L,定量限为0.20～1.25 μg/L,三水平加标回收率为85.6％～119.3％,精密度为3.68％～7.82％(n=6).对60份来自5种不同动物的液态乳进行检测,发现不同乳源液态乳中 11种营养成分的含量差异较大,但均未能检出吡哆醇.结论 本方法通过有效酶解可定量检测包括游离态和结合态的11种水溶性营养成分,方法灵敏,重现性良好,精密度和准确度都能满足定量检测需要.

目的 通过研究补肝健膝方对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)模型兔血清、关节腔积液中白细胞介素-1(inter-leukin-1,IL-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平以及血清中软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)和Ⅱ型胶原C端肽(C-telopeptide of type Ⅱ collagen,CTX-Ⅱ)含量的影响,进一步揭示补肝健膝方对KOA的作用机制.方法 采用木瓜蛋白酶关节注射法制作兔KOA模型.随机分为空白对照组、模型对照组、独活寄生汤组及补肝健膝方低、中、高剂量组,每组 5 只.造模 4 周后,空白对照组和模型对照组每日灌胃生理盐水 1 次;独活寄生汤组每日以独活寄生汤煎剂2.895 g/(kg·d)灌胃 1 次;补肝健膝方低、中、高剂量组每日以补肝健膝方煎液[1.962、3.924、7.848 g/(kg·d)]灌胃 1 次.治疗 4 周后,采用HE染色观察膝关节软骨的病理改变,Pelletier评分评估软骨损伤情况,ELISA检测血清、关节腔积液IL-1、TNF-α水平以及血清COMP、CTX-Ⅱ含量.结果 与空白对照组相比,模型对照组软骨关节表面欠光滑,软骨局部可见黏液样变,软骨及深层细胞数目显著降低;Pelletier评分显著升高(P<0.05);血清及关节腔积液中的IL-1、TNF-α含量及血清中COMP、CTX-Ⅱ含量均升高(P<0.05).与模型对照组相比,独活寄生汤组、补肝健膝方各剂量组软骨表面层次分布更为清晰,潮线结构完整;Pelletier评分降低(P<0.05);血清、关节腔积液IL-1、TNF-α水平以及血清中COMP和CTX-Ⅱ含量均降低(P<0.05).与独活寄生汤组比较,补肝健膝方各剂量组软骨表面层次分布更为清晰,潮线结构更为完整;Pelletier评分升高(P<0.05);血清及关节腔积液IL-1、TNF-α及血清中COMP、CTX-Ⅱ含量降低(P<0.05).结论 补肝健膝方可有效改善KOA兔骨微结构、调节其膝关节滑膜细胞活性,可能与抑制血清、关节腔积液IL-1、TNF-ɑ水平以及血清中COMP和CTX-Ⅱ含量有关.

目的:探讨新型冠状病毒(SARS-CoV-2)木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)在对干扰素α(IFN-α)应答的肝细胞中所介导的功能蛋白质组改变及其效应机制.方法:构建稳定表达PLpro的三株单克隆Huh7肝细胞(PLpro1～3)和对应的空载细胞(NC),分别以IFN-α刺激各株细胞建立处于IFN-α应答状态的肝细胞模型,采用数据非依赖质谱分析PLpro和NC组的定量蛋白质组,以生物信息学分析,预测PLpro对IFN-α应答性肝细胞的作用机制,并采用RT-qPCR、Western blot、细胞促炎因子水平分析、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性分析和Annexin V-Alexa Fluor 647/PI凋亡检测等方法对上述机制进行生物学验证.结果:IFN-α可显著上调空载Huh7细胞株(NC细胞)中的ISG化蛋白(P<0.01),而相同条件下,PLpro细胞蛋白的ISG(IFN-stimulated gene)化修饰被显著下调(P<0.01),表明PLpro细胞株表达了具去ISG化活性PLpro,提示本研究成功建立了细胞模型.质谱分析鉴定和定量得到5619个交集蛋白质和149个差异表达蛋白质,IPA上游因子分析和生物学验证表明,PLpro可显著激活IFN-α应答性Huh7细胞中的IFN-α等7个炎症细胞因子的下游效应蛋白(P<0.01),然而,PLpro并不能在蛋白和mRNA水平显著上调这些细胞因子的丰度(P>0.05).验证性实验结果表明,在对IFN-α应答的Huh7细胞中,PLpro可显著促进细胞坏死(P<0.01)和诱导细胞毒性(P<0.01).结论:在对IFN-α应答的肝细胞中,SARS-CoV-2 PLpro可不经上调炎症细胞因子而独立上调这些细胞因子的下游效应蛋白质,并介导肝细胞坏死性死亡.

目的:观察热敏灸对膝骨性关节炎(KOA)兔模型一氧化氮(NO)、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-4(ADAMTS-4)、Ⅱ型胶原、蛋白多糖(PG)的影响,探讨热敏灸治疗KOA的作用机制.方法:42只雄性日本长耳兔按随机数字表随机分为空白组(6只)、模型组(6只)、艾灸组(24只)、假手术组(6只).空白组正常饲养,模型组与艾灸组采用木瓜蛋白酶注射膝关节腔建立KOA模型,每日强迫活动30 min,造模15 d.假手术组腔内注射0.9％NaCl溶液.造模结束后,艾灸组艾灸"犊鼻"穴,每日1次,每次40 min,共14 d,根据兔艾灸过程中温度变化分为热敏灸组和非热敏灸组,两组各随机抽取6只;空白组、模型组、假手术组正常饲养,不予任何刺激.观察各组兔体质量、行为学变化;干预结束后,采用硝酸还原法检测血清NO含量,Real-time PCR法检测软骨ADAMTS-4、Ⅱ型胶原、PG含量.结果:(1)造模后,与空白组相比,模型组、热敏灸组、非热敏灸组、假手术组兔体质量均下降,Lequesne MG评分升高(P<0.05,P<0.01).干预后,与空白组相比,模型组、假手术组兔体质量仍下降,Lequesne MG评分升高(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,热敏灸组、非热敏灸组、假手术组干预后兔体质量升高,Lequesne MG评分降低(P<0.05,P<0.01);与非热敏灸组相比,热敏灸组兔体质量明显升高(P<0.05),但Lequesne MG评分比较差异无统计学意义(P>0.05).(2)干预后,与空白组相比,模型组、热敏灸组、非热敏灸组、假手术组NO、ADAMTS-4表达均升高,Ⅱ型胶原、PG表达均下降(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,热敏灸组、非热敏灸组、假手术组干预后NO、ADAMTS-4表达均明显降低,Ⅱ型胶原、PG均明显升高(P<0.05,P<0.01);与非热敏灸组相比,热敏灸组干预后NO、ADAMTS-4表达明显降低,Ⅱ型胶原、PG表达均明显升高(均P<0.05).结论:热敏灸可能通过抑制NO和ADAMTS-4表达,减少炎性反应、保护关节软骨从而达到治疗KOA的目的.

目的:通过研究乌梅透骨汤对大鼠膝骨关节炎动物模型的血清炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)浓度以及关节软骨含水率的影响作用,以期为临床应用提供理论依据.方法:选取120例Wistar大鼠(雌雄数量相同),建立大鼠膝骨关节炎动物模型,以随机试验原则分为六组:对照组、模型组、西药组、乌梅透骨汤高剂量组、乌梅透骨汤中剂量组、乌梅透骨汤低剂量组,每组均20例,雌雄数量相同.除对照组外其余各组膝骨关节腔内注射木瓜蛋白酶生理盐水溶液(木瓜蛋白酶4％),在此基础上西药组注射美洛昔康混悬液,剩余各组注射不同剂量的乌梅透骨汤,模型组每日蒸馏水3ml灌胃,取样测量各组血清炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)浓度及关节软骨含水率.结果:经对各组IL-1β、IL-6及TNF-α浓度检测,正常组各项指标浓度均小于其他组,乌梅透骨汤高剂量组浓度较模型组、西药组、乌梅透骨汤中剂量组、乌梅透骨汤低剂量组均低,差异有统计学意义(P＜0.05);西药组各项指标浓度低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05);西药组IL-6浓度低于乌梅透骨汤低剂量组,差异有统计学意义(P＜0.05);乌梅透骨汤低剂量组IL-1β、TNF-α浓度均低于西药组,差异有统计学意义(P＜0.05);各组软骨含水率结果显示,乌梅透骨汤高剂量组、乌梅透骨汤中剂量组含水率低于对照组、模型组、西药组及乌梅透骨汤低剂量组,差异有统计学意义(P＜0.05);乌梅透骨汤高剂量组、乌梅透骨汤中剂量组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:乌梅透骨汤具有降低大鼠膝骨关节炎动物模型的血清炎性因子(IL-1β,IL-6和TNF-α)浓度的功效,对关节软骨含水率也能起到降低作用,且效果优于西药治疗,可以作为临床鼠膝骨关节的治疗方法.

目的:探讨木瓜醇提取物对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)大鼠神经功能的保护作用,并初步探讨其可能机制.方法:制备SCI大鼠模型,根据处理方式分为假手术组(Sham组),模型组(SCI组),木瓜提取物治疗组(Pap组);重组高迁移率族蛋白B1(high mobility group histone B1,HMGB1)处理组(rHMGB1组);重组HMGB1+木瓜提取物处理组(rHMGB1+Pap组).应用basso beattie bresnahan(BBB)评分评估大鼠后肢运动功能;检测脊髓组织含水量评估脊髓水肿情况;应用苏木素-伊红(HE)染色进行组织学评估;运用酶联免疫吸附检测白细胞介素-1β(interleuki-1β,IL-1β),肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α,TNF-α),白细胞介素-6(interleuki-6,IL-6)水平;原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测脊髓组织细胞凋亡情况;应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测组织中HMGB1,Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4),核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65蛋白表达情况;Western blot检测半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白;应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测HMGB1,TLR4,NF-κB p65 mRNA表达情况.结果:与Sham组比较,SCI组大鼠BBB评分明显降低(P＜0.05).SCI组和rHMGB1组脊髓组织松散,呈现嗜中性粒细胞浸润的组织学损伤;而Pap组和rHMGB1+Pap组中组织学损伤情况得到明显改善.与Sham组比较,SCI组大鼠脊髓组织中含水量,HMGB1,TLR4,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平,IL-1β,IL-6,TNF-α水平,凋亡阳性细胞数,Caspase-3蛋白表达水平均明显增加(P＜0.05).Pap组和rHMGB1+Pap组含水量,HMGB1,TLR4,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平,IL-1β,IL-6,TNF-α水平,凋亡阳性细胞数,Caspase-3蛋白表达水平均明显低于SCI组(P＜0.05).rHMGB1+Pap组含水量,HMGB1,TLR4,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平,IL-1β,IL-6,TNF-α水平,凋亡阳性细胞数,Caspase-3蛋白表达水平明显低于rHMGB1组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:木瓜提取物能够通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65信号通路活化,减轻SCI后的炎症反应、减少脊髓组织细胞凋亡,从而诱导脊髓组织修复和运动功能恢复.