[目的]探讨熊胆粉对2 型糖尿病(T2D)小鼠的胆汁酸含量及肠道菌群的影响.[方法]通过高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素诱导建立T2D小鼠模型.小鼠分为正常对照组、高脂饮食组、模型组、二甲双胍组、熊胆粉组,给药 8周,每日 1 次.给药结束后,检测小鼠的糖代谢、脂质代谢、肝功能酶、血清空腹胰岛素(FINS)和脂多糖结合蛋白(LBP)水平;计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);基于超高效液相色谱-串联质谱检测分析小鼠肝脏组织中胆汁酸含量;16S rRNA基因扩增子测序法检测小鼠粪便中肠道菌群的结构变化;采用斯皮尔曼相关性分析进行糖代谢指标、胆汁酸与肠道菌群的相关性分析.[结果]与模型组相比,熊胆粉预防性给药后,能显著降低T2D小鼠空腹血糖(FBG)、口服葡萄糖耐量试验曲线下面积(OGTT AUC)、FINS、HOMA-IR、总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平,显著升高肝脏中脱氢石胆酸、23-脱甲脱氧胆酸、猪胆酸和牛磺石胆酸-3-硫酸盐含量(P<0.05).熊胆粉还可以显著降低小鼠肠道菌群丰富度、多样性指数和血清LBP含量,增加乳球菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌属和乳杆菌属的相对丰度.斯皮尔曼相关性分析发现乳杆菌属不仅和 23-脱甲脱氧胆酸呈正相关,而且与OGTT AUC、FINS和HOMA-IR呈负相关.HOMA-IR与嗜黏蛋白阿克曼菌属负相关.[结论]熊胆粉可以改善T2D小鼠的糖脂代谢水平,调节胆汁酸水平并重塑肠道菌群.

目的 建立熊胆Fel Ursi粉不同极性部位的HPLC指纹图谱,比较不同提取部位化学成分之间的差异,为全面评价熊胆粉的质量评价提供参考.方法 将熊胆粉分别用醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、无水乙醇、乙腈依次提取,浓缩干燥,用甲醇溶解,建立HPLC指纹图谱,并采用相似度评价系统软件进行数据分析.结果 10批熊胆粉醋酸乙酯部位共有模式共标记6个共有峰,三氯甲烷部位共有模式共标记8个共有峰,丙酮部位共有模式共标记8个共有峰,乙腈部位共有模式共标记10个共有峰,乙醇部位共有模式共标记16个共有峰,5种溶剂提取物均指认了 4个共有指纹峰(牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸).综合聚类分析和主成分分析(principal component analysis,PCA)结果,发现相同产地的熊胆粉,受不同厂家加工方法不同的影响,也存在一定的质量差异.通过正交偏最小二乘-判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA),发现牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、乙醇部位10号峰、乙腈部位1、2号峰可能是熊胆粉质量差异的主要标志性成分.结论 所建立的HPLC指纹图谱可以反映熊胆粉的化学成分分布,为熊胆粉的整体质量评价提供参考,并为熊胆粉谱效关系研究提供一定依据.

目的:探究熊胆粉对3-硝基苯磺酸(3-nitrobenzenesulfonic acid,TNBS)诱导大鼠实验性结肠炎的治疗作用,结合网络药理学和分子对接的方法,预测熊胆粉治疗炎症性肠病的药效物质、作用靶点和潜在通路.方法:将大鼠随机分正常组,模型组,阳性药组,熊胆粉高,中,低组.利用TNBS灌肠诱导大鼠实验性结肠炎,评估疾病活动指数(disease activity index,DAI)分数,测量结肠长度和病理改变,ELISA法测定结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10炎症因子含量,然后通过UPLC-Q Exac-tive Orbitrap-MS/MS分析熊胆粉成分,利用相关数据库,预测其可能的信号通路,并对二者的亲和力进行预测.结果:与模型组相比,熊胆粉各剂量组DAI分数显著降低(P＜0.01),结肠长度不同程度增加,低剂量组更为显著(P＜0.05);结肠组织的炎性细胞浸润减少,黏膜上皮基本完整,腺体排列较规则.检测相关炎症因子,与模型组相比,熊胆粉低剂量组TNF-α含量显著下降(P＜0.05),IL-10含量显著上升(P＜0.01),熊胆粉各剂量组IL-1β、IL-6含量显著下降(P＜0.05).网络药理学和分子对接结果表明胆红素可能是熊胆粉治疗IBD的重要成分;PIK3CA、AKT1、MAPK1、MAPK14、MAPK3是治疗疾病的重要靶点;PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、MAPK信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、HIF-1信号通路则是治疗疾病的重要信号通路.结论:熊胆粉能减轻TNBS诱导SD大鼠实验性结肠炎,其中胆红素可能为熊胆粉治疗IBD的关键成分,其作用机制可能与抑制炎症、诱导肠黏膜自噬、肠道免疫相关.

目的 应用高效液相色谱-离子阱质谱联用技术(HPLC-MS/MS)对熊胆粉、熊胆粉中间体及痰热清胶囊中胆汁酸类成分进行定性分析.方法 以体积分数70％甲醇作为提取溶剂制备供试液,色谱分离选用Ultimate XB C18色谱柱(4.6 mm×250mm,5μm),以乙腈-0.1％甲酸水为流动相进行梯度洗脱,电喷雾离子阱质谱正负离子模式下采集数据,根据化合物的二级质谱裂解碎片和色谱峰的保留时间等信息结合对照品的碎片裂解规律和文献数据进行结构鉴定.结果 从熊胆粉、中间体和胶囊中共鉴定或推测33个化合物,其中牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、7α-羟基-3-氧代-5β-胆烷酸以及一未知成分共6种化学成分在痰热清胶囊生产过程中从熊胆粉经由熊胆粉中间体最终转移至痰热清胶囊中.熊胆粉中间体制备过程中新生成成分有21个,主要为游离型胆汁酸,其中19个化合物均转移至胶囊中.结论 通过痰热清胶囊生产过程中熊胆粉化学成分变化情况进行考察,为痰热清胶囊生产过程的质量控制与评价提供了参考依据.

目的:探讨蒙药熊胆治疗应激性胃溃疡出血模型大鼠的主要成分及作用机制.方法:将130只SD大鼠随机分为13组,即空白组、模型组、奥美拉唑组、蒙药止血红花-8味散低和高剂量组、熊胆粉低和高剂量组、熊胆主要成分即熊去氧胆酸(UDCA)低和高剂量组、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)低和高剂量组、胆酸(CA)低和高剂量组等,每组10只,大鼠按分组依次给药实施治疗,观察及分析用药后对血小板计数、大鼠血清5-羟色胺(5-HT)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血管内皮生长因子(VEGF)等指标的影响及病理变化.结果:与空白组比较,模型组大鼠血小板计数降低、血清5-HT、AngⅡ的含量及VEGF含量明显升高,差异比较,均有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,空白组、奥美拉唑阳性对照组、蒙药熊胆及主要成分观察组血小板计数明显升高,血清5-HT,Ang Ⅱ,VEGF水平明显下降趋势,差异均有统计学意义(P＜0.05);与奥美拉唑阳性对照组比较,除了CA低和高剂量组外蒙药熊胆及主要成分各组血清5-HT、AngⅡ和VEGF水平变化比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);UDCA及TUDCA组效果尤为明显.光镜下可见正常组大鼠胃黏膜、胃底腺结构连接完整,模型组有溃疡病变,蒙药熊胆及主要成分观察组均有明显的改善趋势.结论:蒙药熊胆及主要成分UDCA和TUDCA对胃溃疡出血有很好的治疗和防治作用;蒙药熊胆治疗胃溃疡出血的主要成分为UDCA和TUDCA,CA作用相比较弱.

采用液质联用的方法对常用的胆汁类动物药的特征离子进行研究,以期解决该类药材及含有该类药材的复方制剂专属性检验的问题.通过UPLC-Q-TOF对样品进行测定,然后使用MarkerLynxTM v.4.1质谱数据处理软件以及胆汁酸类成分的选择离子色谱图对数据进行对比分析,结果方法对于猪胆粉、熊胆粉、体外培育牛黄和人工牛黄的专属性鉴别效果较好,在护肝片和人工牛黄甲硝唑胶囊的专属性鉴别中效果也较好.该方法适用于猪胆粉、熊胆粉、体外培育牛黄和人工牛黄以及一些含上述药材的复方制剂的专属性鉴别.

应用DNA条形码技术对名贵中药材熊胆粉及混伪品进行DNA条形码鉴定研究,并建立其标准实验流程,以保障熊胆粉的安全有效利用.对收集到的12份熊胆粉样品进行DNA提取、PCR(聚合酶链式反应)扩增并双向测序、运用CodonCode Aligner V 7.0.1进行序列剪切去除引物区得到COI序列,同时与GenBank中得到棕熊及混伪品COI序列,运用MEGA 7.0对研究的5个物种50条序列比对分析,计算变异位点及种内和种间K2P(Kimura 2-Parameter)遗传距离并构建邻接(NJ)树.黑熊、棕熊的种内最大K2P遗传距离远小于其混伪品间最小K2P遗传距离;NJ树结果显示黑熊、棕熊各聚为一支,均可以与混伪品明显区分开.DNA条形码技术为一种安全便捷可靠的物种鉴定技术,建立动物类药材COI序列标准话流程,在中药研究领域具有重要的作用.

目的:观察痰热清注射液及5种中间体对四氯化碳(CCl4)诱导急性肝损伤的保护作用,初步探讨痰热清注射液治疗急性肝损伤药效物质基础.方法:采用多次皮下注射复制CCl4急性肝损伤模型,雄性大鼠随机分为正常组、模型组、痰热清注射液组、痰热清注射液治疗组、甘利欣注射液阳性药组、黄芩治疗组、熊胆粉治疗组、山羊角治疗组、连翘治疗组和金银花治疗组,大鼠尾静脉注射给药连续7d.观察各组大鼠体质量、肝体比及肝功能各项血清生化指标,并观察肝组织病理状态,并采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测钠离子-牛磺胆酸协同转运蛋白(NTCP),磺基转移酶2A1(SULT2A1),谷胱甘肽-S-转移酶A2(GSTA2)和细胞色素P450酶3A11(CYP3A11)mRNA水平的变化.结果:与正常组比较,模型组大鼠肝体比显著升高,体质量下降,丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),碱性磷酸酶(ALP),总胆红素(T-Bil),直接胆红素(D-Bil)和总胆汁酸(TBA)水平显著增高,肝细胞大面积坏死变性明显,NTCP,GSTA2和CYP3A11mRNA表达显著降低(P ＜0.05,P＜0.01).与模型组比较,痰热清注射液能显著恢复肝系数,降低各项血清生化指标,肝组织病理炎症减轻;而各中间体的血清肝功能指标改善的优劣顺序分别是连翘、金银花、山羊角、熊胆粉.痰热清注射液和连翘能上调NTCP,GSTA2和CYP3A11 mRNA表达,熊胆粉仅能上调SULT2A1和GSTA2mRNA的表达,金银花上调SULT2A1,GSTA2和CYP3A11mRNA的表达(P＜0.05,P＜0.01).结论:痰热清注射液具有显著改善CCl4诱导的大鼠急性肝损伤作用,而其中起保肝作用的主要药效部位可能为熊胆粉、山羊角、连翘和金银花,其作用机制可能与上调NTCP,SULT2A1,GSTA2和CYP3A11的表达,加速肝内胆汁酸代谢有关.

熊胆粉中含有胆汁酸、胆红素、蛋白质、氨基酸、微量元素等多种成分,其中胆汁酸类是熊胆粉中含量最高且研究最多的活性成分,而非胆汁酸类成分目前却鲜有报道.因此,该研究对来源为四川、黑龙江、云南的熊胆粉中各化学成分进行系统的研究.通过采用微孔板分光光度计法测定胆红素、蛋白质,利用液相色谱质谱联用技术测定胆汁酸和氨基酸,利用电感耦合等离子体质谱仪测定微量元素.并采用相似度评价软件对不同来源的20批熊胆粉进行系统分析,表明不同来源熊胆粉中胆汁酸类成分相似度高(相似度系数为0.922～0.977),不存在明显差异.所测样本中牛磺熊去氧胆酸与牛磺鹅去氧胆酸是熊胆粉中含量最高的成分,为41％ ～59％,均符合现行卫生部质量标准.二者总含量在来源为黑龙江的熊胆粉中最高,对不同来源的熊胆粉有分类意义.此外,不同来源熊胆粉中胆红素、蛋白质、氨基酸、微量元素含量也存在着一定的差异.该研究发现不同来源熊胆粉主要化学成分较为相似,但胆汁酸、胆红素、蛋白质、氨基酸、微量元素对不同来源的样本有分类意义,该研究为市售熊胆粉的质量评价和控制提供了更加全面科学的依据.

目的 通过超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC/Q-TOF-MSE)技术快速鉴定痰热清注射液和胶囊中的化学成分,并对化合物进行差异分析和来源归属.方法 采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.0 mm×100 mm,1.7 μm),以乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相梯度洗脱;质谱采用电喷雾(ESI)离子源,负离子模式下采集数据,根据离子峰的保留时间、精确质量数和裂解碎片信息,与文献报道或数据库数据和对照品进行比对.结果 从注射液和胶囊中共鉴定化合物111个(包括13个未知成分).其中来源于黄芩中间体的有14个,熊胆粉中间体36个,山羊角中间体7个,金银花中间体34个,连翘中间体22个;金银花和连翘中间体中共有成分2个,分别为奎宁酸和芦丁;经对照品确证的化合物28个.共存于注射液和胶囊中的化合物有71个,仅存于注射液中的有24个,而在胶囊中检测到的成分仅有16个.结论 通过该研究建立的UPLC/Q-TOF-MSE分析方法,能有效表征痰热清注射液和胶囊的化学成分定性差异,为注射液和胶囊的质量控制提供科学依据.