目的:探讨Slit引导配体2(Slit2)对糖尿病小鼠角膜上皮和神经损伤修复的促进作用及其可能的分子机制。方法:选取60只SPF级5~6周龄C57BL/6小鼠，采用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组和Slit2注射组，每组20只。糖尿病模型组和Slit2注射组小鼠采用链脲霉素腹腔内注射法建立糖尿病模型。构建小鼠角膜上皮损伤修复模型，Slit2注射组于造模后即刻结膜下注射Slit2重组蛋白，糖尿病模型组小鼠结膜下注射等容量PBS，正常对照组不做处理。采用角膜荧光素染色法观察小鼠角膜上皮缺损后24、48和72 h愈合情况；采用实时荧光定量PCR法检测正常对照组和糖尿病模型组小鼠角膜上皮中Slit2及其相关受体mRNA的表达；采用角膜铺片β-tubulin Ⅲ荧光染色法观察小鼠角膜神经形态变化；采用免疫荧光法检测正常对照组和糖尿病模型组小鼠角膜上皮中Slit2的表达分布及修复的角膜上皮中Slit2、表皮生长因子受体(EGFR)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、苏氨酸蛋白激酶(AKT)、β-连环蛋白(β-catenin)和Ki67的表达。将小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2)分为正常对照组、高糖组和Slit2干预组。采用Western blot法检测各组细胞中p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT、p-ERK/ERK和β-catenin的表达；取高糖培养的TKE2，采用Western blot法检测0.01、0.1和0.5 μg/ml Slit2处理10 min及0.5 μg/ml的Slit2处理前和处理后10、20、30、60、120 min时p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的表达。原代培养各组小鼠三叉神经节(TGs)细胞，采用β-tubulin Ⅲ免疫荧光染色法观察Slit2对于TGs细胞轴突再生的影响。结果:角膜上皮刮除后48 h和72 h，与正常对照组和Slit2注射组比较，糖尿病模型组小鼠角膜上皮修复速度明显减慢。糖尿病模型组小鼠正常角膜上皮中Slit2及其Robo1、Robo2、Robo4受体mRNA相对表达量明显高于正常对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。糖尿病模型组损伤修复的角膜上皮中Slit2免疫荧光强度明显弱于正常对照组。角膜铺片神经荧光染色显示，与糖尿病模型组比较，角膜上皮损伤后7 d Slit2注射组角膜神经丛致密，神经纤维数量增多且分布均匀，神经末梢可见较多分支。正常对照组和Slit2注射组修复的角膜上皮中p-EGFR、p-ERK、β-catenin和Ki67荧光明显强于糖尿病模型组。高糖组TKE2细胞内p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT和β-catenin相对表达量均明显低于正常对照组和Slit2干预组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。Slit2处理高糖培养TKE2细胞后10 min，p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的相对表达量较处理前均明显升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)，随着Slit2质量浓度的增加，TKE2细胞中p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT相对表达量逐渐升高，Slit2质量浓度为0.5 μg/ml时对EGFR和AKT信号通路的活化作用最明显。高糖组体外培养的TGs突触长度为(40.52±5.44)μm，明显短于正常对照组的(72.14±9.48)μm和Slit2注射组的(73.04±4.66)μm，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:Slit2通过激活EGFR信号通路对糖尿病模型小鼠角膜上皮发挥保护作用，并通过增加角膜上皮下神经丛密度和促进TGs细胞轴突生长，发挥神经保护能力。

目的 了解子宫内膜异位症(endometriosis,EMT)不同r-AFS分期患者血清弗林蛋白酶(Furin)、肿瘤生长因子-β(tumor growth factor-β,TGF-β)、血管生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及神经轴突导向因子-1(neuron towards axon guidance factor-1,netrin-1)水平表达及 Furin 基因 P1 启动区 r2071410 C/T 位点多态性,探讨其与深圳地区EMT发病的相关性.方法 选取2021年5月～2023年1月深圳市龙华区人民医院确诊的EMT患者102例为EMT组,并根据r-AFs分期法将EMT组分为Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期.同时收集同期非EMT患者78例为对照组.采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清 Furin,TGF-β,VEGF 及 netrin-1 水平,并采用反转录-实时荧光定量聚合酶链反应法(reverse transcription-real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点多态性.结果 EMT组患者血清Furin(140.84±47.02pg/ml),TGF-β(376.46±82.36ng/L)和 VEGF 水平(167.67±53.02ng/L)明显高于对照组(55.49±13.67pg/ml,216.37±15.04ng/L,102.27±8.45ng/L),而 netrin-1 水平(48.37±15.20pg/ml)明显低于对照组(165.85±15.63pg/ml),差异具有统计学意义(t=28.409,20.347,16.915,36.653,均 P＜0.05).Ⅲ～Ⅳ 期患者血清 Furin(192.41±20.62pg/ml),TGF-β(452.61±72.03ng/L)和 VEGF 水平(201.84±28.01ng/L)明显高于 Ⅰ～Ⅱ 期(78.05±16.54pg/ml,283.75±56.92ng/L,126.07±19.35ng/L),而 netrin-1 水平(37.95±11.34pg/ml)明显低于 Ⅰ～Ⅱ 期(61.05±9.52pg/ml),差异有统计学意义(t=31.071,18.054,19.183,21.625,均 P＜0.05).经 Pearson/Spearman 相关性分析结果显示,Furin 与 TGF-β,VEGF水平及临床分期呈正相关(r=0.614 9,0.752 6,0.790 5,均P＜0.05),而与netrin-1水平呈负相关(r=-0.670 1,均P＜0.05).EMT组患者Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点TT基因型和T等位基因频率(42.16％,55.39％)明显高于对照组(7.69％,19.87％),且Ⅲ～Ⅳ期TT基因型和T等位基因频率(51.79％,65.18％)比Ⅰ～Ⅱ期(30.43％,43.48％)明显升高,差异具有统计学意义(x2=26.500,46.472,4.721,9.626,均P＜0.05).EMT组不同基因型患者血清Furin水平差异具有统计学意义(F=51.286,P＜0.001),其中TT基因型患者血清Furin水平(216.29±68.53pg/ml)明显高于CC(83.04±21.37pg/ml)和CT基因型(89.18±20.95pg/ml),差异具有统计学意义(t=27.146,25.719,均P＜0.01),但CC与CT基因型之间差异无统计学意义(t=1.326,P＞0.05).结论 EMT患者血清Furin水平明显升高,且与TGF-β,VEGF,netrin-1水平及临床分期呈一定相关性;同时Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点呈多态性分布,其中TT基因型患者血清Furin水平升高更为明显,可能与深圳地区EMT发病有关.

骨血管在骨生长、重塑和损伤修复中发挥重要作用,H型血管是一类同时高表达CD31与Emcn的骨血管亚型,具有显著的解剖特征与年龄依赖性减少特点,深度参与血管生成与骨形成之间的偶联.一些细胞因子如缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子A、血小板衍生生长因子BB、神经轴突导向因子3等可参与调控H型血管的生成,同时药物治疗、物理治疗和转移性肿瘤也能对H型血管产生影响.本文通过回顾近年文献,总结H型血管生成的分子机制与影响因素,以期为骨折不愈合、骨代谢异常等骨病的治疗提供新思考.

轴突生长导向因子-1(netrin-1)是netrins家族中研究最广泛的成员.netrin-1 最初被认为是胎儿发育过程中轴突引导的调节因子,与其经典受体非协调 5(uncoordinated-5,UNC5)与结直肠癌缺失基因(deleted in colorectal cancer,DCC)共同介导轴突的吸引或排斥.随着更多netrin-1受体的发现,如唐氏综合征细胞粘附分子(down syndrome cell adhesion molecule,DSCAM)、整合素α6β4(integrin α6β4,Inα6β4)和整合素α3β1(integrin α3β1,Inα3β1)、腺苷A2B受体(A2B adenosine receptor,A2BAR)和CD146等的发现,扩展了netrin-1在非神经系统的功能,如调控血管生长,肿瘤生长,细胞凋亡,炎症发展.本文就netrin – 1及其受体在非神经系统中的作用的研究进展进行概述.

中枢神经损伤的修复是当今社会的一大难题.随着纳米技术的发展,逐渐出现一些能产生导电性的生物材料如碳纳米管和石墨烯等,它们在一定程度上能促进神经的功能性恢复,但其本身对机体也有一定的毒性,甚至有时引起神经细胞凋亡.神经损伤过程往往出现神经轴突的断裂,断裂的神经轴突无法与次级神经元发生突触连接,导致神经的修复再生障碍.神经轴突导向因子netrin-1是神经发育过程中的重要分泌蛋白,可定向牵引神经轴突的生长和迁移,导致突触形成,从而促进神经损伤的修复但是它在纳米材料修复神经损伤中的分子调节机制尚不明确.本文综述了netrin-1在纳米材料促进神经再生中的作用 它对神经元的轴突导向生长和神经迁移具有促进作用,抑制纳米材料造成的神经损伤和凋亡,为其应用于纳米材料修复神经损伤且诱导神经再生提供重要理论依据.

目的 探讨血清妊娠相关蛋白-A (PAPP-A) 、神经轴突导向因子-1 (Netrin-1) 、胎盘蛋白13 (PP13) 、雌三醇水平对胎儿生长受限的预测价值.方法 将丽水市中心医院2015年3月至2016年12月收治的孕早期2 431例孕妇中胎儿生长受限的71例作为研究对象 (观察组) , 此期间胎儿发育正常孕妇50例作为对照组.入院后空腹采集外周静脉血, 分离血清, 采用化学发光法测定雌三醇浓度, 采用酶联免疫双抗体夹心法测定PAPP-A、Netrin-1、PP13浓度.结果观察组孕妇血清PAPP-A、Netrin-1、PP13、雌三醇阳性率高于对照组, 差异均有统计学意义 (χ2=23.742、18.643、26.179、25.530, Ps<0.05) ;观察组孕妇血清PAPP-A、Netrin-1、PP13、雌三醇水平低于对照组, 差异均有统计学意义 (χ2=14.122、38.476、17.322、14.747, Ps<0.05) ;血清PAPP-A、Netrin-1、PP13、雌三醇水平与胎儿生长受限呈负相关.结论 血清PAPP-A、Netrin-1、PP13、雌三醇水平对胎儿生长受限均有一定的预测价值.

目的 观察胶质细胞Slit1对脊髓背根节(DRG)神经元突起生长的影响.方法 构建大鼠Slit1 siRNA,转染至大鼠原代DRG卫星胶质细胞.利用实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Slit1 mRNA和蛋白的表达情况;将siRNA-Slit1转染成功的胶质细胞与大鼠原代DRG神经元共培养48 h,显微镜下观察神经元突起生长情况.结果 (1)与阴性对照组比较,siRNA-Slit1组胶质细胞Slit1 mRNA的表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);(2)siRNA-Slit1组Slit1蛋白的表达量明显低于阴性对照组,差异具有显著统计学意义(P<0.01),而空白对照组与阴性对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05);(3)siRNA-Slit1组神经元突起长度明显短于阴性对照组,差异具有显著统计学意义(P<0.01).结论 Slit1是诱导神经元突起生长的重要导向分子,可促进离体DRG神经元突起的生长.

Sema4D属于Semaphorin家族成员之一,最初被认为是影响神经发育的轴突导向因子.近年研究表明,Sema4D在人体肿瘤组织中高表达,并在肿瘤新生血管形成及肿瘤进展中发挥重要作用.Sema4D介导肿瘤新生血管形成的主要机制包括激活Plexin B1-RhoA与Met信号通路、与血管内皮细胞生长因子协同作用、与低氧诱导因子作用.在实体肿瘤中,Sema4D高表达提示血管新生效应更强、恶性程度更高及预后更差,可作为抗肿瘤及抗肿瘤血管治疗的新靶标.

交感神经在一些疾病动物模型和老年小鼠模型组织中呈现发芽生长和密度增加的趋势.这提示,交感神经与衰老密切相关.本研究采用免疫组织化学检测老年小鼠肝、肺、脾组织和人结肠腺瘤组织衰老模型中交感神经标记蛋白酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况.结果证实,衰老组织中的交感神经密度显著增加.然而,目前对衰老组织的这种生物学改变机制尚不明确.本研究以人成纤维细胞系2BS为实验材料,经转录组测序发现,分泌性轴突导向因子导蛋白-1在衰老细胞中上调表达.ELISA和实时定量PCR结果显示,在博来霉素、离子射线、癌蛋白RasV12过表达所诱导的早衰及复制性衰老的2BS细胞中,导蛋白-1的蛋白质和mRNA表达量均比年轻对照组高.DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)是调控衰老细胞分泌蛋白质表达的重要途径.为明确导蛋白-1在衰老细胞的上调表达是否与DDR相关,使用小分子化合物抑制DDR的重要效应分子ATM(ataxia telangiectasia mutated)和CHK2(checkpoint kinase 2)在博来霉素诱导的衰老2BS细胞中的活性.ELISA和实时定量PCR结果显示,与博来霉素诱导衰老组相比,阻断衰老细胞中的DDR活性未引起导蛋白-1表达水平的改变.提示导蛋白-1在衰老细胞中的表达不依赖于DDR途径.Western印迹检测发现组蛋白甲基转移酶EZH2在衰老细胞中的蛋白质表达明显少于年轻细胞;实时定量PCR结果表明使用小分子化合物抑制EZH2在年轻细胞中的活性引起导蛋白-1表达增加;CHIP实验检测发现,EZH2对年轻细胞的导蛋白-1启动子区DNA片段富集显著而在衰老细胞未见富集.以上结果提示EZH2在衰老细胞中的下调表达是导蛋白-1表达增加的重要原因.大鼠DRG与衰老细胞共培养结果证实,衰老细胞对交感神经具有导向作用,并且该现象依赖于导蛋白-1的分泌.根据以上结果得出结论,导蛋白-1在衰老细胞中的上调表达不依赖于DDR途径而与EZH2的下调表达相关,衰老细胞通过分泌导蛋白-1促进交感神经轴突定向生长.本研究为深入探讨衰老相关疾病的发生机制以及防治提供了新线索,具有一定的科学意义和潜在的转化应用价值.

目的 分析原发性开角型青光眼(POAG)患者房水的蛋白质表达变化,探寻与疾病发生相关的生物学标志及潜在治疗靶点.方法 采用回顾性病例-对照研究设计.纳入2016年10月至2017年12月由天津医科大学眼科医院收治的行白内障手术的年龄相关性白内障患者10例10眼作为年龄相关性白内障组,行青光眼联合白内障手术的POAG合并白内障患者10例10眼作为POAG合并白内障组.术中借助手术通道用1号针头接1 ml针筒进入前房中部吸取约100μl房水.通过非标记定量蛋白质组学质谱分析技术分析房水中提取的蛋白,采用Maxquant significances A的方法进行差异显著性检验,以P<0.05、差异倍数>2的标准筛选得到2个组患者的差异蛋白,并将生物大数据通过GO功能、KEGG显著性富集分析对差异蛋白的功能及调控的信号通路加以注解.结果 本次蛋白组学分析共检测到97个差异蛋白,其中包括48个上调蛋白和49个下调蛋白.GO分析显著差异蛋白功能涉及诸多方面,其中与炎症反应有关的有脂多糖结合蛋白(LBP)、CD163、C-反应蛋白(CRP)和膜联蛋白A1(ANXA1);与氧化还原有关的蛋白有谷胱甘肽S转移酶P(GSTP1)和硫氧还原蛋白(TXN);与细胞黏附运动有关:软骨寡聚基质蛋白(COMP)、桥粒胶蛋白(DSC2)和层连蛋白(LAMB2);与纤维化有关的有原胶原蛋白(PLOD1)和固生蛋白(TNC);与神经生长有关:颤蛋白(RELN)、脑信号蛋白(SEMA3F)和轴突导向因子(SEMA4B);与代谢相关的蛋白有丙酮酸激酶(PKM)和羧肽酶N亚型2(CPN2)等.KEGG分析表明NrF2/ERK信号通路、TGF-β/NF-κB信号通路表达在2个组细胞间存在差异.结论 POAG患者房水中GSTP1、TXN表达显著降低,可能通过调控NrF2/ERK1/2及TGF-β/NF-κB信号通路,调节细胞黏附性和活性以及细胞外基质表达来参与疾病的发展.GSTP1、TXN可能成为潜在生物学标志及治疗靶点.