[背景]由鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus-2,CyHV-2)引起的疱疹病毒性造血坏死病在鲫和金鱼中的暴发给水产养殖业造成了巨大的经济损失.[目的]开发一种快速、现场检测鲫是否感染过CyHV-2 和监测鲫CyHV-2 IgM抗体水平的胶体金检测试纸条.[方法]将CyHV-2 与胶体金结合作为金标抗原、Protein A作为检测线、兔源rORF66 多克隆抗体进行划线作为质控线,分析胶体金试纸条最佳制备及组装条件,确定胶体金标记最适pH、金标抗原最适浓度,以及检测线(test line,T线)、质控线(control line,C线)最适划线浓度等.[结果]本研究制备的CyHV-2 抗体胶体金试纸条可以使用全血测试,与常见的其他鱼类抗体血清无交叉反应,如草鱼呼肠孤病毒抗体阳性血清、鳜虹彩病毒抗体阳性血清等.试纸条最低限度可以检测到 1:100 稀释的阳性血清抗体,由试纸条检测线的深浅可以初步判断鱼体中抗体水平.试纸条通过对 10 条鲫鱼血清样品检测并和金鱼造血器官坏死病毒检测方法(GB/T 36194-2018)进行Kappa分析,Kappa值为 0.80,表明二者有较高的符合率.[结论]本研究制备的试纸条具有较高的灵敏度和特异性,具有操作简单和成本较低的特点,对鱼类检疫、鱼体抗体水平评价等具有实际应用价值.

采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增技术从异育银鲫Carassius auratus gibelio肝脏中克隆了过氧化物还原酶(Prx)基因的cDNA全长序列.结果显示,异育银鲫过氧化物还原酶(CaPrx)基因cDNA全长1 035 bp,开放阅读框长594 bp,编码197个氨基酸.在氨基酸序列的N端和C端各有一个保守的Cys残基,属于2-半胱氨酸类Prxs家族.多序列比对和系统进化树分析表明,异育银鲫与鲫Carassius auratus、青鱼Mylopharyngodon piceus、斑马鱼Danio rerio、犀角金线鲃Sinocyclocheilus rhinocerous和朝鲜鳑鲅Rhodeus uyekii等鱼类的Prx基因具有很高的同源性.实时荧光定量PCR结果显示,CaPrx基因在异育银鲫体内广泛表达,在血细胞和肝脏中表达量最高,在鳃和头肾的表达量较少.在感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的个体中,肝脏和脾脏的CaPrx基因表达量显著下降,表明其抗氧化作用因病毒的感染而受到了一定的破坏.

为进一步确认及掌握鲤浮肿病毒(Carp Edema Virus,CEV)目前的流行现状和流行特点,于2017年重点调查了我国北方地区5省市26个正发生或曾经发生"鲤急性烂鳃病"的养殖场,随机监测了9个省市的97家鲤和锦鲤养殖场.样品采用实时荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,qPCR)法和套式PCR(Nest PCR)方法进行检测,nest PCR法扩增出的产物进行测序和基因分析.结果重点调查的26家养殖场中有20个为CEV阳性,1个为锦鲤疱疹病毒(Koi Herpes Virus,KHV)阳性,1个为孢子虫感染.随机调查的97家养殖场中有50家为CEV检测阳性,阳性率高达52％;可测序的CEV毒株均属于GenogroupⅡa型;样品按不同地区、不同采样水温、不同品种、不同规格鱼等划分,各组均有CEV阳性检出,但检出率均无显著差异.以上结果表明CEV感染是多省市"鲤急性烂鳃病"暴发的主要病因.另外,该病毒病的流行水温在12—27℃.

异育银鲫“鳃出血病”是一种因感染了鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)而引起的疾病,近年来给江苏异育银鲫养殖业造成了巨大的经济损失.为了能够建立及时、有效检出Ⅱ型鲤疱疹病毒的技术,本研究在克隆了CyHV-2解旋酶基因和三联体蛋白基因的基础上,建立了检测CyHV-2的普通PCR、双重PCR、巢式PCR、环介导等温扩增、实时荧光定量PCR等方法,并对这5种PCR技术检测CyHV-2的灵敏性进行了系统研究.结果 表明,针对CyHV-2病毒的解旋酶基因和三联体蛋白基因,普通PCR能够检测出的极限值是2.4× 104 copies/μL,双重PCR是1.4× 104 copies/μL,巢式PCR是2.4×10-2 copies/μL,荧光定量PCR是2.4× 10-2 copies/μL,环介导等温扩增是3.5×102 copies/μL.通过采用以上方法对从不同地区采集的54尾异育银鲫提取的DNA为模板进行临床检验,测定不同检测方法的阳性检出率.结果 表明,实时荧光定量PCR和巢式PCR的检出率很高,分别为89％和90.7％;普通PCR的检出率最低,为68.5％.综合检测灵敏度和阳性检出率,环介导等温扩增(LAMP)是一种适用于生产实践的能有效检测CyHV-2的良好技术.

[背景]水产养殖病害是限制淡水渔业发展的一个重要因素,养殖环境的微生物状况与鱼类健康紧密相关,已引起人们广泛关注.[目的]阐明养殖水体和沉积物中病原微生物丰度和细菌群落多样性变化特征.[方法]利用荧光定量 PCR方法和未端限制性片段长度多态性(Terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)技术,对异育银鲫养殖环境水体和沉积物中的典型病原微生物进行定量检测,以及细菌群落多样性分析.[结果]养殖过程中病原菌丰度呈现不同的变化趋势,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(A.sobria)和维氏气单胞菌(A.veronii)与鲤疱疹病毒Ⅱ型丰度变化呈显著正相关.水体中病原菌丰度受 pH、温度和溶解氧等环境因子的影响显著.T-RFLP分析表明沉积物样品较水体样品细菌群落组成复杂,并且沉积物细菌群落动态变化幅度高于水体.水体和沉积物中细菌 T-RFs数量范围分别在 11-29 和 20-32 之间,Shannon-wiener指数在1.44-2.87和 2.44-3.25之间.[结论]养殖水体中的病原菌丰度高于沉积物,而沉积物细菌群落丰富度和多样性高于水体.病原菌丰度和细菌群落结构变化与环境因子密切相关,明确养殖池塘环境中病原微生物的生态分布和丰度变化,将为指导养殖过程中病原性疾病发生早期预警提供理论依据.

[背景]Ⅱ型鲤疱疹病毒(Cyprinid Herpesvirus 2,CyHV2)感染鲫引起的疱疹病毒性造血器官坏死病(Herpes Viral Haematopoietic Necrosis,HVHN)是鲫养殖业的主要病害,造成严重的经济损失.目前尚无治疗HVHN的有效药物.对CyHV2进行早期监测和有效防控是阻止该病暴发的有效手段.[目的]建立一种针对CyHV2的orf72基因的实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)检测方法,并评价其特异性和灵敏度.[方法]通过比较CyHV2五株毒株间orf72核苷酸序列,在保守区设计特异性引物和探针.设置5个反应温度,优化实时荧光RPA反应的条件.在最优的条件下验证实时荧光RPA检测方法在不同水产动物病毒间的特异性.以梯度稀释的CyHV2阳性DNA为模板比较实时荧光RPA与qPCR的灵敏度.[结果]实时荧光RPA能在37.8 ℃条件下20 min内快速准确地检测CyHV2病毒,而且种间特异性高,与其他病毒无交叉反应,反应灵敏度与qPCR相同.[结论]研究建立的实时荧光RPA可用于CyHV2的现场快速检测,具有一定应用价值.

[目的]鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染养殖鲫引起的鲫造血器官坏死病,给鲫养殖业造成了重大的经济损失.揭示CyHV-2感染宿主细胞的机制,是建立鲫造血器官坏死病有效防治技术的重要基础.[方法]本研究针对CyHV-2富含抗原表位的ORF25B区域设计引物,扩增ORF25B基因截短序列.将扩增产物克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-tORF25B,转化至酵母菌株Y2H Gold中.在营养缺陷型培养基上,验证诱饵表达载体pGBKT7-tORF25B对酵母菌Y2H Gold自激活现象和毒性作用.利用酵母双杂交技术,将诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold与鲫脑组织细胞系(GiCB) cDNA文库杂交.[结果]ORF25B基因截短序列扩增大小约为981 bp,成功构建了诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold,自激活和毒性验证结果表明,诱饵表达载体对酵母菌株无自激活现象,也无毒性作用,初步筛选出4种与tORF25B基因编码蛋白互作的宿主蛋白.[结论]本研究结果为深入开展CyHV-2 ORF25B编码蛋白功能及病毒入侵宿主细胞的机制研究奠定了重要基础.

研究通过在异育银鲫脊髓细胞系(Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio,CSC)中对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)ORF57进行RNA干扰,以探究其对CyHV-2病毒复制的影响.首先,以FAM标记的异育银鲫β-actin的siRNA进行CSC细胞转染条件的优化,再将针对CyHV-2 ORF57基因设计的3条siRNA,转染CSC细胞,并进行病毒感染,评估siRNA对病毒复制和致细胞病变的影响.转染条件优化结果显示,在siRNA浓度为80 nmol/L,转染液维持24h后更换维持液,β-actin基因表达量最低且观察到的荧光点数量最多.而ORF57-siRNAs干扰结果显示,ORF57-siRNA-2组表现出了较强的抑制效果,在接毒48h时,ORF57-siRNA-2处理组的ORF57基因表达量降到相对于Mock组的33.55％(P<0.01),并且各ORF57-siRNA组都表现出了延缓CyHV-2致细胞病变的时间和强度,抑制时间可达120h.TCID50结果显示,不同组的ORF57-siRNAs均能降低病毒滴度,其中ORF57-siRNA-2将病毒原液TCID50108.487/mL下降至106.776/mL.研究结果表明,干扰ORF57的表达可大大降低CyHV-2的致细胞病变力和复制率,ORF57在CyHV-2复制与致细胞病变中起重要作用.本研究为CyHV-2基于siRNA技术的抗病毒治疗和弱毒株的改造提供了借鉴.

为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在感染过程中的生物学功能,构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)16℃诱导蛋白表达,经尿素溶解透析获得溶解的重组蛋白后免疫6周龄小鼠,制备鼠抗tORF66多克隆抗体.将纯化后重组蛋白进行噬菌体展示以此来筛选互作蛋白.经Western Blot检测显示,抗体能够识别感染鲫鳍条细胞系GICF细胞中的鲤疱疹病毒Ⅱ型,效价较高,特异性较好.噬菌体淘选结果通过生物信息学分析显示,得到一条出现频次最高的多肽N′-LHLHQNRMSLSR-C′.该多肽与金鱼基因组中的3个基因有较高的同源性,推断其可能与rORF66重组蛋白相互作用.这将为深入探究ORF66在CyHV-2病毒感染过程中的生物学功能、开发抗CyHV-2病毒新药物及寻找潜在的药物靶点提供新依据.