目的:探讨ⅩⅦ型胶原蛋白α1（COL17α1）在小鼠衰老皮肤中的表达与作用及其对人表皮干细胞（ESC）干性和增殖能力的影响，并且探讨相关微小RNA（miR）干预人ESC中COL17α1表达的机制。方法:采用实验研究方法。取2个月龄（青年）和24个月龄（老年）雄性C57BL/6J小鼠各12只，取其胸背部全层皮肤标本进行后续检测。对青年小鼠和老年小鼠全层皮肤标本，行苏木精-伊红染色后观察表皮层结构并测量表皮厚度，用透射电子显微镜观察表皮基底膜形态和半桥粒并行半桥粒计数，分别采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）法与蛋白质印迹法检测COL17α1的mRNA与蛋白表达，采用免疫荧光法观测COL17α1的蛋白表达与分布。取于解放军总医院第四医学中心行包皮切除手术的3名20~30岁健康男性术后弃用的新鲜包皮组织，提取ESC，取生长良好的细胞进行后续实验。按随机数字表法（分组方法下同）将ESC分为进行相应处理的空白对照组、转染试剂对照组、空载体质粒组、敲低COL17α1质粒组，培养48 h后，采用实时荧光定量RT-PCR法检测COL17α1的mRNA表达，采用蛋白质印迹法检测COL17α1和细胞角蛋白14（CK14）的蛋白表达，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖水平。通过DIANA、miRTarBase、miRNAMap、TargetScan、microRNA数据库筛选可能作用于 COL17α1 mRNA 3'非编码区的miR。将ESC分为转染miR模拟物阴性对照物的阴性对照组和转染前述筛选出的各miR的模拟物的各miR模拟物组，转染后48 h，通过蛋白质印迹法检测COL17α1的蛋白表达。基于基因表达综合数据库（GEO）的miR测序数据集GSE114006，使用GEO2R工具统计分析前述筛选出的可造成COL17α1蛋白表达下降的miR在30名青年（18~25岁）人和30名老年（>70岁）人皮肤中的表达。取青年小鼠和老年小鼠全层皮肤标本，采用实时荧光定量RT-PCR法检测前述老年人皮肤中表达增多的miR的表达。取2批ESC，第1批分为COL17α1野生型+miR-203b-3p阴性对照组与COL17α1野生型+miR-203b-3p模拟物组，第2批分为COL17α1突变型+miR-203b-3p阴性对照组与COL17α1突变型+miR-203b-3p模拟物组，分别转染对应序列，48 h后，采用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测COL17α1的基因表达水平。组织实验中样本数均为6，细胞实验中样本数均为3。对数据行独立样本 t检验、单因素方差分析、LSD检验或Dunnett检验、Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验。 结果:与青年小鼠比较，老年小鼠皮肤表皮层与真皮层分界模糊且细胞层次较少，表皮层厚度明显变薄（ Z=-2.88， P<0.01），基底膜形态不连续，表皮-真皮连接处半桥粒较少且分布不均，半桥粒数量明显减少（ Z=-2.91， P<0.01），COL17α1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低（ t值分别为10.61、6.85， P<0.01）。与青年小鼠比较，老年小鼠皮肤表皮基底层和毛囊球部的COL17α1蛋白表达均明显减少（ Z=-2.24， P<0.05）。培养48 h后，空白对照组、转染试剂对照组、空载体质粒组、敲低COL17α1质粒组ESC中COL17α1的蛋白表达水平分别为1.00±0.27、1.12±0.21、1.13±0.23、0.42±0.18。相较于空白对照组，转染试剂对照组和空载体质粒组ESC中COL17α1的mRNA和蛋白表达水平、CK14的蛋白表达水平及ESC增殖水平均未发生明显变化（ P>0.05），敲低COL17α1质粒组ESC中这些指标均明显降低（ P<0.05或 P<0.01）。miR-203a-3p、miR-203b-3p、miR-512-5p、miR-124-3p、miR-28-5p、miR-590-3p、miR-329-5p可能结合 COL17α1 mRNA的3'非编码区。转染48 h后，与阴性对照组的1.000±0.224比较，miR-329-5p模拟物组、miR-203b-3p模拟物组和miR-203a-3p模拟物组ESC中COL17α1的蛋白表达水平明显降低（0.516±0.188、0.170±0.025、0.235±0.025， t值分别为3.17、5.43、5.07， P<0.05或 P<0.01）。老年人皮肤中仅miR-203b-3p表达水平明显高于青年人（ t=3.27， P<0.01）。老年小鼠皮肤中miR-203b-3p表达水平明显高于青年小鼠（ Z=-2.88， P<0.01）。转染后48 h，COL17α1野生型+miR-203b-3p模拟物组ESC中COL17α1的基因表达水平明显低于COL17α1野生型+miR-203b-3p阴性对照组（ t=7.66， P<0.01），COL17α1突变型+miR-203b-3p模拟物组ESC中COL17α1的基因表达水平与COL17α1突变型+miR-203b-3p阴性对照组相近（ P>0.05）。 结论:COL17α1的mRNA和蛋白表达水平随小鼠年龄增长而减少，可能导致小鼠ESC脱离表皮基底膜。COL17α1的表达减少可抑制CK14的表达与ESC增殖，这可能是老年人皮肤中表皮层变薄和创面愈合减慢的原因。小鼠衰老皮肤中表达增多的miR-203b-3p可以靶向结合 COL17α1 mRNA的3'非编码区，阻碍转录后翻译过程，造成COL17α1蛋白表达减少。

目的 探究接头相关蛋白复合物1亚基σ1(AP1S1)基因表达水平与乳腺癌化疗患者预后之间的相关性,分析AP1S1在乳腺癌化疗耐药中的作用.方法 采用生物信息学方法,对癌症基因组图谱(TCGA)数据库中的乳腺癌患者和乳腺正常组织的AP1S1表达水平差异进行分析.运用Kaplan-Meier生存分析法,探究AP1S1表达水平与乳腺癌化疗患者无复发生存预后的关联.通过细胞培养、RNA提取、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹(Western blot)分析及药物敏感性实验等多种实验手段,基于AP1S1高表达的乳腺癌细胞模型,研究AP1S1基因高表达对乳腺癌细胞化疗耐药的影响,并考察AP1S1过表达对肿瘤细胞干性及上皮-间充质转化(EMT)特性标志物表达的作用.结果 乳腺癌组织中AP1S1基因的表达水平显著高于正常组织,差异有统计学意义(P＜0.05).在肿瘤不同分期,AP1S1基因的表达水平均表现出显著高于正常组织,差异均有统计学意义(P均＜0.05);其中4期肿瘤的过表达水平更高,差异有统计学意义(P＜0.05).管腔(Luminal)型、人类表皮生长因子2(HER2)阳性型和三阴型乳腺癌组织较正常组织均表现出AP1S1基因高表达,差异均有统计学意义(P均＜0.05);其中在HER2阳性型和三阴型乳腺癌组织中AP1S1表达水平更高,差异均有统计学意义(P均＜0.05).Kaplan-Meier生存分析发现,AP1S1高表达的乳腺癌患者在化疗后无复发生存期显著短于低表达组,差异有统计学意义(P=0.038);在三阴型、HER2阳性乳腺癌患者中,AP1S1高表达与化疗后预后不良显著相关(P=0.037、0.017);Luminal B型患者中,AP1S1高表达与较长的无复发生存期显著相关(P=0.007).实时荧光定量PCR显示,与对照组比较,在AP1S1过表达的细胞系CAL-51-oe-AP1S1、Hs-578T-oe-AP1S1中AP1S1转录水平显著上调,差异均有统计学意义(t=23.51、6.22,P均＜0.05);Western blot 结果显示,与对照组比较,在 AP1S1 过表达的细胞系 CAL-51-oe-AP1S1、Hs-578T-oe-AP1S1中AP1S1蛋白水平显著上调,差异均有统计学意义(P均＜0.05);肿瘤药物敏感性基因组项目(GDSC)数据库中分析结果显示,乳腺癌细胞CAL-51、Hs-578T的半抑制浓度(IC50)分别为0.008 398、0.000 935 μmol/L;药物毒性实验结果显示,过表达AP1S1显著增强了乳腺癌细胞CAL-51、Hs-578T对化疗药物多西紫杉醇的耐受性,差异均有统计学意义(t=8.74、9.90,P均＜0.05);三维培养实验结果显示,过表达AP1S1的CAL-51细胞形成更多的球体细胞团,而对照组的结构在药物作用下显著恶化,差异有统计学意义(t=11.54,P＜0.05).与对照组比较,在CAL-51-oe-AP1S1、Hs-578T-oe-AP1S1乳腺癌细胞系中,AP1S1过表达在转录水平上显著上调了干细胞标志基因纳诺克同源盒(NANOG)、辛烷结合转录因子4(OCT4)、性别决定区相关HMG盒基因2(SOX2)、B细胞特异性分化基因1(BMI1)以及多药耐药相关基因ATP结合盒转运蛋白G2(ABCG2)的表达,差异均有统计学意义(t=20.75、39.05、28.55、29.76、94.18,24.78、17.79、19.60、14.10、16.79,P均＜0.05);同时显著降低 了上皮钙黏蛋白(E-cadherin)(CDH1)和紧密连接蛋白1(TJP1)的mRNA表达,并增加了与EMT相关的标志物神经钙黏蛋白(N-cadherin)(CDH2)和波形蛋白(VIM)的表达,差异均有统计学意义(t=6.26、4.99、9.79、5.23,13.25、19.87、13.83、11.42,P均＜0.05).在CAL51 细胞系中,Western blot结果显示,AP1S1的过表达导致干细胞标志基因SOX2的表达水平上升和多药耐药基因ABCG2的表达增加,同时显著抑制了细胞黏附蛋白E-cadherin的表达,并促进了 N-cadherin的过表达,差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 AP1S1在乳腺癌中高表达,不仅促进化疗药物多西紫杉醇的耐药性,还促进乳腺癌细胞的干性增强并诱发EMT过程.

目的:探讨酒川芎(wine-processed Chuanxiong Rhizoma,WCR)联合吉非替尼或厄洛替尼治疗表皮生长因子受体(epider-mal growth factor receptor,EGFR)突变型非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)脑移植瘤的作用机制.方法:建立ABCB1-MDCK细胞和PC9 细胞共培养体系,采用流式细胞术检测WCR(2g·L-1)联合吉非替尼或厄洛替尼(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1)作用于PC9 细胞的凋亡情况.通过 ABCB1-MDCK 细胞单层转运模型评估 WCR(0.5g·L-1、1g·L-1、2g·L-1)联合吉非替尼或厄洛替尼(8 μmol·L-1)的跨膜转运情况,并计算表观渗透系数(Papp).体外培养ABCB1-MDCK细胞,采用透射电镜法、免疫荧光法(immunofluorescence,IF)和蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测超微结构和紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达水平.建立裸鼠NSCLC脑移植瘤模型,检测WCR联合吉非替尼或厄洛替尼对裸鼠脑内肿瘤生长、生存时间和药物含量的影响.结果:与单用吉非替尼或厄洛替尼比较,WCR联合吉非替尼或厄洛替尼可增加PC9 细胞的凋亡率(P<0.05).WCR联合吉非替尼或厄洛替尼的Papp(AP→BL)较吉非替尼或厄洛替尼增加(P<0.05),且与WCR浓度呈正相关.透射电镜结果显示,WCR可破坏ABCB1-MDCK细胞的紧密连接结构.IF和WB结果显示,WCR可降低ABCB1-MDCK细胞的ZO-1、P-gp表达水平(P<0.01).WCR联合吉非替尼或厄洛替尼可抑制脑内肿瘤生长、延长裸鼠生存时间并增加吉非替尼或厄洛替尼含量.结论:WCR联合吉非替尼或厄洛替尼可能通过促进细胞凋亡、改善药物转运以及下调ZO-1、P-gp表达水平,从而发挥治疗EGFR突变型NSCLC脑移植瘤的作用.

背景:增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖、表皮增厚和角质层功能不良为特征的皮肤纤维化疾病,目前其具体发病机制仍不清楚.目的:基于生物信息学筛选增生性瘢痕相关数据集的核心(Hub)基因及重要信号通路,再用细胞实验加以验证,预测对其可能有治疗作用的小分子药物.方法:从基因表达综合数据库搜索增生性瘢痕相关的数据集,通过R软件筛选差异表达基因,对差异表达基因进行基因本体论和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)富集分析,使用String在线平台构建差异表达基因的蛋白质相互作用网络,然后分别利用Cytoscape软件中的Cytohubba和MCODE插件筛选出蛋白质相互作用网络中的关键基因和核心模块,进一步将上述关键基因和构成核心模块的基因求交集得到Hub基因,通过荧光定量PCR验证Hub基因mRNA在人增生性瘢痕与正常皮肤表皮干细胞中的表达差异,并利用人类蛋白图谱中组织学数据验证Hub基因编码蛋白在2种组织中表达量和分布的差异,最后用connectivity map数据库预测针对增生性瘢痕的潜在作用药物.结果与结论:①筛选出的差异表达基因中上调基因102个、下调基因702个,基因本体论和KEGG分析结果显示,富集的信号通路及生物学过程主要涉及紧密连接、花生四烯酸代谢、细胞外基质受体交互、表皮发育和角质化等;②取交集得到8个Hub基因与调控胆固醇代谢的甲羟戊酸途径密切相关,分别是HMGCS1、DHCR7、MSMO1、FDPS、MVK、HMGCR、MVD和ACAT2;③荧光定量PCR结果显示,相比正常皮肤组,增生性瘢痕组HMGCS1、DHCR7、MSMO1、FDPS、HMGCR、MVD和ACAT2 mRNA的表达均显著下降(P＜0.05),而MVK mRNA的表达无明显变化(P＞0.05);④除MVK外,其余Hub基因编码蛋白在正常皮肤组织中表达水平均高于增生性瘢痕组织(P＜0.05);⑤评分排列前10的候选药物包括蛋白激酶A抑制剂(H-89)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(Dabigatran-Etexilate)、FLT3抑制剂(舒尼替尼)等,其中白藜芦醇和β-谷甾醇均为植物来源;⑥提示与甲羟戊酸代谢途径密切相关的Hub基因可能通过调控脂质代谢影响表皮结构与功能,这可能是增生性瘢痕的重要发病机制之一,此次研究筛选的小分子化合物可作为治疗增生性瘢痕的候选药物.

自身免疫性大疱性皮肤病(autoimmune bullous dermatoses,AIBD)与针对皮肤及黏膜组织中结构蛋白的自身抗体相关.天疱疮疾病中的自身抗体主要针对桥粒的组成部分,而类天疱疮疾病中的自身抗体主要针对真表皮连接的结构蛋白.这两类疾病的治疗方法不同,因此需要依靠实验室诊断予以鉴别.传统实验室诊断方法包括直接免疫荧光(direct immunofluorescence,DIF)、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,IIF)、酶联免疫吸附试验(enzyme-inked immunosorbent assay,ELISA)和免疫印迹(immunoblotting,IBT).近年来,不断有新型实验室技术出现.生物芯片技术简化了IIF的判读,成本较低且高效,对桥粒芯糖蛋白(Dsg3)和大疱性类天疱疮抗原180(BP180)的检出率分别高达97%～100%和94%;EUROTide? 孵育技术比传统DIF方法灵敏度和特异度更高,背景荧光更少;MESACUP anti-Skin profile TEST能同时检测多种抗体,对Dsg1和Dsg3的检测特异度可达100%;侧向流动免疫层析技术(lateral flow immunoassay,LFIA)可用于快速定性检测,能肉眼观察结果;化学发光酶免疫技术与ELISA相比符合率可达到94%～99%,且检测时间短、自动化程度高;荧光叠加抗原定位-激光扫描共焦显微镜技术(fluorescence overlay antigen mapping using laser-scanning confocal microscopy,FOAM-LSCM)能够一次性对皮肤基底膜带的不同成分进行区别染色,比传统手工DIF法效率更高,且有助于诊断在传统方法下难以与大疱性类天疱疮或获得性大疱性表皮松解症区分的AIBD.实验室诊断技术对AIBD的治疗和预后有着重要作用,本文基于传统实验室方法,比较并探讨了新技术在AIBD诊断中的应用价值.

Trop2是人滋养层细胞表面糖蛋白抗原 2,又名肿瘤相关钙离子信号转导子 2(TACSTD2)、表皮糖蛋白 1 (EGP-1)、胃肠肿瘤相关抗原(GA733-1)、表面标志物 1 (M1S1),是由染色体 1p32区域的Tacstd2基因编码表达的细胞表面糖蛋白[1-2].Trop2属 GA733蛋白家族,与上皮细胞黏附分子(EpCAM,又称 Trop1、TACSTD1)有较高结构序列相似性,同源性达 49％.研究证明,Trop2可能是 EpCAM信号通路调节中的增强子[3].Trop2蛋白初级结构是由 323个氨基酸组成的 36 kD的多肽,初级结构经 N-端糖基化翻译后修饰,形成不同于 EpCAM的 I型细胞膜糖蛋白,即 Trop2蛋白.Trop2蛋白横跨细胞膜,N-端为胞外域(Trop2EC),该胞外域通过一个单向跨膜螺旋(TM)与由 26个氨基酸残基构成的疏水性多肽的胞内短尾(Trop2IC)连接,从而固定于胞膜[4].

目的:观察银屑病样小鼠皮损紧密连接蛋白中水闸蛋白(claduin-1,claudin-7),闭锁蛋白(occludin)的表达,明确养血解毒方对银屑病表皮通透屏障的修复作用,为养血解毒方治疗银屑病提供科学依据.方法:将C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组、甲氨喋呤组、养血解毒方组,制备甲氨喋呤溶液、养血解毒方水煎剂对应灌胃干预,同时小鼠背部剃毛后给予咪喹莫特涂抹诱导银屑病样皮损模型.每日拍照记录皮损形态并对严重程度指数(PASI)评分;水油测试笔检测皮损表皮含水量;苏木素-伊红(HE)染色观察其病理改变、测量表皮厚度;免疫荧光法检测增殖相关的核抗原(Ki67);免疫组化法检测表皮兜甲蛋白(loricrin),真皮中CD3+T淋巴细胞浸润和紧密连接蛋白claduin-1,claudin-7,occludin的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测皮损中claudin-7,occludin的表达.模拟银屑病皮损微环境,建立白细胞介素-17(IL-17,1 mg·L-1)刺激的角质形成细胞(Hacat)模型,制作养血组分、解毒组分、养血解毒方喷干粉进行干预.采用细胞增殖毒性检测试剂盒-8(CCK-8)法检测药物对Hacat细胞的毒性;细胞免疫荧光法检测药物对角质形成细胞claudin-1,claudin-7,occludin表达的干预作用.结果:与模型组比较,养血解毒方可显著减轻小鼠银屑病样皮损表现,降低PASI评分及皮损表皮厚度(P＜0.01),增加皮损区表皮水分含量(P＜0.01),减少表皮ki67,loricrin的异常表达和真皮CD3+T细胞浸润(P＜0.01),并增加紧密连接蛋白claudin-1,claudin-7,occludin的表达(P＜0.05),增加紧密连接结构的完整性;体外研究发现,与模型组比较,养血解毒方组和养血组分组明显升高紧密连接蛋白claudin-1,claudin-7,occludin的表达(P＜0.05);与模型组比较,解毒组分组蛋白表达水平无统计学差异.结论:养血解毒方通过调节角质形成细胞间紧密连接的表达抑制其异常的增殖分化过程,进一步恢复破坏的表皮通透屏障,可能是其治疗银屑病的作用机制之一.其中养血解毒方的养血组分对调节紧密连接的修复起主要作用.

目的 探讨泛素折叠修饰因子1特异性肽酶结构域蛋白(ZUP1)基因在乳腺癌中的表达情况及上下游机制.方法 使用基因表达汇编(GEO)、癌症基因组图谱(TCGA)和基因型-组织表达(GTEx)数据库,检索收集乳腺癌患者的基因信息和临床病理数据,通过χ2检验分析乳腺癌组织中ZUP1基因表达与临床病理因素的关系,使用Kaplan-Meier生存分析探讨乳腺癌患者生存状况与ZUP1表达的关系.用生物信息学方法预测潜在调控ZUP1的miRNA和泛素连接酶,最后进行基因集富集分析.结果 ZUP1基因在乳腺癌组织中的表达高于正常对照组织.ZUP1表达水平与乳腺癌T分期、PAM50分型、雌激素受体状态、孕激素受体状态、人表皮生长因子受体2状态和组织学类型有关(P均<0.01),ZUP1高表达组患者的总生存时间低于ZUP1低表达组(P=0.031).生物信息学预测结果显示,以ZUP1基因为靶点的差异表达最显著的10个miRNA为miRNA-10b-3p、miRNA-499a-5p、miRNA-181b-2-3p、miRNA-181b-3p、miRNA-4420、miRNA-548aw、miRNA-5680、miRNA-570-3p、miRNA-7156-5p和miRNA-8087,包括MARCH1、MARCH8、Mdm2、synoviolin和MIB1在内的E3泛素连接酶可能调节ZUP1蛋白表达.基因集富集分析结果表明ZUP1在乳腺癌中主要参与基础转录因子、泛素介导的蛋白质水解、卵母细胞减数分裂、RNA降解和极光激酶B等通路.结论 ZUP1在乳腺癌中表达上调,与患者预后具有相关性.ZUP1在乳腺癌发生、发展中的上下游机制与多种miRNA和多条信号通路有关.

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种常见的慢性炎症性皮肤病,皮肤屏障功能障碍在AD发生中起着关键作用.表皮连接结构如桥粒、半桥粒和紧密连接等,是维持皮肤结构完整性和屏障功能的关键,而这些连接结构相关蛋白如桥粒胞质蛋白、桥粒跨膜蛋白、闭锁蛋白、claudin、闭锁小带蛋白和连接黏附分子等,则是表皮连接结构发挥功能的基础.这些蛋白的异常表达将导致屏障功能破坏,引起持续的炎症和皮肤的损伤,最终导致AD的发生.本文就表皮连接结构相关蛋白在AD中的作用进展进行总结.

表皮细胞紧密连接(tight junctim,TJ)被认为是表皮细胞屏障系统的主要控制因子.新近研究发现,TJ异常会导致皮肤屏障受损,是特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)发病基础的重要环节之一.TJ的表达及功能异常可导致皮肤屏障受损,皮损处免疫应答产生的炎症因子破坏TJ的结构,从而导致恶性循环即AD皮损区域持续不断的炎症反应.通过调节TJ蛋白的表达和连接,可以达到修复皮肤屏障功能的目标,为治疗AD及其他皮肤屏障破坏相关疾病提供新的治疗思路.