目的 研究柑橘中黄酮类成分的质谱裂解规律.方法 测定柑橘中14种代表性黄酮的二级质谱,根据精确质荷比确定各离子的元素组成,全面解析碎片离子和裂解途径,系统总结黄酮的质谱裂解规律.结果 柑橘黄酮苷在质谱中的裂解为依次脱去两个单糖;苷元的裂解方式有脱-CH3、脱-CO、C环开环等,以上各种途径在二氢黄酮、黄酮和黄酮醇结构中出现差异.结论 柑橘中黄酮类成分的电喷雾质谱裂解有一定的规律,这些特征的碎片离子可作为鉴别复杂体系中黄酮类成分的依据.

异绿原酸A(ICA)为茵陈等多种中药的主要药效成分.该研究旨在鉴定口服给药ICA的大鼠血浆、尿液和粪便中的代谢产物,并推测其潜在的代谢途径.ICA灌胃大鼠后,收集不同时间点(段)的血浆、尿液和粪便样品,利用高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱(HPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS)技术,结合对照品比对保留时间、裂解规律总结和文献数据,对生物样品中代谢产物进行结构鉴定.从大鼠样品中初步鉴定了 ICA的39个代谢产物(M1～M39),其中31个来自于血浆(M1～M10、M12～M24、M26～M28、M30、M34～M35、M38～M39)、34 个来自于尿液(M1～M11、M13～M15、M19～M25、M27～M39)、11个来自于粪便(M2～M3、M6、M15、M21～M23、M32、M34、M36～M37),主要代谢途径包括水解、葡萄糖醛酸化、甲基化和磺酸化反应等.该研究揭示了 ICA在大鼠血浆、尿液和粪便中的代谢情况,对深入阐明其药理活性成分提供参考.

目的 建立超高效液相色谱串联—四极杆—静电场轨道阱质谱技术(ultra-performance liquid chromatogra-phy-linear ion trap quadrupole-Orbitrap-mass spectrometry,UPLC-Q-Orbitrap-MS)对铁皮石斛(Dendrobiumoffi-cinale Kimura&Migo)水提物石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种萃取组分进行定性表征的方法.方法 提取铁皮石斛水提物并依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,旋蒸浓缩后,得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取组分.样品经UPLC-Q-Orbitrap-MS分析,根据元素组成、分子量、质荷比、离子碎片等确定化合物信息并推导裂解规律,通过与文献、MzCloud、MzVault、PudChem、本地数据库比对确定鉴定结果.结果 在正负离子模式下共鉴定出化合物62种,包括黄酮类成分20种,联苄类成分6种,羧酸及其衍生物6种,脂肪酸及其衍生物6种,酚类成分4种,氨基酸及其衍生物3种,糖类成分2种,生物碱类、苯丙素、蒽醌、萜类化合物各1种,其他类成分3种,还检测到8种含量较高、质谱信号较强的未知成分.其中水提石油醚萃取物中鉴定出化合物7种,乙酸乙酯萃取物中鉴定出化合物36种,正丁醇萃取物中鉴定出化合物48种.通过与文献比对,62种化合物中有7种化合物为首次从铁皮石斛中提取得到.结论 该方法可快速有效分析铁皮石斛中多种化学成分,可为铁皮石斛质量控制及药效物质基础研究提供参考.

目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

利用在原核生物中观察到的规律成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）与相关的Cas（CRISPR- associated proteins）蛋白构成CRISPR-Cas系统作为真核细胞中的基因编辑工具为近年研究热点。效应蛋白由多个Cas蛋白组成，包括两个大类五型系统。Cas蛋白结合特定的核酸序列，具有核酸酶的功能用于可编程基因组编辑和表观遗传调控，同时在疾病诊断方面也有很好的发展前景。其中Cas6是一种独立于金属的单转位酶，依附在crRNA裂解产物上，可识别并在crRNA转录前的重复序列中裂解单个磷酸二酯键。核糖核酸内切酶Cas9为RNA引导的DNA裂解酶，是目前应用最广泛的基因编辑工具，同时在感染性疾病检测、癌性病毒感染的消除或灭活、肿瘤免疫治疗、肿瘤基因组和表观基因组的调控等方面显示出巨大的应用前景。RNA引导的核酸内切酶Cas12a具有两种不同的核酸酶活性，且该双重催化活性已被用于多重基因编辑。Cas12a的显著特性使其应用于目标DNA与RNA快速检测，成为CRISPR-Cas基因组编辑工具包的补充。RNA引导的RNA靶向核酸内切酶Cas13a是RNA引导、RNA激活的RNA酶，已被开发为RNA检测、RNA成像和RNA调控的强大工具，同时利用Cas13a构建高灵敏度及特异度的检测方法也可为感染性疾病在诊断过程中提供重要的理论依据。由此展开对CRISPR-Cas系统相关的Cas蛋白的深入研究，同时对上述系统在不同疾病中的重要应用等进行阐述，有助于为各项研究提供新思路，新方法。

目的:研究一株G4P[6]基因型A组轮状病毒（group A rotavirus，RVA）CZ079的全基因组特征及进化规律。方法:利用逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）对CZ079的VP7、VP4、VP6、NSP1节段分别进行RT-PCR扩增，通过在线RVA自动分型工具对其分型，采用DNAstar5.1和Mega11.0软件对各节段进行同源性及遗传进化分析。结果:CZ079毒株基因型为G4-P[6]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1。VP6为I5型，NSP1为A8型。CZ079与LLR?、RotaTeq?和Rotarix?三种疫苗株在VP7的抗原表位中7-1b区域均存在氨基酸差异；VP4蛋白裂解后的VP8*抗原表位中8-1、8-2、8-3、8-4、5-1区域存在较大差异。结论:2022年RVA毒株CZ079为罕见的G4P[6]-I5-A8型，推测该基因型RVA是由越南等东南亚地区传入中国，与中国RVA发生重配产生的新型重配毒株。

目的:研究我国一例G1P[8]基因型A组轮状病毒(group A rotvirus，RVA)SC18511073的序列特征及进化规律，分析SC18511073与RotaTeq?和Rotarix?疫苗的抗原表位之间的差异。方法:用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对SC18511073的11个节段进行RT-PCR扩增，利用在线RVA自动分型工具对其分型，采用DNAstar5.1和Mega11.0等软件对11个节段进行同源性及遗传进化分析。结果:SC18511073全基因组基因型为G1P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E2-H1，NSP4为E2型。VP7和NSP3与同年份四川流行G1P[8]-E1型毒株同源性较高，系统进化树显示位于同一分支，其余9个基因节段均与我国流行的G9P[8]-E2型RVA高度同源，且归属于同一进化分支。SC18511073与RotaTeq?和Rotarix?在VP7的抗原表位中7-1a和7-2区域存在5个氨基酸差异；VP4蛋白裂解后的VP8 *抗原表位中8-1、8-3区域存在差异。 结论:我国2018年RVA毒株SC18511073为罕见的G1P[8]-E2型，推测是由G1P[8]-E1基因型与G9P[8]-E2基因型RVA毒株共感染过程中VP7和NSP3节段发生重配产生的新型毒株。SC18511073与RotaTeq?和Rotarix?在VP7和VP4上的抗原表位存在较多氨基酸位点差异。

目的:阐明清肝颗粒治疗黄疸性肝炎的物质基础,建立科学的质量控制方法.方法:采用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱(UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)技术对清肝颗粒的活性成分进行表征分析;以清肝颗粒中鉴定出的活性成分为目标对象,进行网络药理学和分子对接研析,并建立多成分含量测定方法.结果:共鉴定出134个成分,其中黄酮类50个、糖苷类8个、苯丙素类17个、三萜类11个、萜类6个、氨基酸类11个、有机酸类9个、脂肪酸类7个、生物碱类8个、挥发油类5个、醌类1个,并解析了黄酮类、萜类、有机酸类、生物碱类以及糖苷类代表性化合物的裂解规律.通过网络药理学分析筛选出8个核心靶点.预测了主要活性成分为异甘草素、腺苷、甘草素、鸟苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸等.其次,依据可测性、特征性以及活性相关性的原则,建立了 3,4-二咖啡酰奎宁酸、(R,S)-告依春、甘草素、4,5-二咖啡酰奎宁酸和甘草酸铵等5个潜在活性成分的含量测定方法.结论:筛选出了清肝颗粒治疗黄疸性肝炎的主要药效活性成分,并展开定量研究,可为清肝颗粒质量控制水平的提高提供了依据.

目的 采用超高效液相色谱-质谱(UPLC-QTOF/MS)鉴定蕨麻中化学成分.方法 Acquity UPLC HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相:0.05%甲酸水溶液-乙腈,梯度洗脱;体积流量:0.3 mL/min;柱温:40℃;进样体积:2 μL.ESI电喷雾离子源正负离子扫描,二级IDA扫描模式下采集碎片数据.通过Sciex OS 2.0 数据处理软件结合数据库、对照品、部分文献和天然产物裂解规律对蕨麻水提液中化学成分进行鉴定.结果 共鉴定出 53 种化学成分,其中氨基酸类 10 个,酚酸类 8 个,萜酸类 4 个,黄酮类7 个,季胺类生物碱 1 个,其他类23 个.以野鸦椿酸、鞣花酸为例进行碎片离子裂解推测.结论 该方法准确稳定,适用于蕨麻中化学成分的鉴定,为后续的质量控制和物质基础研究提供参考.

采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Orbitrap-HRMS)联用技术对灵芝醇提物的化学成分进行系统分析,总结其代表性化学成分的裂解规律,并对灵芝潜在作用于法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)靶点的抗肝纤维化活性物质进行研究,阐明其药效物质基础.初步鉴定出灵芝醇提物95种化学成分,包括灵芝酸类24种、灵芝烯酸类9种、赤芝酸类13种、丹芝酸类3种、灵芝内酯类1种、其他三萜类成分40种、脂肪酸类成分4种、其他类1种,并分析了其裂解规律.如灵芝酸、灵芝烯酸类成分的结构特征以C30为骨架,含有游离的-COOH及-OH,易失去H2O、CO2分子形成碎片离子,D环多为五元环,易发生断裂;赤芝酸类成分属于C27骨架的羊毛甾烷型,与灵芝酸类成分相比其侧链结构变短,由8个碳减少为5个,同灵芝酸类含有常见的游离-COOH、-OH,容易失去H2O、CO2分子.通过选取已报道的6种FXR受体激动剂组成训练集,建立基于FXR配体的药效团模型,以鉴定出的95种灵芝化学成分与药效团进行匹配,通过测试集分子对模型进行验证,选出最优药效团模型02(敏感性=0.750 00,特异性=0.555 56,ROC=0.750)用于对灵芝化合物库的虚拟筛选,经匹配筛选得到31种潜在的可用于激活FXR的灵芝活性成分,随后ADMET预测结果表明灵芝酸H和赤芝酸J与血浆蛋白的结合率低于90％,且无肝毒性,可作为FXR激活剂开发单用或联用治疗肝纤维化的临床药物.