目的:探讨Slit引导配体2(Slit2)对糖尿病小鼠角膜上皮和神经损伤修复的促进作用及其可能的分子机制。方法:选取60只SPF级5~6周龄C57BL/6小鼠，采用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组和Slit2注射组，每组20只。糖尿病模型组和Slit2注射组小鼠采用链脲霉素腹腔内注射法建立糖尿病模型。构建小鼠角膜上皮损伤修复模型，Slit2注射组于造模后即刻结膜下注射Slit2重组蛋白，糖尿病模型组小鼠结膜下注射等容量PBS，正常对照组不做处理。采用角膜荧光素染色法观察小鼠角膜上皮缺损后24、48和72 h愈合情况；采用实时荧光定量PCR法检测正常对照组和糖尿病模型组小鼠角膜上皮中Slit2及其相关受体mRNA的表达；采用角膜铺片β-tubulin Ⅲ荧光染色法观察小鼠角膜神经形态变化；采用免疫荧光法检测正常对照组和糖尿病模型组小鼠角膜上皮中Slit2的表达分布及修复的角膜上皮中Slit2、表皮生长因子受体(EGFR)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、苏氨酸蛋白激酶(AKT)、β-连环蛋白(β-catenin)和Ki67的表达。将小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2)分为正常对照组、高糖组和Slit2干预组。采用Western blot法检测各组细胞中p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT、p-ERK/ERK和β-catenin的表达；取高糖培养的TKE2，采用Western blot法检测0.01、0.1和0.5 μg/ml Slit2处理10 min及0.5 μg/ml的Slit2处理前和处理后10、20、30、60、120 min时p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的表达。原代培养各组小鼠三叉神经节(TGs)细胞，采用β-tubulin Ⅲ免疫荧光染色法观察Slit2对于TGs细胞轴突再生的影响。结果:角膜上皮刮除后48 h和72 h，与正常对照组和Slit2注射组比较，糖尿病模型组小鼠角膜上皮修复速度明显减慢。糖尿病模型组小鼠正常角膜上皮中Slit2及其Robo1、Robo2、Robo4受体mRNA相对表达量明显高于正常对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。糖尿病模型组损伤修复的角膜上皮中Slit2免疫荧光强度明显弱于正常对照组。角膜铺片神经荧光染色显示，与糖尿病模型组比较，角膜上皮损伤后7 d Slit2注射组角膜神经丛致密，神经纤维数量增多且分布均匀，神经末梢可见较多分支。正常对照组和Slit2注射组修复的角膜上皮中p-EGFR、p-ERK、β-catenin和Ki67荧光明显强于糖尿病模型组。高糖组TKE2细胞内p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT和β-catenin相对表达量均明显低于正常对照组和Slit2干预组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。Slit2处理高糖培养TKE2细胞后10 min，p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的相对表达量较处理前均明显升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)，随着Slit2质量浓度的增加，TKE2细胞中p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT相对表达量逐渐升高，Slit2质量浓度为0.5 μg/ml时对EGFR和AKT信号通路的活化作用最明显。高糖组体外培养的TGs突触长度为(40.52±5.44)μm，明显短于正常对照组的(72.14±9.48)μm和Slit2注射组的(73.04±4.66)μm，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:Slit2通过激活EGFR信号通路对糖尿病模型小鼠角膜上皮发挥保护作用，并通过增加角膜上皮下神经丛密度和促进TGs细胞轴突生长，发挥神经保护能力。

目的:探讨聚乙二醇水凝胶膜(PHFs)是否能作为角膜上皮细胞(CECs)体外扩增的载体以及其能否用于角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)的治疗。方法:利用癸二酰氯、聚氧乙基甘油醚、聚已酸内酯二醇人工合成PHFs，检测其厚度、透光度和机械拉伸性能。取清洁级新西兰大白兔4只，培养原代角膜缘上皮细胞，荧光显微镜下观察培养细胞中角蛋白标志物AE1/AE3和干细胞标志物p63的表达；将细胞分为阴性对照组、阳性对照组和PHFs+CECs组，其中将阴性对照组细胞直接种植在培养皿底，加入普通细胞培养液，将阳性对照组细胞种植在培养皿后加入含有100 μmol/L H 2O 2的普通细胞培养液，将PHF+CECs组细胞种植在铺有PHFs的培养皿中用普通细胞培养液培养，各组培养24 h。采用MTT和TUNEL染色法分别观察3个组细胞增生和细胞凋亡情况。采用随机数字表法将清洁级新西兰大白兔15只分为对照组、PHFs组和PHFs+CECs组，每组5只。其中对照组造模后不给予任何处置；PHFs组将空PHFs膜置于LSCD实验兔角膜表面；PHFs+CECs组为将CECs传代后种植于PHFs上构建组织工程移植片后将移植片置于LSCD兔模型的角膜表面。采用荧光素染色法检测各组实验兔角膜缺损面积大小并评分；采用苏木精－伊红染色法检测各组实验兔角膜上皮组织学特点。 结果:PHFs厚度不超过150 μm，能承受约6 MPa的拉力，在400~700 nm可见光范围内透过率>99%。角膜缘原代培养的大多数细胞AE1/AE3染色和p63染色阳性。MTT实验结果显示，PHFs+CECs组、阴性对照组和阳性对照组 A490值分别为0.59±0.01、0.65±0.07和0.06±0.04，总体比较差异有统计学意义( F＝12.25， P<0.05)，其中PHFs+CECs组和阴性对照组 A490值明显大于阳性对照组，差异有统计学意义(均 P<0.05)。TUNEL检测结果显示，PHFs+CECs组、阴性对照组和阳性对照组TUNEL阳性细胞率总体比较差异有统计学意义( F＝13.45， P<0.05)，其中PHFs+CECs组和阴性对照组TUNEL阳性细胞率明显低于阳性对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。荧光素染色结果显示，随着术后时间的延长，各组角膜荧光素钠染色评分均降低，对照组、PHFs组和PHFs+CECs组角膜荧光素钠染色评分依次降低。苏木精－伊红染色结果显示，对照组存在较少形状不规则的角膜上皮细胞，PHFs组一些区域出现单层稀疏的角膜上皮细胞；PHFs+CECs组角膜上皮覆盖范围最大，细胞层数增加到3~5层，形态较规则，排列较紧密。 结论:PHFs韧性强、透光度高且能够体外扩增角膜上皮，适合做角膜上皮移植片，并能促进LSCD兔模型角膜上皮的修复。

背景:传统角膜支架材料的强度和生物相容相差,采用天然角膜组织成分的胶原和硫酸软骨素制备人工角膜尚未见报道.目的:制备具有缓释生长因子、高强度和透光性、良好生物相容性的胶原/硫酸软骨素/成纤维生长因子复合人工眼角膜.方法:将不同浓度(1％、5％、10％)的胶原溶液采用流延法制备为再生胶原膜,通过生物力学测试筛选出5％胶原溶液制备的再生胶原膜生物力学性能最优,用于制备复合膜.通过EDC-NHS交联法将不同质量浓度(2,20,80 g/L)的硫酸软骨素固定于再生胶原膜上,得到胶原/硫酸软骨素复合膜,通过透光率筛选出20 g/L硫酸软骨素制备的胶原/硫酸软骨素复合膜透光性最好,用于制备载生长因子复合膜.将胶原/硫酸软骨素复合膜与不同质量浓度(5,25,50 mg/L)的成纤维细胞因子10溶液共混于PBS中24 h,制备载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜,将其浸泡于PBS中,ELISA法检测上清液中生长因子水平.将再生胶原膜、胶原/硫酸软骨素复合膜及载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜分别与角膜上皮细胞共培养48 h,MTT法检测细胞增殖,筛选最佳载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜.将载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜与角膜上皮细胞共培养,48 h后,采用共聚焦显微镜观察细胞形态;72 h后,采用扫描电镜观察细胞形态.结果与结论:①成纤维生长因子10的释放量随复合膜中初始装载生长因子水平的增加而增加.同时,3种复合膜上的生长因子释放缓慢,并在72 h时分别达到11％、23％和30％,释放行为符合药代动力学过程;②通过MTT实验确定复合膜最佳生长因子负载质量浓度为25 mg/L;③共聚焦显微镜及扫描电镜显示,载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜可促进角膜上皮细胞的黏附、生长及增殖;④结果表明,载生长因子胶原/硫酸软骨素复合膜有望成为一种优良的人工角膜支架材料.

角膜缘干细胞是角膜上皮细胞再生的来源,是维持眼表稳态的关键.近年来,随着对成体干细胞认识的加深以及组织工程、生物材料及细胞培养技术的发展,体外培养的细胞膜片移植,包括角膜缘和口腔黏膜上皮细胞膜片移植进行眼表重建的基础研究获得了一定的进展,在临床应用中也得到了较好的治疗效果,但对眼表重建的临床效果和移植细胞的体内转归方面仍无定性的结论.本文主要对利用组织工程技术构建的自体或异体角膜缘上皮细胞、口腔黏膜上皮细胞膜片移植重建眼表的基础研究进展、临床应用情况及移植细胞体内转归的进展进行介绍和比较,以期为该领域的研究提供有益的探索方向.

目的 探讨建立在体角膜内皮损伤动物模型的方法 及其损伤后再生的潜能.方法选取2周龄的正常六角龙鱼30只.采用数字表法随机分为正常观察组、NaOH损伤组及机械损伤组,各10只.采用活体共聚焦显微镜检查、组织病理学检查、茜素红-曲利苯蓝内皮染色和氯化金角膜神经染色等方法观察.对正常观察组六角龙鱼,观察其眼球和角膜正常结构;通过NaoH溶液和器械两种方法损伤角膜内皮层,建立角膜内皮细胞损伤模型,观察其角膜内皮细胞再生的情况.对4个时间点角膜内皮细胞的密度进行正态性检验和方差齐性检验,使用重复测量方差分析对不同组别、不同时间点角膜内皮细胞密度的均值进行比较,事前进行Mauchly球形检验,如果检验结果 显著,采用多元方差分析,否则选用校正自由的F检验.结果六角龙鱼角膜厚度约为(75.75±7.51)μm,角膜上皮细胞层较厚,约占角膜厚度的一半.经NaoH溶液和器械两种方法损伤其角膜内皮细胞后,六角龙鱼角膜内皮细胞密度明显降低.NaoH损伤组和机械损伤组在不同时间点,六角龙鱼角膜内皮细胞密度的比较,具有统计学意义(F=31.38,51.77;P<0.05).而各个时间点间的差异,两组均无统计学意义(F=1.37,2.67,0.70,4.14;P>0.05).在损伤后3 d时,NaoH损伤组六角龙鱼角膜内皮细胞的密度为(128±14)个/mm2,机械损伤组为(113±11)个/mm2.与损伤前比较,其角膜内皮细胞密度的差异均有统计学意义(t=19.39,8.78;P<0.05);在损伤后7 d时,NaoH损伤组六角龙鱼角膜内皮细胞的密度为(157±20)个/mm2,机械损伤组为(169±19)个/mm2.与损伤后3 d时比较,其角膜内皮细胞密度均有所恢复,差异均有统计学意义(t=3.75,8.07;P<0.05);在损伤后14 d时,可见NaoH损伤组六角龙鱼角膜内皮细胞的密度为(198±17)个/mm2,机械损伤组为(223±17)个/mm2.与损伤后3 d时和7 d时比较,均有明显恢复,差异均有统计学意义(t=10.05,8.07;P<0.05)和(t=4.94,6.70;P<0.05).随着时间延长,两组六角龙鱼角膜内皮细胞的密度均逐渐恢复.在伤后14 d时,其角膜内皮细胞形态、大小和密度均基本恢复正常状态.结论 使用NaoH溶液和器械两种方法均可成功建立六角龙鱼角膜内皮细胞损伤的动物模型.初步观察结果表明,其角膜内皮细胞具有一定的再生潜能.此方法可为角膜内皮细胞损伤后再生研究提供一种新的动物模型.

Notch信号通路在胚胎期细胞命运转归和成体组织稳态的维持中起重要作用.各种研究已经证明Notch信号通路在角膜损伤后修复及角膜生理性稳态的维持中有重大意义,角膜缘干细胞主要通过抑制Notch信号通路来抑制细胞的分化和增生;在角膜上皮早期修复阶段生理性下调促进细胞迁移和伤口覆盖,后期修复阶段生理性上调与防止角膜上皮细胞过度分层和维持细胞分化相关;角膜基质损伤后纤维化与Notch信号通路相关;角膜内皮损伤后转化生长因子-β(TGF-β)诱导的内皮-间质转化(EnMT)过程有Notch信号通路的直接参与;此外,Notch信号通路与14-3-3σ、表皮生长因子受体(EGFR)、Sirt6、微小RNA(miRNA)、基质金属蛋白酶(MMPs)在角膜上皮稳态维持、角膜上皮分化、角膜基质过度炎症反应、角膜新生血管生成等存在相互作用.本文就Notch信号通路在角膜各层损伤修复中的功能进行综述.

目的 研究1 g·L-1和3 g·L-1玻璃酸钠(hyaluronate,HA)滴眼液对角膜内皮移植术后早期泪膜及角膜上皮细胞再生的作用.方法 选择2017年9月至2018年2月在北京大学第三医院行角膜内皮移植术的患者60例(60眼),随机分成1 g·L-1 HA组和3 g·L-1 HA组,每组各30例,观察标准干眼评估问卷(SPEED)评分、结膜角膜染色评分(OSS)、泪膜破裂时间(TBUT)、角膜上皮缺损范围,进行激光共聚焦显微镜检查.比较不同时间点组间、组内各指标差异.结果 SPEED评分:各时间点两组间比较差异均无统计学意义(均为P>0.05).组内比较:两组组内术后7 d、14 d、28 d均低于前一时间点(均为P=0.000),余相邻时间点两两比较差异均无统计学意义(均为P>0.05).TBUT:术后7 d、14 d、28 d 3 g·L-1 HA组均显著高于1 g·L-1 HA组(均为P<0.05),而术前组间差异不显著;组内比较:1 g·L-1 HA组后一时间点较前一时间点、3 g·L-1 HA组术后7 d较术前均显著延长(均为P<0.05),而3 g·L-1 HA组术后14 d、28 d与前一时间点差异均无统计学意义(均为P>0.05).OSS评分:术前及术后1 d、3 d两组间比较差异均无统计学意义(均为P>0.05),术后7 d、14 d、28 d 3 g·L-1 HA组均显著低于1 g·L-1 HA组(均为P<0.05);组内比较:两组术后1 d OSS评分均显著高于术前(均为P=0.000),其余时间点两组均低于前一时间点(均为P=0.000).角膜上皮缺损范围:术后1 d两组间比较差异均无统计学意义(均为P>0.05),术后3 d、7 d两组间比较,以及两组组内与前一时间点比较差异均有统计学意义(均为P<0.05).角膜基底细胞密度:术前、术后28 d两组间比较,以及1 g·L-1 HA组组内术前与术后28 d比较差异均无统计学意义(均为P>0.05),而3 g·L-1 HA组术后28 d显著低于术前(P=0.002).结论 HA可以有效改善角膜内皮移植术后早期泪膜状态并促进角膜上皮细胞再生,存在浓度依赖性.

目的 探讨去除型人皮肤成纤维饲细胞系的建立及其重建角膜表层的相关研究.方法 将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、端粒酶逆转录酶(hTERT)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)3种基因导入人皮肤成纤维细胞,建立荧光标记的永生化的可去除型TERT+TK-D人源饲细胞系.将创建的细胞系经丝裂霉素C处理后作为饲养细胞与人角膜缘干细胞共培养,并与3T3饲细胞的培养结果 作比较.结果 TERT+TK-D细胞系在体外经过6个月的连续传代后仍然表达绿色荧光蛋白,保持旺盛的分裂能力,对更昔洛韦敏感.TERT+TK-D组的克隆形成率(colony forming ef-ficiency,CFE)为(11.77±0.21)％,与3T3组CFE[(12.8±1.61)]％比较,差异无统计学意义(P=0.332);经过共培养,两组都形成了4～5层复层上皮细胞片.角膜缘干细胞克隆和上皮细胞片的免疫荧光染色及Real-time PCR定量分析结果 显示,TERT+TK-D组角蛋白K3表达低于3T3组;PCR结果 证实TERT+TK-D饲细胞在更昔洛韦作用下凋亡、裂解,没有混入培养获得的角膜上皮细胞片中.结论 转基因荧光标记的永生化的去除型人皮肤成纤维饲细胞有望替代3T3细胞用于角膜再生医疗.

肝素结合样表皮生长因子(HB-EGF)是表皮生长因子(EGF)家族中的一员,是一种高效的有丝分裂原和趋化蛋白.HB-EGF主要表达皮肤表皮基底层,可通过刺激角质细胞迁移、基底细胞增殖促进皮肤伤口的愈合.HB-EGF可通过促进人角膜上皮细胞的增殖与迁移,激活EGFR,促进角膜上皮细胞的创面愈合;可刺激视网膜中Müller神经胶质细胞去分化和增殖,促进视网膜的再生.HB-EGF是一种由缺氧诱导的神经保护蛋白,能刺激神经元前体细胞的增殖,具有神经营养功能.HB-EGF是Ⅱ型肺泡上皮细胞的有丝分裂原,可通过促进Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖并分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞,为肺泡结构重建提供基础;同时激活EGFR信号通路,促进细胞的增殖,抑制细胞凋亡,减轻肺部的炎症和损伤.HB-EGF可制肠上皮细胞凋亡、减少炎症因子浸润、促进肠细胞间黏附、促进肠细胞迁移与增殖,参与胃肠道上皮的损伤修复.HB-EGF是肝细胞的有丝分裂原,有肝细胞营养作用,促进肝细胞的增殖.

血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、表皮生长因子、干扰素等细胞生长因子是调控细胞增殖、分化和再生的重要内源性蛋白.以上述生长因子等为靶点开发的生物药物,在老年性黄斑变性、角膜损伤、神经营养性角膜炎等眼部疾病的治疗中发挥了重要作用,相应药物陆续上市.抗血管内皮生长因子类药物可以控制血管内皮的增生,减轻视网膜组织的水肿和渗出,已经成为老年性黄斑变性和糖尿病视网膜病的主要治疗手段.碱性成纤维细胞生长因子可促进角膜上皮细胞的增殖、分化和迁移,具有加速角膜损伤愈合,降低角膜炎症反应的作用,其中牛碱性成纤维细胞生长因子已用于角膜损伤临床治疗.神经生长因子能促进中枢和外周神经元的生长、发育和分化,加快神经损伤的修复,用于神经营养性角膜炎的治疗,可促进角膜完全愈合.临床上,表皮生长因子衍生物滴眼液可用于角膜上皮损伤的治疗,重组人干扰素可用于眼部病毒性感染疾病的治疗.本文就细胞因子类药物在眼科疾病治疗及新药开发的研究进展进行综述,为拓展细胞因子在眼科临床的应用提供参考.