质谱流式技术是近来年发明的一门新兴技术，它利用金属同位素标签替代荧光标签，并利用质谱对标签进行定量，通过结合质谱和流式细胞技术，可以同时对单细胞进行超多参数、无需补偿的测量，大大增强了评估复杂细胞系统和过程的能力，弥补了荧光流式的不足。其高通量、高灵敏度和高稳定性的特点尤其适合于免疫、肿瘤、血液、药物和遗传学等学科的研究中。

目的:探究螨虫诱导的变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）患者血浆细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）蛋白质组学的差异，寻找并鉴定AR潜在的生物标志物。方法:分别收集螨虫诱导的AR患者（AR组）和健康志愿者（HC组）的血液样本，每组各20例。使用超速离心法对AR组与HC组的血浆EV进行分离，并使用透射电子显微镜和纳米流式细胞术对EV进行鉴定和表征。使用液相色谱-串联质谱技术对分离出的EV进行蛋白质组学分析，寻找并鉴定差异表达蛋白质（differentially expression proteins，DEPs）。随后，对DEPs进行基因本体（gene ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析和蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析。结果:AR组和HC组的血浆EV大小在30~150 nm之间，两组之间无显著性差异。在两组之间共筛选出664种蛋白质，并鉴定出89种表达水平具有显著性差异的蛋白质（ P<0.05）。与HC组相比，AR组中有44种蛋白质表达显著上调，45种蛋白质表达显著下调。通过进行GO分析，发现这89种DEPs可能与免疫调节有关。此外，KEGG富集分析和PPI分析显示，这89种DEPs还与补体和凝血级联反应、雌激素和脂肪细胞因子信号通路等多种途径密切相关。 结论:本研究通过蛋白质组学技术成功筛选出与螨虫诱导AR相关的89种差异表达蛋白质。这些DEPs主要参与调节个体的免疫反应，其中脂联素、补体C1q亚基A和溶质载体家族2等蛋白质可能成为诊断AR的潜在生物标志物。

目的:探讨肿瘤细胞来源的细胞外囊泡装载阿霉素对人肝癌细胞PLC/PRF/5增殖及凋亡的影响。方法:以"直接共同孵育"合成装载阿霉素的细胞外囊泡，即载药囊泡，运用透射电镜观察形态，动态光散射仪测定粒径，蛋白免疫印迹技术鉴定CD 63、HSP 70及TSG 101的表达，液相-质谱联用仪计算载药率，体外药物释放实验模拟体内载药囊泡的药物缓释，采用PKH67染色观察细胞对载药囊泡的摄取，采用MTS实验和流式细胞术检测载药囊泡对人肝癌细胞PLC/PRF/5增殖及凋亡影响。结果:载药囊泡在透射电镜下呈大小不一的椭圆样双层膜结构；动态光散射仪观察直径为(115.9±5.2)nm；蛋白免疫印迹检测表达CD 63、HSP 70及TSG 101；载药囊泡包封率为0.77%；体外释放实验显示载药囊泡能缓慢释放药物；PKH67示踪实验显示16小时内肝癌细胞能够摄取载药囊泡；MTS实验结果显示，经载药囊泡处理72小时后，肝癌细胞PLC/PRF/5的活性为(54.9±3.2)%，显著低于阿霉素组的(77.7±5.4)%，差异有统计学意义( P<0.05)；细胞凋亡检测结果显示，载药囊泡组处理48小时后细胞凋亡率为(47.9±7.0)%，高于阿霉素组的(38.0±1.5)%，差异有统计学意义( P<0.05)。 结论:载药囊泡能够抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡。

目的:探究微小染色体维持蛋白5(MCM5)对胶质母细胞瘤的恶性进展促进作用及机制。方法:(1)收集中山大学孙逸仙纪念医院神经外科自2020年9月至2021年9月术中切除的3例非肿瘤患者脑组织与3例Ⅳ级胶质母细胞瘤组织进行质谱检测及蛋白质组学定量分析，筛选差异表达的蛋白并进行功能富集分析。(2)在蛋白质组学的基础上筛选出在胶质母细胞瘤中高表达的目标蛋白MCM5，利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库验证其在胶质母细胞瘤中表达情况，并在收集到的临床标本中进行mRNA水平的进一步验证。(3)通过siRNA转染将U251细胞分为阴性对照组、敲低组-1(si-1组)、敲低组-2(si-2组)，采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、EdU染色、Transwell实验及流式细胞术检测MCM5对胶质母细胞瘤恶性表型的调控作用。(4)利用TCGA数据库中胶质瘤患者的转录组数据，通过GSEA算法探究MCM5调控胶质母细胞瘤恶性进程可能的分子机制。结果:(1)在胶质母细胞瘤临床样本中筛选出表达上调的蛋白322种，表达下调的蛋白94种，其中MCM5在3份胶质母细胞瘤样本中均呈现为高表达。(2)基于TCGA数据库163例胶质母细胞瘤和207例非肿瘤脑组织的分析显示MCM5在胶质母细胞瘤中表达上调，差异有统计学意义( t=3.340， P=0.001)；针对临床收集的3份胶质母细胞瘤组织和3份非肿瘤脑组织的实时定量PCR(RT-qPCR)实验结果同样显示MCM5在胶质母细胞瘤中表达增高，差异有统计学意义( t=3.876， P<0.001)。(3)与阴性对照组比较，si-1组、si-2组细胞MCM5 mRNA及蛋白表达均显著下降，接种后第5天的增殖率显著降低，细胞克隆数量显著减少，EdU阳性细胞比例显著降低，G1期细胞比例显著上升，迁移能力明显受损，差异均有统计学意义( P<0.05)。(4)GSEA分析结果显示，MCM5高表达组mRNA在DNA损伤修复、E2F靶基因、MYC靶基因、上皮-间质转化(EMT)、白细胞介素6-Janus激酶-信号转导与转录活化因子3(IL6-JAK-STAT3)、干扰素、KRAS、NOTCH、转化生长因子-β(TGF-β)、Wnt/β-Catenin等特征基因集中富集。 结论:MCM5在胶质母细胞瘤中高表达，并通过包括E2F、MYC、EMT、Wnt/β-Catenin在内的多种机制调控其恶性进展。

单细胞蛋白组学分析能够对细胞异质性进行深层次研究，进一步推动精准医疗和肿瘤研究等领域发展。近年来，基于质谱的蛋白质组学取得重大进展，然而在单细胞水平进行蛋白质组学分析仍然面临着灵敏度挑战。目前液相色谱-串联质谱已成为蛋白质组学主要分析方法，由于其具有高灵敏度，高通量，高稳定性等特点，在单细胞领域得以广泛推广。近几年具有代表性的单细胞蛋白质组学方法，根据样品处理方式的不同，可以分为单管技术、微流控平台、集合处理平台三类。不同的数据采集和分析方法各有优劣。单细胞蛋白质组学目前还停留在实验室研究，若能早日在临床应用，必将推动精准医疗和肿瘤学研究进步发展。

目的:从免疫细胞角度分析骨巨细胞瘤的免疫微环境，明确骨巨细胞瘤微环境的免疫细胞组成，在单细胞水平探索地舒单抗治疗前后骨巨细胞瘤的免疫改变。方法:自2018年11月至2020年5月收治的初发骨巨细胞瘤及地舒单抗治疗后骨巨细胞瘤的手术病例中收取新鲜组织样本，送质谱流式细胞术分析，使用t-distributed stochastic neighbor embedding（TSNE）降维分析将质谱流式高维数据可视化并定量，比较地舒单抗治疗前后骨巨细胞瘤的免疫细胞组成。选取部分未经地舒单抗治疗及经过地舒单抗治疗的组织进行原代体外培养并获得培养上清液，用于分析上清液对各类细胞系生长的影响。结果:共15例初发骨巨细胞瘤及3例地舒单抗治疗后骨巨细胞瘤经质检合格后完成质谱流式及多色流式分析，其中男7例，女11例。骨巨细胞瘤富含T细胞及多种巨噬细胞样表型的髓系细胞，经地舒单抗治疗后巨噬细胞样表型髓系细胞比例大幅度降低而T细胞比例上升，且巨噬细胞样表型髓系细胞比例与地舒单抗治疗时间相关。骨巨细胞瘤中疑似多核破骨样巨细胞的免疫细胞亚型以γδTCR+为特征，且表达多种趋化因子受体。肿瘤中的CD8+T细胞绝大多数为活化的PD-1 hiTIM-3+CD69+的T细胞。未经地舒单抗治疗直接手术的骨巨细胞瘤组织体外培养上清液能促进多种细胞系增殖，而地舒单抗治疗后肿瘤组织上清液则无该功能。 结论:绘制骨巨细胞瘤的免疫细胞谱图，探索骨巨细胞瘤内免疫细胞对肿瘤生长的潜在作用，为无法切除病例长时间使用地舒单抗提供了部分理论依据。

目的:探索高糖诱导核糖核酸氧化增加对胰岛β细胞功能和活性的影响及分子机制。方法:体外培养大鼠胰岛β细胞瘤INS-1细胞，高糖干预后同位素稀释超高效液相串联质谱(ID LC MS/MS)评估核酸氧化。利用8-氧代鸟苷-5'-三磷酸酯(8-oxoGTP)体外模拟INS-1细胞RNA氧化增加，CCK-8评估细胞增殖，流式细胞术评估细胞凋亡，实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)评估胰岛素(INS)、胰-十二指肠同源盒1(PDX1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Casp3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶6(Casp6)基因信使RNA(mRNA)表达，全转录组测序分析RNA氧化影响INS-1细胞的分子机制。结果:高糖致INS-1细胞RNA氧化增加。RNA氧化增加抑制INS-1细胞增殖，降低INS和PDX1基因mRNA水平，促进凋亡相关casp3和casp6基因mRNA合成。全转录组测序分析发现，RNA氧化增加导致INS-1细胞内mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)和环状RNA(circRNA)差异表达，显著下调Mafa、Pdx1、Pax6和Mnx1转录因子，上调rno-miR-124-3p，rno-miR-133a-3p，rno-miR-3120，rno-miR-212-3p，rno-miR-7a-2-3p，促使相关lncRNAs差异表达，从而抑制胰岛素合成和分泌及β细胞增殖。结论:RNA氧化增加下调β细胞关键转录因子mRNAs水平，促使相关非编码RNA(ncRNA)特别是lncRNAs差异表达，影响β细胞胰岛素合成和分泌，抑制细胞增殖，是2型糖尿病(T2DM)β细胞功能障碍和活性降低的重要原因。

研究免疫介导的再生障碍性贫血（AA）模型小鼠体内巨噬细胞在不同器官的动态归巢过程、特征。通过磁珠分选出供鼠淋巴结中巨噬细胞并用PKH67荧光标记，参照AA模型制备方法造模后，分析小鼠血常规、骨髓活检及HE染色结果，验证造模效果。在造模的第4、8、12天，收集骨髓、脾脏和淋巴结单个核细胞，通过流式细胞术分析PKH67荧光标志供鼠巨噬细胞的动态变化。探究PKH67荧光标志的巨噬细胞，在AA模型小鼠发病过程中的动态变化，观测到供鼠巨噬细胞归巢到淋巴结并扩增分化，最终转运至骨髓和脾脏。通过蛋白组学质谱分析，初步揭示了巨噬细胞参与AA骨髓微环境激活后的相关免疫炎症反应通路，为病理性巨噬细胞参与AA模型小鼠的发病提供了依据。

目的:探讨新型还原响应纳米四价铂［NP@Pt（Ⅳ）］的抗卵巢癌作用。方法:合成还原响应的聚合物载体，与四价铂［Pt（Ⅳ）］组装形成NP@Pt（Ⅳ）。电感耦合等离子体质谱检测NP@Pt（Ⅳ）在还原环境下的铂释放情况，以及经顺铂、Pt（Ⅳ）和NP@Pt（Ⅳ）处理后卵巢癌ES2细胞中的铂含量。四甲基偶氮唑蓝和流式细胞术检测顺铂、Pt（Ⅳ）和NP@Pt（Ⅳ）对卵巢癌细胞增殖抑制能力的影响。收集2022年10—12月于中国医学科学院肿瘤医院手术治疗的原发性高级别浆液性卵巢癌患者的原发卵巢癌组织，采用动物活体成像观察花菁染料（Cy）7.5标记的NP@Pt（Ⅳ）在高级别浆液性卵巢癌人源性肿瘤异种移植（PDX）小鼠体内的生物分布。PDX小鼠尾静脉注射磷酸盐缓冲液（对照组）、顺铂（顺铂组）和NP@Pt（Ⅳ），测量各组小鼠的肿瘤体积和重量，采用HE染色、TUNEL荧光染色和Ki-67免疫组化染色检测肿瘤组织的坏死、凋亡和细胞增殖情况。测量各组小鼠的体重变化和主要器官的HE染色情况。结果:NP@Pt（Ⅳ）在还原环境中48 h后的铂释放量为76.29%，高于非还原环境中的26.82%（ P＜0.05）。经NP@Pt（Ⅳ）处理4、7 h后卵巢癌ES2细胞内铂含量（308.59和553.15 ng/百万细胞）高于Pt（Ⅳ）处理组（分别为100.21和180.31 ng/百万细胞）和顺铂处理组（分别为43.36和50.36 ng/百万细胞，均 P＜0.05）。NP@Pt（Ⅳ）对卵巢癌ES2、A2780、A2780DDP细胞的半抑制浓度分别为1.39、1.42、和4.62 μmol/L，低于Pt（Ⅳ）组（分别为2.89、7.27和16.74 μmol/L）和顺铂组（分别为5.21、11.85、和71.98 μmol/L）。经NP@Pt（Ⅳ）处理的ES2细胞凋亡率为（33.91±3.80）%，高于Pt（Ⅳ）和顺铂处理组［分别为（16.28±2.41）%和（15.01±1.17）%，均 P＜0.05］。Cy7.5@NP@Pt（Ⅳ）可靶向蓄积于PDX小鼠肿瘤组织。经NP@Pt（Ⅳ）治疗后的小鼠肿瘤体积［（130±98）mm 3］低于对照组［（1 349±161）mm 3］和顺铂组［（715±293）mm 3，均 P＜0.05］。NP@Pt（Ⅳ）组的小鼠瘤重［（0.17±0.09）g］低于对照组［（1.55±0.11）g］和顺铂组［（0.82±0.38）g，均 P＜0.05］。肿瘤组织染色结果显示，与顺铂组比较，NP@Pt（Ⅳ）治疗后的小鼠肿瘤组织有更明显的坏死和凋亡，Ki-67表达量减少。NP@Pt（Ⅳ）组的小鼠体重变化较对照组差异无统计学意义［分别为（18.56±2.04）g和（20.87±0.79）g， P＞0.05］。小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏主要脏器HE染色未见明显异常。 结论:NP@Pt（Ⅳ）可靶向蓄积于肿瘤组织，促进铂在卵巢癌细胞内的累积，具有较强的抗卵巢癌作用 。

目的:探讨Lnc-CYS1-1在脑胶质瘤恶性进展中的作用及其机制。方法:2020年10月至2021年2月浙江大学医学院附属邵逸夫医院神经外科收集11例脑胶质瘤患者的手术标本(胶质瘤组织和瘤旁组织)。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Lnc-CYS1-1在脑胶质瘤组织和细胞株(U251、A172、LN229、SNB19和U87)中的表达及在细胞核与细胞质中的分布。在U251细胞株中应用RNA荧光原位杂交确定Lnc-CYS1-1的空间表达信息。在U251和SNB19细胞株中，转染Lnc-CYS1-1 siRNA作为Lnc-CYS1-1 siRNA组，转染NC siRNA作为对照组；分别应用CCK-8增殖实验、流式细胞术和Transwell实验检测两组胶质瘤细胞的增殖活性、细胞周期、凋亡及侵袭力。采用RNA沉降实验及蛋白质谱分析鉴定筛选与Lnc-CYS1-1结合的差异蛋白，并由蛋白质免疫印迹法(WB)和免疫组织化学染色验证。采用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验验证Lnc-CYS1-1与原肌球蛋白3(TPM3)的相互作用。分析中国脑胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)数据库及临床标本中世界卫生组织(WHO)不同级别脑胶质瘤组织中TPM3的表达情况；对不同TPM3表达组脑胶质瘤患者进行生存分析。结果:在5例胶质瘤组织中，Lnc-CYS1-1的表达水平较相应瘤旁组织中升高( P<0.001)。5种胶质瘤细胞株中Lnc-CYS1-1的表达均较HEB正常胶质细胞上调( P<0.001)。U251细胞中，Lnc-CYS1-1主要分布于细胞质(70%)，细胞核中比例约为30%。U251和SNB19细胞中，qRT-PCR结果显示，Lnc-CYS1-1 siRNA组Lnc-CYS1-1的相对表达水平均较对照组下降(均 P<0.05)；CCK-8增殖实验结果显示，Lnc-CYS1-1 siRNA组的细胞存活率在48 h和72 h均较对照组下降(均 P<0.05)；流式细胞术检测结果显示，Lnc-CYS1-1 siRNA组的G 0/G 1比值和胶质瘤细胞凋亡率均较对照组升高(均 P<0.05)；Transwell实验结果显示，Lnc-CYS1-1 siRNA组通过基质凝胶侵袭的细胞数量均比对照组减少(均 P<0.05)。RNA沉降实验及蛋白质谱鉴定的结果显示，TPM3可能为Lnc-CYS1-1的作用靶点。RIP实验结果显示，与IgG组比较，TPM3免疫沉淀样品组的Lnc-CYS1-1表达水平升高( P<0.001)，Lnc-CYS1-1与TPM3存在相互作用关系。CGGA数据库分析及临床标本免疫组织化学染色验证结果显示，TPM3的表达水平随WHO级别升高而升高；TPM3高表达组(110例)较低表达组(110例)患者的中位生存期短( P<0.001)。 结论:Lnc-CYS1-1在脑胶质瘤组织及细胞中表达上调，敲低Lnc-CYS1-1可明显抑制胶质瘤的增殖、侵袭，诱导细胞凋亡。Lnc-CYS1-1可能通过TPM3在胶质瘤恶性进展中发挥作用。