细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是细胞主动分泌的具有磷脂双分子层结构的囊泡,天然携带母细胞来源的各种内容物,保留母细胞的生物学特征,可以反映其分泌时的母细胞状态.为了解EVs的生物发生及其在机体内的生物学功能,科学家们做了许多尝试,但直接检测EVs有一定的困难,目前的检测技术通常以EVs内容物作为检测对象,实现间接表征的目的.通过分析体液中的EVs,可以实现疾病诊断的目的,对EVs进行详细表征可以推动精准医学的发展.EVs属于内源性物质,可作为递送药物的载体,具有增加药效、降低药物毒理作用和辅助药物通过生物屏障的优势.目前,作为药物或者递送药物的载体应用尚存在的问题,包括(1)EVs内容物的表征,以便使用更明确定义的EVs;(2)开发适合的检测方法来监测体内的EVs,以确定和优化EVs的剂量、给药途径及潜在毒性;(3)确定EVs膜组成的种类及数量.EVs直径为纳米级别,内容物含量少,但临床应用价值大.应用中选择合适的分析技术将能够对EVs类型进行全面表征,并进一步推进对EVs生物学的理解,开发基于EVs的新型诊断和治疗方法,促进其临床转化.本综述介绍了 EVs研究中分析技术的原理、应用及优缺点,重点是EVs和EVs中蛋白质的表征检测技术.

目的:采用定量蛋白质组学技术分析高度近视患者房水中的蛋白质组谱。方法:纳入2019年1—8月在天津医科大学眼科医院于白内障手术中用1 ml注射器采集伴或不伴高度近视的年龄相关性白内障患者房水标本各34例34眼(每例100 μl)，分别作为高度近视白内障组和单纯白内障组。各组分别选取16例16眼房水标本，采用BCA法进行蛋白定量并比较，采用非标记液相色谱串联质谱分析得到2个组的差异表达蛋白。进一步将生物大数据用基因本体功能富集和京都基因与基因组百科全书通路富集分析差异表达蛋白的功能和信号转导通路。各组分别选取18例18眼房水标本采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行质谱检测结果的扩大样本量验证。结果:高度近视白内障组房水标本平均蛋白质量浓度为(1 134.91±104.78)ng/L，明显高于单纯白内障组的(706.71±85.43)ng/L，差异有统计学意义( t＝11.977， P<0.01)。2个组患者房水标本中共鉴定出463个可定量蛋白质，其中86个差异表达蛋白质，包括49个表达上调蛋白和37个表达下调蛋白。这些差异表达蛋白的分类主要包括蛋白结合活性调节因子、细胞外基质蛋白、载体蛋白、细胞间信号分子、蛋白质修饰酶等，分别占32.70%、14.50%、9.10%、9.10%和7.30%。生物信息学分析表明，86个差异表达蛋白主要富集在补体激活及其调节、急性炎症反应、细胞外基质组织重塑等生物学过程。其中21个差异表达蛋白富集于补体和凝血级联通路，15个差异表达蛋白富集于细胞外基质-受体相互作用通路，8个差异表达蛋白富集于PI3K-Akt信号通路。ELISA结果表明，随机选取的3个差异表达蛋白在2个组之间表达变化趋势均与非标记定量蛋白质组学分析结果一致。 结论:高度近视白内障与单纯白内障之间房水蛋白质表达谱有显著变化，高度近视与炎症和免疫相互作用以及细胞外基质的重塑密切相关。

高分子微球作为药物载体已被广泛应用于口服递药系统中，其可实现保护药物稳定性、缓释药物、增强免疫及提高药物吸收等目的。制备微球所使用的高分子材料可来源于天然物质，如纤维素、多糖以及蛋白质等；也可来源于合成高分子物质，如聚己内酯、聚乳酸等。对微球在口服递药中的作用以及口服微球种类进行综述，为口服微球的深入研究及开发提供参考。

目的:评价长链非编码RNA-肺癌转移相关转录本1/微小RNA-145/Bcl-2和腺病毒E1B19k Da相互作用蛋白3(Lnc-MALAT1/miRNA-145/BNIP3)信号通路在舒芬太尼预处理对大鼠心肌保护效应中的作用。方法:大鼠H9C2细胞以1×10 6个/ml密度接种于6孔培养板或培养瓶，采用随机数字表法分为5组( n＝30)：对照组(C组)、缺氧复氧组(H/R组)、舒芬太尼预处理组(S组)、真核细胞表达载体pcDNA3.0组(pcDNA组)和pcDNA-MALAT1组(MALAT1组)。S组用10 μmol/L舒芬太尼孵育2 h，随后制备缺氧复氧损伤模型；pcDNA组和MALAT1组分别用pcDNA3.0及pcDNA-MALAT1转染，转染后24 h用10 μmol/L舒芬太尼孵育2 h，随后制备缺氧复氧损伤模型。于复氧后2 h时，采用Real-time PCR法检测Lnc-MALAT1、miRNA-145及BNIP3 mRNA的表达水平；采用CCK-8法检测细胞存活率；采用流式细胞仪检测细胞凋亡率；分别采用硫代巴比妥酸显色法、羟胺法和微板法检测细胞MDA、SOD水平及LDH漏出量；采用Western blot法检测Bcl-2、Bax及cleaved-caspase-3表达水平。 结果:与C组比较，其余4组细胞存活率降低，凋亡率升高，MDA水平及LDH漏出量升高，SOD水平降低，LncRNA-MALAT1、BNIP3 mRNA、Bax和cleaved-caspase-3表达上调，miRNA-145和Bcl-2表达下调( P<0.05)；与H/R组比较，S组和pcDNA组细胞存活率升高，凋亡率降低，MDA水平及LDH漏出量降低，SOD水平升高，LncRNA-MALAT1、BNIP3 mRNA、Bax和cleaved-caspase-3表达下调，miRNA-145和Bcl-2表达上调( P<0.05)；与S组比较，MALAT1组细胞存活率降低，凋亡率升高，MDA水平及LDH漏出量升高，SOD水平降低，LncRNA-MALAT1、BNIP3 mRNA、Bax和cleaved-caspase-3表达上调，miRNA-145和Bcl-2表达下调( P<0.05)。 结论:舒芬太尼预处理对大鼠心肌保护效应的机制与抑制Lnc-MALAT1/miRNA-145/BNIP3信号通路有关。

目的:探究shRNA-高迁移率族蛋白N2(HMGN2)慢病毒载体对肾癌细胞侵袭能力和凋亡水平的影响，并研究其作用机制。方法:选择2017年1月至2018年12月天津市第四中心医院收治的31例肾细胞癌患者，术中收集患者的肿瘤组织和瘤旁组织。利用免疫组织化学染色，采用RT-qPCR和Western blot等方法检测shRNA-HMGN2的表达以及凋亡分子标志物Caspase-3和Caspase-9的表达，利用shRNA干扰技术构建shRNA-HMGN2慢病毒载体，利用人肾癌细胞系ACHN和A498细胞作为体外实验的对象，根据有无转染shRNA-HMGN2质粒，将细胞分成三组，即A组细胞未做任何处理，B组细胞经空白载体慢病毒转染，C组细胞经shRNA-HMGN2载体构建的慢病毒转染。Transwell试剂盒检测三组细胞的侵袭能力和凋亡水平。结果:肿瘤组织的HMGN2蛋白的表达量要明显高于瘤旁组织( P<0.05)。在人肾癌细胞系ACHN细胞和A498细胞中，C组的细胞侵袭能力要低于A组和B组( P<0.05)，C组的细胞凋亡水平要高于A组和B组( P<0.05)。另外，人肾癌ACHN细胞和A498细胞中，C组HMGN2的mRNA相对表达量和蛋白表达量要低于A组和B组( P<0.05)，而C组Caspase-9和Caspase-3的mRNA相对表达量和蛋白表达量要高于A组和B组( P<0.05)。 结论:shRNA-HMGN2慢病毒载体可以抑制肾细胞癌的侵袭，促进肾细胞癌的凋亡，可以作为潜在的治疗靶点。

目的:探讨水通道蛋白3（AQP3）在皮肤光老化过程中的作用及机制。方法:将正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）分为NHDF组（未转染）、AQP3 cDNA组（转染AQP3 cDNA）、AQP3 siRNA组（转染AQP3 siRNA）、核内不均一核糖核蛋白Q（hnRNPQ）cDNA组（转染hnRNPQ cDNA）、hnRNPQ siRNA组（转染hnRNPQ siRNA）、AQP3-hnRNPQ cDNA组（转染AQP3 cDNA和hnRNPQ cDNA）、AQP3-hnRNPQ siRNA组（转染AQP3和hnRNPQ siRNA）、cDNA空载体组（转染cDNA空载体）、siRNA空载体组（转染siRNA空载体）。用长波紫外线（UVA，10 J·cm -2·d -1）连续照射已经转染或未转染的NHDF 3 d来建立细胞衰老模型，同时以未接受UVA照射的NHDF作为对照。用细胞计数法评估各实验组细胞增殖活性，衰老相关-β半乳糖苷酶染色试剂盒对各实验组进行染色来评估HDF的衰老水平，用荧光素酶报告基因技术检测p53转录调控活性，用Western印迹分析NHDF中AQP3、hnRNPQ及衰老相关蛋白p53、p21的表达水平。两组间比较采用独立样本 t检验，多组间比较采用ANOVA检验。 结果:用UVA连续照射各组NHDF 3 d后，NHDF中p53、p21的表达水平和β半乳糖苷酶阳性细胞百分率明显高于未照射的对照组（ P<0.05），但是AQP3的表达水平和照射后第5、6、7天细胞增殖活性明显低于对照组（ P<0.05）。在接受UVA连续照射3 d后，AQP3 siRNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型较siRNA空载体组明显加重，两组间p53、p21、hnRNPQ的表达水平和β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性、细胞增殖活性差异均有统计学意义（均 P<0.05），进一步沉默hnRNPQ能够逆转上述反应。与siRNA空载体组相比，hnRNPQ siRNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显减轻，两组间p53、p21表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性差异均有统计学意义（均 P<0.05）。在接受UVA连续照射3 d后，cDNA空载体组中p53、p21、hnRNPQ的表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性分别为0.56 ± 0.08、0.70 ± 0.07、0.92 ± 0.03、（81.53 ± 7.62）%、7.16 ± 0.25、（2.15 ± 0.23）× 10 6/ml，而AQP3 cDNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显轻于cDNA空载体组，其上述指标分别为0.25 ± 0.06、0.23 ± 0.06、0.82 ± 0.09、（31.23 ± 6.54）%、2.52 ± 0.36、（2.93 ± 0.33）× 10 6/ml，两组比较，差异均有统计学意义（均 P<0.05），进一步过表达hnRNPQ能够逆转上述效应。在接受UVA连续照射3 d后，hnRNPQ cDNA组中p53、p21的表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性分别为1.41 ± 0.09、1.42 ± 0.06、（91.06 ± 4.24）%、12.35 ± 0.88、（1.23 ± 0.41）× 10 6/ml，与cDNA空载体组相比，hnRNPQ cDNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显加重，两组比较，上述指标差异均有统计学意义（均 P<0.05）。 结论:AQP3可能通过调控hnRNPQ下调p53的表达来减缓UVA诱导的NHDF衰老。

目的:评价hsa_circ_0025853在人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)氧糖剥夺/复糖复氧损伤(OGD/R)中的作用。方法:传代培养SK-N-SH细胞至对数生长期，采用随机数字表法分为4组( n＝40)：对照组(C组)、OGD/R组、hsa_circ_0025853过表达组(E组)和hsa_circ_0025853过表达阴性对照组(EV组)。C组细胞在37 ℃、5%CO 2正常条件下培养，OGD/R组细胞铺于6孔板或96孔板待完全贴壁后氧糖剥夺16 h后复糖复氧。E组和EV组分别转染hsa_circ_0025853过表达载体或hsa_circ_0025853过表达阴性对照载体后制备OGD/R模型。于复糖复氧4和12 h时，采用qPCR法检测hsa_circ_0025853、线粒体动力相关蛋白1(Drp1)mRNA表达水平；Western blot法检测Drp1表达水平，CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果:与C组比较，OGD/R组复糖复氧后细胞活力降低，细胞凋亡率升高，Drp1及其mRNA表达上调，hsa_circ_0025853表达下调( P<0.05)；与OGD/R组或EV组比较，E组复糖复氧后细胞活力升高，细胞凋亡率降低，Drp1表达下调，hsa_circ_0025853表达上调( P<0.05)，Drp1 mRNA表达差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:hsa_circ_0025853表达下调可促进Drp1表达上调，诱发细胞凋亡，参与SK-N-SH细胞OGD/R的发生机制。

目的:评价hsa_circ_0008039和miR-484在人神经母细胞瘤(SK-N-SH)细胞氧糖剥夺-复糖复氧(OGD/R)损伤中的作用及其与线粒体分裂蛋白1(Fis1)的关系。方法:体外培养SK-N-SH细胞至对数生长期，采用随机数字表法分为5组( n＝25)：对照组(C组)、OGD/R组、hsa_circ_0008039 siRNA组(S组)、hsa_circ_0008039过表达组(E组)和hsa_circ_0008039 siRNA+miR-484抑制剂组(S+I组)。C组细胞在正常条件下培养；S组、E组和S+I组分别转染has_circ_0008039 siRNA、has_circ_0008039过表达载体、has_circ_0008039 siRNA和miR-484抑制剂后，氧糖剥夺12 h复糖复氧24 h制备OGD/R损伤模型。于复糖复氧24 h时采用CCK-8法检测细胞活力和LDH漏出量，采用RT-qPCR法检测hsa_circ_0008039、miR-484和Fis1 mRNA的表达，Western blot法检测Fis1表达；双荧光素酶报告验证hsa_circ_0008039与miR-484的靶向关系。 结果:与C组比较，其余4组细胞活力降低，LDH漏出量增加，OGD/R组和E组hsa_circ_0008039和Fis1表达上调，miR-484表达下调，S组hsa_circ_0008039和Fis1表达下调，miR-484表达上调，S+I组hsa_circ_0008039和miR-484表达下调，Fis1表达上调( P<0.05)；与OGD/R组比较，E组和S+I组细胞活力降低，LDH漏出量增加，S组细胞活力升高，LDH漏出量减少，E组hsa_circ_0008039和Fis1表达上调，miR-484表达下调，S组hsa_circ_0008039和Fis1表达下调，miR-484表达上调，S+I组hsa_circ_0008039和miR-484表达下调，Fis1表达上调( P<0.05)；与S组比较，S+I组细胞活力降低，LDH漏出量增加，miR-484表达下调，Fis1表达上调( P<0.01)。双荧光素酶报告实验表明：has_circ_0008039靶向结合miR-484。 结论:hsa_circ_0008039靶向结合miR-484参与了SK-N-SH细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤的过程，与上调Fis1表达有关。

目的:探讨腺苷酸环化酶（ADCY）2/4/5/8在皮肤恶性黑色素瘤中的表达、作用及功能机制，验证ADCY2/4/5/8对黑色素瘤细胞A375增殖和迁移的影响。方法:通过基因表达谱分析（GEPIA）和人类蛋白质图谱（HPA）数据库分析ADCY2/4/5/8 mRNA和蛋白的表达以及基因表达与预后的关联，UALCAN、DeMth和cBioPortal数据库分析ADCY2/4/5/8基因甲基化和突变状态，DAVID和STRING数据库对ADCY2/4/5/8基因进行基因富集分析和通路分析。qPCR检测黑色素瘤A375细胞及色素痣FF细胞中ADCY2/4/5/8 mRNA的相对表达。将A375细胞分为实验组和对照组分别转染ADCY2/4/5/8过表达质粒和对照空载体，采用CCK8和Transwell实验检测过表达ADCY2/4/5/8对A375细胞增殖和迁移的影响，qPCR检测过表达ADCY2/4/5/8基因对A375细胞增殖、迁移相关基因mRNA相对表达的影响，Western印迹法检测过表达ADCY2/4/5/8基因对A375细胞环磷酸腺苷（cAMP）信号通路的影响。组间比较采用单因素方差分析和重复测量方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:GEPIA数据库分析显示，558例正常组织中，ADCY2、ADCY4、ADCY5和ADCY8 mRNA在黑色素瘤组织（ n = 461）中表达下调（ P < 0.01）。对GEPIA数据库中黑色素瘤ADCY2/4/5/8 mRNA的表达分层分析显示，ADCY2 mRNA（ P = 0.015）和ADCY8 mRNA（ P = 0.038）的表达与肿瘤分期相关，表达越低，分期越晚。HPA数据库30例黑色素瘤临床样本和正常组织中，ADCY2/4/5/8蛋白在黑色素瘤组织较正常组织表达降低（ P < 0.001）。UALCAN和DeMth数据库分析显示，与正常组织相比，ADCY2/4/5/8在黑色素瘤组织和转移性黑色素瘤组织中甲基化水平升高（ P < 0.001）。DAVID、STRING分析示，ADCY2/4/5/8基因可能通过激活cAMP信号通路抑制细胞增殖和迁移。qPCR检测显示，A375细胞中ADCY2/4/5/8 mRNA的相对表达均低于FF细胞。CCK8实验显示，培养48、72 h时，过表达ADCY2/4/5/8实验组A375细胞存活率均低于对照组（均 P < 0.05）。Transwell实验显示，过表达ADCY2/4/5/8实验组A375细胞迁移数均低于对照组（均 P < 0.01）。qPCR结果显示，过表达ADCY2/4/5/8实验组A375细胞上皮钙黏蛋白mRNA相对表达高于对照组，Ki67、波形蛋白、神经钙黏蛋白和基质金属蛋白酶2 mRNA相对表达低于对照组（均 P < 0.001）。Western印迹实验显示，过表达ADCY2/4/5/8实验组A375细胞cAMP和磷酸化蛋白激酶A（p-PKA）表达高于对照组（ P < 0.001），实验组与对照组细胞PKA蛋白表达水平差异无统计学意义（ P > 0.05）。 结论:ADCY2/4/5/8在黑色素瘤组织中低表达，过表达时可抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移，可能作为潜在的抑癌基因参与黑色素瘤的进展。

目的:探讨miRNA-186-3p（miR-186-3p）对子宫颈癌CaSki细胞凋亡、迁移、侵袭的影响及与转化生长因子β（TGF-β）-Smad信号通路的关系。方法:将载有miR-186-3p抑制基因、miR-186-3p模拟物的质粒分别转染至子宫颈癌CaSki细胞，分别为miR-186-3p-I组、miR-186-3p-M组；另将转染空载质粒的CaSki细胞作为对照，为miR-186-3p-C组。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率，采用Transwell法检测各组细胞迁移和侵袭能力；采用蛋白质印迹法检测各组细胞TGF-β-Smad信号通路相关蛋白表达水平；采用Starbase软件预测miR-186-3p靶基因，并用双荧光素酶报告基因实验进行验证。结果:miR-186-3p-M组细胞凋亡率均低于miR-186-3p-I组和miR-186-3p-C组[（7.5±3.2）%比（13.9±0.7）%、（12.7±0.6）%，均 P<0.05]。miR-186-3p-M组迁移细胞数[（218±25）个比（168±13）个、（175±13）个，均 P<0.001]和侵袭细胞数均多于miR-186-3p-I组和miR-186-3p-C组[（165±21）个比（130±11）个、（142±12）个，均 P<0.001]。miR-186-3p-M组TGF-β、Smad2、Smad3、磷酸化Smad2（p-Smad2）、磷酸化Smad3（p-Smad3）蛋白相对表达量均最低，与另两组比较，差异均有统计学意义（均 P<0.001）。采用Starbase软件预测miR-186-3p与XIST RNA互补结合；双荧光素酶报告基因实验显示，XIST野生型载体+miR-186-3p模拟物质粒共转染的细胞相对荧光素酶活性低于XIST野生型载体+miR-186-3p空载质粒共转染的细胞（ P<0.001）。 结论:miR-186-3p可能直接与XIST RNA结合而下调TGF-β-Smad信号通路活性，进而增强子宫颈癌CaSki细胞凋亡、迁移、侵袭活性。