目的:探讨淫羊藿素调控miRNA-329（miR-329）、miRNA-1236（miR-1236）抑制肝癌细胞增殖的分子机制。方法:采用2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L淫羊藿素处理肝癌细胞株HepG2，对照组仅加入二甲基亚砜（DMSO），培养36 h后采用CCK-8法检测淫羊藿素对HepG2细胞的半数抑制浓度（ IC50）及细胞增殖率。使用400 μg/L甲胎蛋白（AFP）处理HepG2细胞0、12、24、36、48、60 h后，CCK-8法检测AFP对HepG2细胞增殖的影响。构建AFP-3'UTR荧光素酶报告质粒pmirGLO-AFP-3'UTR质粒，将pmirGLO空白载体质粒、pmirGLO-AFP-3'UTR质粒及miR-329或miR-1236的模拟物或抑制剂、相应的模拟物的对照质粒（NC）、相应的抑制剂的对照质粒（INC）分别共转染HepG2细胞，培养24 h后双荧光素酶报告基因检测miR-329和miR-1236对荧光素酶活性的影响。蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分别检测淫羊藿素对HepG2细胞AFP、miR-329和miR-1236表达的影响。使用miR-329、miR-1236的模拟物和抑制剂分别转染HepG2细胞，检测miR-329、miR-1236对AFP水平的影响。 结果:2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L淫羊藿素组和对照组细胞增殖率分别为（80.4±2.3）%、（73.2±1.6）%、（51.7±3.3）%、（38.2±4.6）%、（29.5±4.3）%和（94.0±2.9）%，差异有统计学意义（ F＝75.65， P<0.01）；不同浓度淫羊藿素组HepG2细胞增殖率分别与对照组比较，差异均有统计学意义（均 P<0.01）。淫羊藿素对HepG2细胞的 IC50为10 μmol/L。2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L淫羊藿素组和对照组AFP mRNA的相对表达量分别为0.83±0.06、0.69±0.02、0.53±0.07、0.45±0.01、0.33±0.07和1.00±0.01，差异有统计学意义（ F＝42.67， P<0.01）；不同浓度淫羊藿素组AFP mRNA的相对表达量分别与对照组比较，差异均有统计学意义（均 P<0.01）。400 μg/L AFP作用HepG2细胞0、12、24、36、48、60 h，细胞增殖率分别为（102±5）%、（138±13）%、（186±24）%、（260±12）%、（311±15）%、（348±25）%，差异有统计学意义（ F＝27.483， P<0.01）；AFP作用不同时间分别与0 h细胞增殖率比较，差异均有统计学意义（均 P<0.01）。与对照组比较，不同浓度淫羊藿素均能够促进miR-329和miR-1236表达（均 P<0.01）。miR-329和miR-1236模拟物与AFP-3'UTR共转染后，荧光素酶活性均降低了约40%；miR-329、miR-1236抑制剂与AFP-3'UTR共转染后，荧光素酶活性均增加约1.5倍。miR-329和miR-1236均可降低AFP蛋白和mRNA的表达水平（均 P<0.05）。 结论:淫羊藿素体外通过增加miR-329和miR-1236表达，促进miR-329、miR-1236与AFP-3'UTR的结合，抑制AFP mRNA的稳定性和翻译活性，抑制AFP表达，从而抑制肝癌细胞增殖。

目的:探讨miRNA-186-3p（miR-186-3p）对子宫颈癌CaSki细胞凋亡、迁移、侵袭的影响及与转化生长因子β（TGF-β）-Smad信号通路的关系。方法:将载有miR-186-3p抑制基因、miR-186-3p模拟物的质粒分别转染至子宫颈癌CaSki细胞，分别为miR-186-3p-I组、miR-186-3p-M组；另将转染空载质粒的CaSki细胞作为对照，为miR-186-3p-C组。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率，采用Transwell法检测各组细胞迁移和侵袭能力；采用蛋白质印迹法检测各组细胞TGF-β-Smad信号通路相关蛋白表达水平；采用Starbase软件预测miR-186-3p靶基因，并用双荧光素酶报告基因实验进行验证。结果:miR-186-3p-M组细胞凋亡率均低于miR-186-3p-I组和miR-186-3p-C组[（7.5±3.2）%比（13.9±0.7）%、（12.7±0.6）%，均 P<0.05]。miR-186-3p-M组迁移细胞数[（218±25）个比（168±13）个、（175±13）个，均 P<0.001]和侵袭细胞数均多于miR-186-3p-I组和miR-186-3p-C组[（165±21）个比（130±11）个、（142±12）个，均 P<0.001]。miR-186-3p-M组TGF-β、Smad2、Smad3、磷酸化Smad2（p-Smad2）、磷酸化Smad3（p-Smad3）蛋白相对表达量均最低，与另两组比较，差异均有统计学意义（均 P<0.001）。采用Starbase软件预测miR-186-3p与XIST RNA互补结合；双荧光素酶报告基因实验显示，XIST野生型载体+miR-186-3p模拟物质粒共转染的细胞相对荧光素酶活性低于XIST野生型载体+miR-186-3p空载质粒共转染的细胞（ P<0.001）。 结论:miR-186-3p可能直接与XIST RNA结合而下调TGF-β-Smad信号通路活性，进而增强子宫颈癌CaSki细胞凋亡、迁移、侵袭活性。

目的:分析静止和循环张应力条件下大鼠髁突软骨细胞（mandibular condylar chondrocytes，MCC）外泌体显著差异微RNA（microRNA，miRNA）的表达谱并探究张应力调节髁突软骨内成骨的作用机制。方法:分别选择5只2周龄雄性SD大鼠（共10只）在静止和循环张应力条件下培养大鼠MCC，提取细胞外泌体，两组外泌体分别命名为对照组和实验组。采用透射电子显微镜、纳米流式检测仪、纳米颗粒追踪分析等方法观察并鉴定，通过高通量测序筛选表达显著差异的miRNA，采用TargetScan、miRanda网站进行生物信息学分析及成骨相关靶基因预测。结果:实验组大鼠MCC外泌体均呈“双凹圆盘状”单层膜结构，CD9、CD81表达阳性，粒径分布符合外泌体特征，与对照组大鼠MCC外泌体一致。高通量测序筛选表达显著差异的miRNA共85个（ P<0.05）。差异miRNA主要参与的生物学过程与分子功能分别为生物学过程和蛋白质结合；京都基因与基因组数据库通路富集分析显示在哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路有显著富集（ P<0.05）。其中miR-199a-5p的候选靶基因有骨形态发生蛋白3（bone morphogenetic protein 3，BMP3）、内皮素转换酶-1，miR-186-5p可靶向Smad8、BMP3，以发挥成骨相关功能。 结论:相比于静止状态，CTS刺激能改变大鼠MCC外泌体中miR-199a-5p、miR-186-5p等miRNA的表达量，可考虑作为调节外泌体应用潜能的一种手段。

目的:探讨微小核糖核酸(miR)-145、miR-186表达与非小细胞肺癌(NSCLC)临床病理特征和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的关系.方法:选择2020年3月至2023年3月我院收治的128例行肺癌根治手术治疗的NSCLC患者,取其术中癌组织和癌旁组织(距离癌组织5 cm以上),采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测 miR-145、miR-186 以及 PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA 表达.分析 miR-145、miR-186 表达与 NSCLC 患者临床病理特征的关系;Pearson检验分析NSCLC患者癌组织miR-145、miR-186表达与PI3K mRNA、Akt mRNA、mTORmRNA表达的相关性.结果:癌组织miR-145、miR-186表达低于癌旁组织(P＜0.05),低分化、TNM ⅢA期、淋巴结转移的NSCLC组织miR-145、miR-186表达低于中高分化、TNM Ⅰ～Ⅱ期、未发生淋巴结转移的NSCLC组织(P＜0.05).癌组织PI3KmRNA、Akt mRNA、mTORmRNA 表达均高于癌旁组织(P＜0.05),癌组织 miR-145、miR-186 表达与 PI3K mRNA、Akt mRNA、mTORmRNA表达均呈负相关(P＜0.05).结论:NSCLC组织中miR-145、miR-186表达下调,miR-145、miR-186表达下调可能激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促使NSCLC进展,且与NSCLC患者癌组织低分化、TNM ⅢA期、淋巴结转移有关.

目的:通过研究甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)患者和健康人的血清外泌体miRNA在不同碘水平下的表达谱差异,探寻不受高碘影响可稳定诊断PTC的生物标志物.方法:收集PTC患者和健康人的血清样本,采用砷铈催化分光光度法测定血清碘,分别纳入高碘、正常碘的PTC患者各10例,高碘、正常碘的健康人各5例作为研究对象.然后从血清中抽提外泌体,从中提取miRNA并进行高通量测序,进一步做基因本体论(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclope-dia of genes and genomes,KEGG)通路分析.结果:分别筛选高碘、正常碘组中PTC患者与健康人的差异表达miRNA,再取交集得到12个共同差异表达miRNA,显著富集到6个PTC相关通路.结论:与健康人对比,PTC 患者中下调的 miR-3158-3p、miR-186-5p,上调的 miR-122-5p、miR-375-3p、miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-148a-3p、miR-223-5p、let-7d-3p、miR-651-5p,这 10 个 miRNA 可以作为在一般人群中区别PTC患者和健康人的稳定潜在生物标志物.

背景 胆管癌(CCA)起源于胆管上皮细胞,起病隐匿,恶性度极高.循环血中微小RNA (miRNA)在CCA诊断中的价值尚待研究.目的 探讨血浆miR-92a-3p、miR-204-5 p、miR-186-5p诊断CCA的价值,以期提高CCA的诊断水平.方法 选取2015年5月-2016年1月河北医科大学第二医院符合纳入标准的CCA患者16例为病例组.同期选取本院无肝胆疾病患者15例为对照组.制备两组患者血浆标本,采用RT-qPCR法检测血浆miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p表达水平.采用二元Logistic回归分析计算miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p联合的Logistic回归方程;绘制miR-92a-3p、miR-204-5 p、miR-186-5p及其联合诊断CCA的受试者工作特征曲线(ROC曲线),计算ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度、约登指数.结果 病例组miR-92a-3p表达水平高于对照组,miR-204-5p、miR-186-5p表达水平低于对照组(P＜0.05).miR-92a-3p、miR-204-5 p、miR-186-5p诊断CCA的AUC分别为0.708[95％ CI (0.524,0.892)]、0.725[95％ CI (0.535,0.915)]、0.750 [95％ CI (0.576,0.924)],截断值分别为0.130 8、0.008 5、0.005 2,灵敏度分别为0.938、0.563、0.563,特异度分别为0.467、0.933、0.933,约登指数分别为0.405、0.496、0.496.二元Logistic回归分析结果显示,Logit (P)=-0.031 +9.167 × miR-92a-3p-49.453 ×miR-186-5p-66.771×miR-204-5p,其诊断CCA的AUC为0.879[95％CI (0.749,1.010)],截断值为0.095 8,灵敏度、特异度、约登指数分别为0.938、0.800、0.738.miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p联合诊断CCA的AUC大于miR-92a-3p、miR-204-5 p、miR-186-5p单独诊断CCA的AUC (P＜0.05).结论 miR-92a-3p、miR-204-5p、miR-186-5p可以用于CCA的诊断,且其联合诊断CCA的价值更高.

目的 探索经阴道彩色多普勒超声(TVCDS)联合miRNA-18a、miRNA-92a检测诊断宫颈癌的价值.方法 选择本院妇产科3年来收治的宫颈癌患者186例(CC组)、宫颈上皮瘤变患者182例(CIN组),子宫良性病变患者182例(正常组).以是否患有宫颈癌为因变量,采用logistic回归分析影响宫颈癌患病的影响因素;以术后病理检查结果作为金标准探索TVCDS、miRNA-18a、miRNA-92a诊断宫颈癌的价值.结果 宫颈癌发病的危险因素包括HPV感染、TVCDS宫颈异常表现、miRNA-18a表达水平偏高和miRNA-92a表达水平偏高(P＜0.05);TVCDS诊断宫颈癌的敏感度为75.81％,特异度为47.80％.miRNA-18a诊断宫颈癌AUC为0.751,miRNA-92a的AUC为0.748.TVCDS联合miRNA-18a、miRNA-92a诊断宫颈癌的AUC为0.802,敏感性为60.75％,特异性为88.46％.联合诊断的拟合方程为:logit(P)=-3.351+1.147×miRNA-18a+0.018×miRNA-92a+0.868×TVCDS.结论 TVCDS联合血清miRNA-18a、miRNA-92a检测可以较好地诊断宫颈癌,为宫颈癌早期无创诊断提供一个新的方向.

目的 探讨miRNA-186-5p在乳腺癌细胞阿霉素耐药性逆转作用中的分子机制.方法 采用阿霉素诱导人乳腺癌细胞系MCF-7,建立阿霉素耐药性细胞株,命名为MCF-7/ADR;采用双荧光素酶实验检测miR-186-5p与RAB2A的靶向结合情况;采用qRT-PCR和Western blot分别检测细胞中miR-186-5p、RAB2A mRNA的表达及RAB2A蛋白的表达情况;特异性上调MCF-7/ADR中的miR-186-5p,下调MCF-7中的miR-186-5p后,采用CCK-8和Western blot分别检测乳腺癌细胞增殖情况以及RAB2A蛋白的表达;采用Western blot和CCK-8分别检测共转染后,细胞增殖情况的变化及PI3K/Akt信号通路的激活情况.结果 双荧光素酶实验结果显示,RAB2A是miR-186-5p的直接靶点;qRT-PCR结果显示,在MCF-7/ADR细胞中miR-186-5p mRNA表达明显下调,而RAB2A mRNA表达没有明显变化,RAB2A的蛋白表达明显上调.特异性上调MCF-7/ADR中的miR-186-5p,其增殖能力明显下降,RAB2A蛋白的表达明显下调;下调MCF-7中的miR-186-5p,其增殖能力明显增加,RAB2A蛋白的表达明显上调.Western blot和CCK-8结果显示,过表达miR-186-5p使PI3K/Akt信号通路表达明显减弱,且上调RAB2A逆转了上调miR-186-5p所致的增殖能力的减弱.结论 miR-186-5p通过靶向调控RAB2A,经PI3K/Akt信号通路调控乳腺癌细胞的阿霉素耐药和增殖.

探讨miR?126和胰岛素样生长因子1受体( IGF?1R)在胃癌组织和细胞中的表达及其作用机制.方法 选取2011年1月至2013年1月就诊于山东省立第三医院、行胃癌根治手术治疗的60例胃癌患者的组织标本,以及永生化的非肿瘤细胞GES?1、胃癌细胞株MKN28、BGC823、MKN45和SGC7901,采用逆转录聚合酶链反应( RT?PCR)和Western blot检测60例胃癌及癌旁组织中miR?126和IGF?1R的表达,分析患者的临床病理特征和预后.采用CCK?8法、软琼脂集落形成实验、Transwell小室实验和双荧光素酶报告实验等检测胃癌细胞的增殖和侵袭能力以及miR?126的直接靶点.结果 胃癌组织中miR?126的表达与患者的分化程度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期均有关(均P＜0.05).与癌旁组织(10.12±2.15)比较,胃癌组织中miR?126的表达水平降低( 2.01± 0.23,P＜0.05). Cox多因素分析显示,淋巴结转移、TNM分期、miR?126和IGF?1R的表达与胃癌患者的预后均有关(均P＜0.05). CCK?8结果显示,miR?126模拟物转染MKN28和BGC823细胞72 h后,吸光度(A)值分别为1.06±0.05和1.01±0.09,与miRNA对照组(分别为1.55±0.12和1.36±0.12)比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).软琼脂集落形成实验显示,miR?126模拟物转染组MKN28和BGC823细胞的集落数分别为(33±9)个和(29±8)个,与miRNA对照组[分别为( 76± 13)个和( 71± 11)个]比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05). Transwell小室实验结果显示,miR?126模拟物转染组MKN28和BGC823细胞的穿膜数为(98±12)个和(89±8)个,与miRNA对照组[分别为(154±18)个和(161±17)个]比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).双荧光素酶实验明确miR?126靶定IGF?1R的3′?UTR抑制了IGF?1R蛋白的表达. CCK?8检测显示,IGF?1R过表达部分逆转了miR?126模拟物抑制的MKN28细胞增殖能力(A值分别为1.65±0.14和0.98±0.11,P＝0.003);IGF?1R过表达部分逆转了miR?126模拟物抑制的BGC823细胞增殖能力(A值分别为1.44±0.15和0.89±0.10,P＝0.006).IGF?1R过表达逆转了miR?126模拟物抑制的MKN28细胞侵袭能力[细胞穿膜数分别为(176±19)个和(101± 14)个,P＝0.005];IGF?1R过表达也逆转了miR?126模拟物抑制的BGC823细胞侵袭能力[细胞穿膜数分别为(186±21)个和(92±9)个,P＝0.002]. miR?126模拟物抑制的MKN28细胞增殖被si?IGF?1R进一步抑制(A值分别为0.67±0.09和0.99±0.12,P＝0.021);miR?126模拟物抑制的BGC823细胞增殖被si?IGF?1R进一步抑制(A值分别为0.57±0.07和0.92±0.12,P＝0.012).结论 miR?126靶向IGF?1R的3′?UTR抑制IGF?1R的表达,进而抑制胃癌细胞的增殖与侵袭.

背景与目的:microRNA(miRNA)在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用,而且不同的miRNA表达状态与肿瘤的不同生物学特征紧密关联.本研究通过分析不同复发风险甲状腺乳头状癌(PTC)患者差异表达的miRNA,筛选与PTC复发风险相关的miRNA,并分析其作用机制.方法:用基因芯片技术分析低危复发风险与中高危复发风险PTC患者血清外泌体中差异表达的miRNA,然后用qRT-PCR方法PTC患者肿瘤组织中验证;用Transwell实验筛选出与PTC细胞侵袭能力有关的差异表达miRNA.通过OncomiR在线数据库对筛选的细胞侵袭力相关miRNA的靶基因进行预测,随后采用过表达与敲低策略,分析PTC细胞相关蛋白表达(Western blot)与PTC细胞侵袭能力(Transwell)的变化,明确细胞侵袭力相关miRNA与预测靶基因的关系.最后,通过GEPIA在线网站对TCGA数据库中PTC临床样本的分析进一步确证.结果:基因芯片分析结果显示,与低危复发风险PTC患者比较,中高危复发风险PTC患者血清外泌体中4个miRNA(miR-186-5p、miR-532-3p、miR-199b-3p、miR-3158-5p)表达上调,1个miRNA(miR-3605-5p)表达下调(均P＜0.05);组织标本qRT-PCR验证结果显示,中高危复发风险PTC患者癌组织中miR-186-5p和miR-3158-5p表达上调(均P＜0.05);Transwell实验结果显示,过表达miR-186-5p后PTC细胞侵袭能力明显增强,敲低则明显减弱(均P＜0.05),但改变miR-3158-5p的表达水平对PTC细胞的侵袭能力无明显影响(均P＞0.05).OncomiR在线数据库预测PRDX6、S100PBP、CLDN18、MAP2可能是miR-186-5p的靶基因;Western blot结果显示,过表达miR-186-5p后PTC细胞中CLDN18的蛋白表达明显降低,敲低则相反,但改变miR-3158-5p的表达水平对其他3个基因的蛋白表达无明显影响;Transwell实验结果显示,过表达CLDN18表达后PTC细胞的侵袭能力明显减弱,敲低则明显增强,而过表达或敲低miR-186-5p对PTC细胞的作用被同时过表达或敲低CLDN18所逆转(均P＜0.05).TCGA数据库分析结果显示,PTC组织中CLDN18表达较正常甲状腺组织明显降低.结论:miR-186-5p表达的增高可能与PTC的复发风险密切相关,机制可能与其通过调节下游CLDN18基因的表达而影响PTC细胞的侵袭能力有关.