目的:比较两种不同钙离子载体A23187和离子霉素对卵母细胞的受精率、胚胎发育潜能和临床结局的影响。方法:采用回顾性队列研究方法，收集2010年5月至2019年12月期间在中山大学附属第六医院生殖医学研究中心、因既往卵胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受精失败/受精率低或严重少弱畸形精子症而采用A23187或离子霉素行人工卵母细胞激活（artificial oocyte activation，AOA）的65名患者资料。根据激活剂的不同分为A23187-AOA组和离子霉素-AOA组；再根据不同精子来源分为两个亚组：射出精子组和睾丸精子组比较组间的受精率、胚胎发育潜能及临床结局。结果:离子霉素-AOA组的双原核（two pronuclei，2PN）受精率［55.0%（116/211）］、2PN卵裂率［97.4%（113/116）］及囊胚形成率［69.1%（38/55）］均显著高于A23187-AOA组［43.3%（135/312）， P=0.008； 90.4%（122/135）， P=0.023； 45.2%（14/31）， P=0.029］。在射出精子组，离子霉素-AOA组的2PN卵裂率［97.1%（68/70）］、第3日（day 3，D3）可移植胚胎率［92.6%（63/68）］均显著高于A23187-AOA组［85.8%（91/106）， P=0.013； 73.6%（67/91）， P=0.002］；在睾丸精子组，离子霉素-AOA组的2PN受精率［55.4%（46/83）］、囊胚形成率［93.3%（14/15）］、种植率［38.9%（7/18）］和累积临床妊娠率［66.7%（6/9）］均显著高于A23187-AOA组［37.7%（29/77）， P=0.024； 20.0%（1/5）， P=0.005； 5.6%（1/18）， P=0.041； 10.0%（1/10）， P=0.019］。入组的65名患者共活产婴儿20例，均未见出生缺陷与先天畸形。 结论:对于因既往ICSI受精失败/受精率低或严重少弱畸形精子症行AOA的患者，离子霉素可以获得比A23187更好的受精率及胚胎发育潜能；对于睾丸来源的严重少弱畸形精子，与A23187相比，离子霉素可以令患者获得更好的临床结局。

目的:探讨阿魏酸对糖尿病小鼠视网膜和高糖诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤的抑制作用及其机制。方法:选取SPF级雄性8周龄2型糖尿病db/db小鼠30只，采用随机数字表法将小鼠分为模型组和阿魏酸组，每组15只，另选取15只同周龄db/m小鼠作为对照组。模型组和对照组每日采用生理盐水灌胃(5 ml/kg)，阿魏酸组采用阿魏酸溶液灌胃(0.05 g/kg)，治疗后2个月处死各组小鼠并摘除眼球。采用苏木精－伊红染色观察小鼠视网膜组织形态学变化；采用免疫荧光染色法和Western blot法检测各组小鼠视网膜组织线粒体钙离子单向转运蛋白(MCU)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)蛋白荧光强度和表达水平。取人RPE细胞，将其分为对照组、二甲基亚砜(DMSO)组、高糖组和高糖＋阿魏酸组，其中对照组不做任何处理，其余各组用相应试剂培养24 h。采用活性氧簇(ROS)检测试剂盒检测各组RPE细胞ROS水平；采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测各组RPE细胞线粒体膜电位水平；采用微丝绿色荧光探针检测各组RPE细胞MCU和微丝荧光强度；通过慢病毒转染技术沉默和过表达MCU蛋白水平探讨MCU与p38 MAPK、p-p38MAPK间的调控关系；采用免疫荧光染色法和Western blot法检测各组RPE细胞MCU、p38 MAPK、p-p38MAPK蛋白荧光强度和表达水平。结果:与对照组比较，模型组小鼠视网膜组织外核层、内核层和神经节细胞层细胞间隙增大、排列紊乱，阿魏酸组小鼠视网膜组织明显改善。与对照组比较，模型组、阿魏酸组小鼠视网膜组织MCU、p-p38 MAPK和MCU＋p-p38 MAPK蛋白荧光强度显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；与模型组比较，阿魏酸组小鼠视网膜组织MCU、p-p38 MAPK和MCU＋p-p38 MAPK蛋白荧光强度显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与对照组比较，模型组小鼠视网膜组织MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白相对表达量显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；与模型组比较，阿魏酸组小鼠视网膜组织MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白相对表达量显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。对照组、DMSO组、高糖组和高糖＋阿魏酸组细胞ROS荧光强度分别为0.22±0.02、0.22±0.03、0.30±0.02和0.24±0.02，总体比较差异均有统计学意义( F＝7.845， P<0.01)，其中高糖组细胞ROS荧光强度明显高于对照组和DMSO组，高糖＋阿魏酸组细胞ROS荧光强度明显低于高糖组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。高糖组、高糖＋阿魏酸组细胞线粒体膜电位水平明显低于对照组和DMSO组，高糖＋阿魏酸组细胞线粒体膜电位水平明显高于高糖组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与对照组、DMSO组比较，高糖组MCU荧光强度较高，并伴随着细胞微丝减少和变细；高糖＋阿魏酸组MCU蛋白荧光强度明显下降，细胞微丝数量明显增加。与对照组、DMSO组比较，高糖组细胞MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白荧光强度和相对表达量显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；与高糖组比较，高糖＋阿魏酸组细胞MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白荧光强度和相对表达量显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与对照组和空载体组比较，MCU过表达组细胞MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白相对表达量显著升高，MCU shRNA组、MCU过表达＋阿魏酸组细胞MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白相对表达量显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；与MCU过表达组比较，MCU shRNA组、MCU过表达＋阿魏酸组细胞MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白相对表达量显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:阿魏酸能够调控氧化应激和线粒体功能障碍，进而改善糖尿病小鼠视网膜和高糖诱导的RPE细胞损伤，其可能通过MCU及p38MAPK信号通路发挥保护作用。

目的:分析Ca 2+载体A23187对卵胞质内单精子注射(ICSI)受精失败或受精低下患者受精及胚胎发育的影响。 方法:回顾性自身对照研究分析2010年1月至2018年1月期间在中山大学附属第六医院生殖医学研究中心，因前次ICSI受精失败或低下[双原核(2PN)受精率≤30%]，再次行ICSI助孕时采用Ca 2+载体A23187激活的43名患者资料。根据前次受精情况将患者分为受精失败和受精低下组、射出精子组和睾丸精子组，激活周期与既往ICSI周期自身对照。 结果:受精失败、受精低下、睾丸精子和射出精子各组激活周期的2PN受精率显著高于既往ICSI周期(分别为41.9%比0， P<0.001;44.3%比16.5%， P<0.001;36.5%比13.5%， P=0.004;43.1%比11.1%， P<0.001)；受精低下组和射出精子组激活周期每周期可移植胚胎数和优质胚胎数较既往周期提高( P均<0.05)；激活周期最终获得9例健康活产婴儿。 结论:Ca 2+载体A23187辅助激活能够提高既往ICSI受精失败或低下患者的受精率，并能改善使用射出精子ICSI患者的胚胎情况及临床结局。

目的 探讨中度以上烧伤儿童的初诊实验室特征与烧伤严重程度和住院时间的关系.方法 回顾性分析104例中度以上烧伤患儿的实验室检测结果,比较中度、重度、特重度烧伤组患者的指标差异,并分析差异指标对重症监护病房(ICU)住院时间和总住院时间的影响.结果 104例患者中,中度烧伤26例,重度烧伤22例,特重度烧伤56例.重度和/或特重度烧伤组的白细胞(WBC)、中性粒细胞比例、C反应蛋白(CRP)、血糖、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、降钙素原(PCT)水平高于中度烧伤组;淋巴细胞比例、钾离子(K+)、钙离子(Ca2+)水平低于中度烧伤组.Spearman相关系数分析显示WBC、中性粒细胞比例、血糖、BUN、Cr、AST水平与ICU住院时间及总住院时间均呈正相关,淋巴细胞比例、K+、Ca2+水平与ICU住院时间和总住院时间均呈负相关.Logistic回归分析显示烧伤严重程度和Ca2+浓度是总住院时间的独立影响因素,同时Ca2+浓度也是ICU住院时间的独立影响因素.结论 儿童烧伤后早期血细胞、肝肾功能、电解质水平与烧伤严重程度密切相关,结合这些指标尤其是Ca2+水平的变化可以对患儿病情作出更精确的分析.

目的 采用G蛋白偶联受体及酶活检测实验方法,探究痹祺胶囊对类风湿性关节炎关键靶点的调节作用,明确其作用机制.方法 选取与抑制滑膜炎症相关的靶点[环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、核因子-κB(nuclear factor-KB,NF-κB)、趋化因子受体 4(C-C chemokine receptor type 4,CCR4)],与抑制血管翳生成相关的靶点[血管内皮生长因子受体(vascularendothelial growth factorreceptor2,VEGFR2/KDR)],与抑制基质降解相关的受体[基质金属蛋白酶-3(matrixmetalloproteinase-3,MMP-3)],以及与活血相关的靶点[凝血酶、磷酸二酯酶(cGMP-inhibited 3',5'-cyclic phosphodiesterase,PDE3A)、肾上腺素受体 α1(alpha-1A adrenergic receptor,ADRA1A)]为研究载体,通过胞内钙离子荧光和酶抑制剂检测技术评价痹祺胶囊中19个主要单体成分对受体的拮抗作用以及对酶的抑制活性.结果 19个化合物中,士的宁、党参炔苷、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、人参皂苷Rb1、阿魏酸、藁本内酯、牛膝皂苷D可显著抑制COX-2活性;马钱子碱、士的宁、党参炔苷、白术内酯Ⅲ、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、藁本内酯、蜕皮甾酮、甘草苷可显著抑制NOS活性;丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B对NF-κB有较好拮抗作用;藁本内酯、牛膝皂苷Ⅳ、甘草次酸可拮抗CCR4;茯苓酸、牛膝皂苷Ⅳ、丹酚酸B、藁本内酯、甘草次酸能抑制VEGFR2/KDR;党参炔苷、丹参素、丹酚酸B、迷迭香酸、藁本内酯可抑制MMP-3活性;丹参素、丹参酮ⅡA、阿魏酸可抑制凝血酶活性,迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、甘草苷可抑制PDE3A活性;马钱子碱、士的宁、藁本内酯、牛膝皂苷Ⅳ、甘草次酸可拮抗ADRA1A.结论 痹祺胶囊可能通过干预COX-2、NOS、NF-κB、CCR4、VEGFR2/KDR、MMP-3、凝血酶、PDE3A及ADRA1A等关键靶点,发挥抗炎止痛、抑制血管翳形成及基质降解、活血作用,进而起到治疗类风湿性关节炎的药效作用.其药效物质基础可能为马钱子碱、士的宁、党参炔苷、白术内酯Ⅲ、茯苓酸、丹参素、迷迭香酸、阿魏酸、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、藁本内酯、蜕皮甾酮、牛膝皂苷D、甘草次酸、甘草苷.

目的:基于 Klotho/成纤维细胞生长因子 23(FGF23)轴探讨益气活血通络方对高磷诱导血管平滑肌细胞钙化的影响.方法:制备益气活血通络方含药大鼠血清,并提取和培养原代大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs).采用β-甘油磷酸(β-GP)诱导大鼠VSMCs钙化模型,加入不同浓度的益气活血通络方含药大鼠血清进行干预,实验设置 8组:对照组、模型组、益气活血通络方低剂量组(模型+10%含药血清)、益气活血通络方高剂量组(模型+20%含药血清)、益气活血通络方+sh-Klotho组(模型+20%含药血清+ sh-Klotho)、益气活血通络方+阴性对照质粒(sh-NC)组(模型+20%含药血清+sh-NC)、益气活血通络方+成纤维细胞生长因子23基因过表达腺病毒(Ad-FGF23)组(模型+20%含药血清+Ad-FGF23)、益气活血通络方+重组腺病毒空载体(AdLaz)组(模型+20%含药血清+AdLaz).显微镜下观察 VSMCs的形态学变化并采用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色鉴定大鼠 VSMCs;细胞计数(CCK-8)法检测细胞增殖情况;茜素红 S染色观察钙结节的形成情况;按照钙离子(Ca2+)浓度及碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒检测细胞内 Ca2+浓度、ALP活性;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞 Klotho、FGF23、α-SMA、Runt相关转录因子 2(RUNX2)、骨形态发生蛋白-2(BMP2)的 mRNA和蛋白表达.结果:与对照组比较,模型组可见橘红色钙化结节明显增多,钙化结节面积、Ca2+浓度和 ALP活性以及 FGF23、RUNX2、BMP2 的 mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.05),Klotho、α-SMA的 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,益气活血通络方低、高剂量组钙化结节明显减少,钙化结节面积、Ca2+浓度和ALP活性以及FGF23、RUNX2、BMP2的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05),Klotho、α-SMA的mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05);而沉默 Klotho或上调 FGF23 的表达能明显逆转益气活血通络方对 VSMCs钙化的作用.结论:益气活血通络方可抑制高磷环境中VSMCs向成骨表型分化,减轻VSMCs的钙化;其作用机制可能与激活Klotho/FGF23轴有关.

目的 研究钙离子载体A23187对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的肝星状细胞增殖、周期及凋亡蛋白caspase-3表达的影响.方法 将液氮保存下的肝星状细胞株,于37℃ 、50 mL/L CO2孵箱中进行复苏传代培养,同步化后将细胞分为5组:空白组、TGF-β1(5 ng/mL)组、TGF-β1+低、中、高剂量钙离子载体A23187组,即5 ng/mL TGF-β1刺激24 h,再分别加入1、2、4μmol/L不同剂量钙离子载体A23187作用24 h后,用M T T比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,蛋白免疫印记测定凋亡蛋白caspase-3表达.结果 不同浓度钙离子载体A23187均能显著抑制细胞增殖(P<0.05),且随着剂量的增加,细胞的相对增殖率(RGR)降低,低、中、高剂量组分别为85.93%、61.71%、48.43%,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);不同处理组G1期细胞比例、S+G2期细胞比例差异均有统计学意义(P<0.05),钙离子载体A23187剂量越大,G1期细胞比例越高,S+G2期细胞比例越低(P<0.05).随着钙离子A23187浓度的增加,细胞内caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.05).结论 钙离子载体A23187可能通过阻滞大鼠肝星状细胞由G1期进入S期和G2期,抑制细胞增殖,同时上调凋亡蛋白caspase-3的表达.

目的:构建电压依赖型钙离子通道基因CACNA2D3(caleium channel,voltage-dependent,alpha2 delta subunit 3)真核表达载体,为进一步研究其在食管鳞癌发生发展中的作用打下基础.方法:利用RT-PCR技术扩增CACNA2D3基因编码序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)载体中,经双酶切和测序鉴定后转染到人食管癌细胞系EC109中,通过QRT-PCR技术检测CACNA2D3基因的表达情况.结果:从正常组织cDNA中扩增出CA CNA2D3基因片段,大小与预期一致;得到的pcDNA3.1-CACNA2D3重组质粒通过双酶切和电泳后符合预期片段,进一步测序鉴定显示插入片段序列与GenBank中CA CNA2D3的序列一致;重组质粒转染食管鳞癌细胞EC109后CACNA2D3基因在转录水平表达明显增高.结论:成功构建了pcDNA3.1-CAC-NA2D3重组质粒,并完成了在食管癌细胞EC109中的外源表达,为进一步研究其生物学功能奠定基础.

目的:评价外周血红细胞源微粒对于急性冠状动脉综合征(ACS)诊断的临床意义.方法:2015-01至2016-09在我院心内科住院并符合本研究纳入标准的患者150例,分为非冠心病(Non-CAD)组(n=45)、ACS组(n=105);ACS组患者包括急性ST段抬高型心肌梗死患者(STEMI,n=37)、非ST段抬高型心肌梗死患者(Non-STEMI,n=31)和不稳定性心绞痛患者(UAP,n=37).收集研究对象外周静脉血,离心后加入钙离子载体A23187,得到微粒.用特异性红细胞源微粒抗体(glycophorine A CD235a)标记红细胞微粒,然后经流式细胞仪进行定性定量分析.结果:ACS组外周血中红细胞源微粒水平(％)为26.20[15.90,38.00],Non-CAD组红细胞源微粒水平(％)为14.00[4.35,36.35],ACS组高于Non-CAD组(P<0.05).ACS组STEMI、Non-STEMI和UAP患者的外周血红细胞源微粒水平(％)依次为27.20(17.25,24.25)、21.50(12.76,34.90)、30.20(17.10,39.65),这三类患者之间红细胞源微粒水平的差异并无统计学意义(P>0.05).结论:ACS患者外周血红细胞源微粒水平高于Non-CAD,提示外周血红细胞源微粒水平的升高可能参与ACS发生、发展过程,可能与ACS患者发生急性血栓事件相关.

用钙离子报告基因非侵入式监测细胞内源钙离子实时变化是目前比较常用的钙离子监测方法.而基于传统荧光共振能量转移原理(FRET)的荧光探针具有较高的量子产率,则是目前应用于细胞或亚细胞水平钙离子检测的重要备选实验方案之一.然而,供体荧光基团的激发过程却经常给最终成像过程带来强的背景和荧光信号光漂白等干扰.水母发光蛋白(Aequorin)能够在底物存在的情况下和3个Ca2+结合,通过氧化还原反应产生一个波长为469 nm的蓝光光量子,借助这一反应中蓝光光量子的产率与细胞中游离Ca2+浓度间存在精确定量关系,研究者可以准确测量细胞内的钙离子浓度动态变化情况.但是由于蓝光的波长短,存在易于被散射而难于被检测等问题,造成了目前直接使用水母发光蛋白检测细胞内Ca2+态时,实验效率较低.为了解决上述这些问题,我们构建了一种将apoaequorin-egfp基因融合表达的植物双元表达载体,然后通过农杆菌介导的遗传转化法将这个融合基因整合到烟草的基因组中,建立了一个基于生物发光共振能量转移技术(BRET)技术,较为高效的植物细胞内源钙离子动态检测系统.