目的:克隆鳜鱼MDA5基因cDNA序列,研究聚肌苷酸胞苷酸[Poly(I:C)]感染过程中MDA5的表达规律.方法:利用RT-PCR和RACE技术克隆鳜鱼MDA5全长序列,构建Poly(I:C)感染模型,分析MDA5在鳜鱼脾脏和鳃组织中的表达规律.结果:鳜鱼MDA5 cDNA全长3556 bp,包括142 bp 5'UTR、438 bp 3'UTR和2976 bp开放读框,共编码991个氨基酸残基.MDA5蛋白具有RLR家族的典型特征,即N端含有2个CARD结构域,C端含有DEXDc、解旋酶和RD结构域,序列分析发现鳜鱼的MDA5与横斑石鲷、大黄鱼的同源性较高,分别达85.4％、79.8％.组织表达谱分析显示,鳜鱼MDA5基因在不同组织中普遍表达,用Poly(I:C)抗原刺激后,MDA5 mRNA表达显著上调,其中脾脏组织在诱导8h后达到峰值,而在鳃组织中表达持续显著上调.结论:MDA5在鳜鱼免疫应答中起重要作用.

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种危害鳜鱼养殖生产的重要病原细菌,为进一步明确该病原菌的分子特征及建立快速检测技术,实验对引起翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌进行了致病性、菌株毒力特征研究,同时以嗜水气单胞菌气溶素基因aerA为分子靶标设计引物,利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了病原嗜水气单胞菌的快速检测方法.结果表明,本次引起翘嘴鳜暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌半致死浓度为1.6× 106 CFU/mL,携带aerA等14种毒力基因,此14种毒力基因可用于其致病性分析及分子检测.以气溶素基因aerA设计引物进行的环介导恒温扩增,结果显示可扩增出阶梯状条带,加入SYBR Green Ⅰ染色后呈现绿色的阳性反应,而对照组均未出现任何扩增条带且反应体系呈现橙色,表明LAMP检测方法对于嗜水气单胞菌检测具有很好的特异性;灵敏度检测的最低检测限为4.6×101 CFU/mL;10种经人工感染的淡水养殖鱼虾组织匀浆增菌液,提取DNA后进行LAMP方法检测,结果均可获得阳性扩增结果,而对照未染菌组呈阴性,表明该方法具有较好的应用性,可应用于嗜水气单胞菌引起的水生动物疾病的检测.

为阐明γ-氨基丁酸(GABA)对鳜(Siniperca chuatsi)摄食和食欲的影响,对鳜脑室注射生理盐水和不同剂量的GABA(50、125、500和2000 tg).结果显示,注射125 μg GABA组的鳜在2h内摄食量显著升高.实时荧光定量PCR (RT-qPCR)结果显示,注射125 μg GABA 0.5h后,鳜鱼脑中AgRP和NPY mRNA表达量上调,CART和POMC mRNA表达量下调,都和鳜摄食量增加相一致.相比于对照组,注射GABA后Leptin-R的mRNA表达量在0.5h和2h都有显著下降.这些结果表明GABA可能通过leptin的信号通路来影响食欲,进而影响摄食量.研究结果可以为GABA在水产饲料中的应用提供理论依据.

目的:探究大口黑鲈弹状病毒株与其他已知弹状病毒的差异,构建该病毒糖蛋白的杆状病毒表达系统,用于后续口服疫苗的研发.创新点:基于获得的大口黑鲈弹状病毒的全基因组序列,并利用杆状病毒表达系统获得了高丰度的病毒糖蛋白,可结合家蚕用于后续口服疫苗的研发.方法:利用cDNA末端快速扩增法(RACE)及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等技术获得了病毒的部分序列,拼接获得了病毒的全基因组序列.通过ClustalW比较该病毒与已知弹状病毒的3'leader及5'trailer序列差异,进一步利用MEGA软件比较该病毒全基因组序列与其他鱼类弹状病毒的差异,确定其系统进化树中的分支及地位.基于糖蛋白序列分析结果,利用杆状病毒表达载体构建该病毒的糖蛋白表达系统,感染昆虫卵巢细胞(SF9)后,借助荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫荧光及蛋白质印迹法(western blot)等技术确定病毒增殖及糖蛋白的表达情况.结论:该大口黑鲈弹状病毒株全长11526 bp,且与鳜鱼弹状病毒为同一分支,属于水泡病毒属.构建的病毒糖蛋白杆状病毒表达系统成功在SF9细胞中表达了高丰度的糖蛋白.

目的 对2014-2018年深圳市市售淡水产品进行兽药残留监测,分析其超标情况及逐年变化趋势,掌握淡水产品安全风险状况,为全市开展食品安全风险监测工作提供科学依据.方法 按照GB/T 19857-2005、GB/T 22338-2008、SC/T 3019-2004、SN/T 0197-2014、GB/T 21311-2007及GB/T 21312-2007中的方法,检测淡水产品中20种兽药残量,分析其在不同年份、样品类别、采样地区及采样环节方面的残留情况.结果 5年共监测610份市售淡水产品,有79份兽药残留超标,超标率为12.95％,其中2015年超标率最高,为28.00％,5年间差异有统计学意义(P＜0.01);不同兽药种类中,孔雀石绿超标率最高,为5.90％,其差异具有统计学意义(P＜0.001);不同样品类别中,鳜鱼超标率最高,为35.71％,其差异具有统计学意义(P＜0.01);三个不同采样环节兽药残留超标率存在显著性差异(P＜0.05).结论 深圳市市售淡水产品存在一定程度的兽药残留问题,加强对淡水产品中兽药残留的监测,从养殖、运输、加工、储存以及销售等过程进行规范,禁止使用违禁药及减少兽药的使用,保障淡水产品食品安全.

目的 了解2008-2018年上海市市售大菱鲆、乌鳢和鳜鱼中孔雀石绿和硝基呋喃化合物残留(即“三鱼两药”)动态变化趋势,评估膳食暴露风险.方法 采用2008-2018年原上海市食品药品监督管理局“三鱼两药”风险监测数据,结合2013年上海市居民膳食消费量调查结果,采用暴露边界比(MOE)法进行膳食暴露评估.结果 11年来上海市“三鱼两药”风险监测不合格率为19.0％ (148/779),各年度不合格率呈现波动下降趋势.其中,2018年不合格率(3.6％,2/55)较2008年(33.7％,30/89)下降89.3％.按品种统计,11年间大菱鲆、乌鳢和鳜鱼中“两药”不合格率分别为42.6％(100/235)、8.6％(21/244)和9.0％ (27/300),其中硝基呋喃化合物不合格率(17.8％,139/779)较孔雀石绿(1.2％,9/779)更为突出.上海市居民通过“三鱼”摄入孔雀石绿和硝基呋喃化合物的MOE分别为1.7× 106和1.6× 106,健康风险均较低(MOE＞ 104).结论 上海市市售水产品中“三鱼两药”问题趋于好转,居民通过“三鱼”摄入“两药”的健康风险较低,但考虑到“两药”为禁用兽药,仍需相关部门保持高压监管态势.

鳜鱼β-防御素(Siniperca chuatsi β-defensin,ScBD)作为一种重要的蛋白质免疫因子,在其抵御病原微生物侵染的过程中起到了重要的作用,被认为是开发天然抗菌剂的理想候选者.ScBD的初级结构含信号肽和成熟肽,后者由43个氨基酸残基组成,决定了其生物学活性.通过同源建模法预测了ScBD的空间结构,显示其具有β-片层、伸展链和无规则卷曲等构象单元;3对特有的二硫键作为维持其空间结构的关键性次级键,保障了ScBD具有稳定的生物学活性.为解决前期研究中重组ScBD的低表达量问题、探索目的基因拷贝数对转录水平的影响,使用同尾酶法构建了ScBD基因的二拷贝和四拷贝表达盒载体pPICZαA-ScBDn(n=2或4),分别电转至毕赤酵母X-33后成功筛选到各种重组菌株.qRT-PCR测定结果表明,含一拷贝、二拷贝和四拷贝表达盒载体的重组菌株的基因组中ScBD基因的拷贝数分别为1.19×105、2.56×105和5.29×105,证明载体所含的表达盒数目与嵌合进毕赤酵母基因组中的ScBD基因拷贝数之间存在正相关关系,也由此证明了多拷贝表达盒载体的构建是提高目的基因拷贝数和转录水平的有效方法.结果 为进一步确定ScBD基因拷贝数与蛋白质表达量之间的关系提供参考.

目的 通过检测鲈鱼、鳜鱼和黑鱼中4种硝基呋喃类代谢物和4种孔雀石绿类药物残留,了解武汉市两类禁用药物残留结果及逐年趋势,为评估肉食性鱼安全状况提供依据.方法 采集武汉市多个区3种肉食性淡水鱼共333份,用固相萃取-超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法(SPE-UPLC-MS/MS)检测4种硝基呋喃类代谢物和4种孔雀石绿类药物残留量,并对实验数据进行描述性统计分析,数据组间比较采用x2检验.结果 武汉市3种肉食性淡水鱼中两类禁用药物总检出率为8.11％,孔雀石绿类和硝基呋喃类代谢物检出率分别为5.11％和3.00％,2013-2020年两类禁用药物在肉食性淡水鱼中检出率呈逐年降低趋势.结论 武汉市3种肉食性淡水鱼中两类禁用药物滥用曾经较为普遍,随着监管趋严,滥用情况得到初步有效遏制.

为了研究翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)金属调节转录因子-1(Metal-regulated transcription factor-1,mtf-1)序列特征、组织表达及重金属镉胁迫对其昼夜节律性表达的影响,研究对翘嘴鳜mtf-1基因启动子顺式调控元件和序列特征,以及该基因在不同组织中的表达模式进行了分析,并对水体镉胁迫下翘嘴鳜脑组织中mtf-1基因表达昼夜节律性变化进行了研究.结果表明,翘嘴鳜mtf-1启动子中存在锌指蛋白ZNF136、ZNF384和ZNF143结合位点,表明其表达受金属离子的潜在调控,另外,翘嘴鳜mtf-1启动子中还发现核心生物钟基因RORβ结合位点,表明mtf-1基因可能参与昼夜节律调控.基因结构域分析表明翘嘴鳜mtf-1基因存在一个高度保守的DNA结合域及一个不保守的反式激活域.mtf-1基因在翘嘴鳜不同组织中均有表达,其中脑组织中表达量最高、肾脏其次.在自然条件下,翘嘴鳜脑组织中mtf-1基因呈现昼低夜高的表达趋势,其基因表达峰值相位为ZT 12.65h(一日中的黄昏时期),这与翘嘴鳜昼伏夜出,黄昏最活跃的生活习性相符.在水体镉胁迫下,翘嘴鳜脑组织mtf-1基因昼夜都呈现持续低表达,昼夜表达差异不显著,表明水体镉胁迫能显著抑制翘嘴鳜mtf-1基因表达,破坏鳜鱼脑组织mtf-1昼夜节律.

视黄醇X受体(retinoid x recepto,RXR)是核受体超家族的重要成员.本研究旨在分析鳜鱼(Sini-perca chuatsi)rxr基因家族的分子特征,检测其不同亚型在各组织中的表达模式,进一步为鱼类中不同rxr基因亚型的差异性研究提供理论依据.本研究对鳜鱼rxr基因家族序列特征、同源性及进化关系进行了分析,并利用实时荧光定量PCR技术检测4个亚型在鳜鱼各组织中的表达模式与肠道中的昼夜表达节律.结果表明,鳜鱼4个rxr基因亚型在cDNA序列长度和开放阅读框上存在差异,但其编码氨基酸序列都包含两个典型的核受体结构域.鳜鱼相比哺乳类多1个rxrβb基因亚型,系统进化树分析表明,rxrβb是由硬骨鱼特异性全基因组复制事件产生的.4种鳜鱼rxr基因亚型在所检测的鳜鱼组织中均有表达,且具有特异的组织表达模式,其中rxrαa基因亚型在鳜鱼各组织中均为低水平表达,在鳜鱼肝脏组织中相对表达最高.鳜鱼rxrgb主要在肝脏和肌肉组织中高表达,在肠道等其他组织中低水平表达.鳜鱼rxrβa与rxrβb具有相似的组织表达模式,均在脑组织中表达最高.在对鳜鱼肠道组织中4种rxr基因亚型进行24 h昼夜节律表达分析的研究中,发现rxrβa和rxrgb在肠道中表达呈现显著的昼夜节律性.水体镉暴露(Cd 20 μg/L,7 days)下,鳜鱼肠道rxrβa 的振幅下降,昼夜节律消失,rxrgb则呈现昼夜持续性高表达,昼夜节律性消失.此外,水体镉暴露导致鳜鱼肠道rxrαa在夜间授时因子时间(zeitgeber time,ZT)12～24 h的表达量相比对照组显著上调.本研究表明rxr基因是重金属镉暴露的靶基因,水体镉暴露能导致鳜鱼肠道rxr基因昼夜节律紊乱.