目的 基于AMPK/ULK1信号通路观察归芪益元膏联合顺铂对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及作用机制.方法 小鼠右侧腋下接种Lewis肺癌细胞建立皮下肿瘤模型.将小鼠随机分为空白组、模型组、顺铂组和中药高、中、低剂量+顺铂组,每组10只,顺铂组腹腔注射顺铂5 mg/kg(每7 d一次),中药高、中、低剂量+顺铂组在顺铂组基础上分别予归芪益元膏7.0、3.5、1.75 g/kg灌胃,每日1次,连续14 d.HE染色观察小鼠肿瘤组织形态,免疫组化测定肿瘤组织p-AMPK、p-ULK1蛋白表达,透射电镜观测肿瘤组织自噬小体数量,RT-PCR测定小鼠肿瘤组织p62、Beclin-l、Atg5、LC3 mRNA表达,Western blot检测肿瘤组织Beclin-1、p62、Atg5、LC3和AMPK/ULK1信号通路蛋白表达.结果 与模型组比较,各给药组小鼠瘤质量明显降低(P<0.05);肿瘤组织出现片状坏死区域且自噬小体数量增加,Beclin-l、Atg5、LC3 mRNA表达升高,Beclin-1、Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ、AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1蛋白表达升高,p62 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05).与顺铂组比较,中药高、中剂量+顺铂组小鼠瘤质量降低(P<0.05),抑瘤率增加;中药高、中、低剂量+顺铂组小鼠肿瘤组织ULK1蛋白和Atg5 mRNA表达明显升高(P<0.05);中药高、中剂量+顺铂组Beclin-1、LC3 mRNA表达明显升高(P<0.05),Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ、AMPK、p-AMPK、p-ULK1蛋白表达明显升高(P<0.05),p62蛋白表达明显降低(P<0.05);中药高剂量+顺铂组p62 mRNA表达明显降低(P<0.05),Beclin-1蛋白表达明显升高(P<0.05).结论 归芪益元膏联合顺铂可能通过激活AMPK/ULK1信号通路促进肿瘤细胞自噬,进而抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠皮下肿瘤生长.

基于蛋白组学探讨灵芝酸X(ganoderic acid X,GAX)对人肝母细胞瘤HepG2、HuH6细胞模型和非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic-severe combined immune deficient,NOD-SCID)小鼠皮下移植瘤模型的作用机制,为灵芝酸X的临床应用提供依据.采用CCK-8法检测灵芝酸X对HepG2、HuH6细胞活力的影响;EdU实验检测灵芝酸X对细胞增殖的影响;划痕实验检测灵芝酸X对细胞迁移能力的影响;Hoechst 33258染色检测灵芝酸X对细胞凋亡的影响;建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型,分析对照组及灵芝酸X低、中、高剂量组(5、10、20 mg·kg-1)肿瘤体积和质量;苏木素-伊红(HE)染色评估灵芝酸X的药物毒性.此外,收集HepG2细胞对照组和灵芝酸X高剂量组的细胞,分别进行laber-free蛋白组学分析,筛选差异蛋白并富集相关信号通路,CYTO-ID?染色检测细胞自噬情况,Western blot实验检测相关蛋白的表达量.体外结果显示,灵芝酸X呈剂量依赖性抑制HepG2、HuH6细胞的增殖、迁移、诱导凋亡;体内研究显示灵芝酸X显著抑制肿瘤体积和质量,且对小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)无明显损害;laber-free蛋白组学结果显示灵芝酸X在肝母细胞瘤治疗过程中参与多种信号通路,其中自噬途径高度富集.CYTO-ID ?染色及Western blot结果显示灵芝酸X诱导细胞自噬并上调苄氯素1(Beclin-1)、自噬相关基因5(ATG5)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)-Ⅱ蛋白表达量,下调螯合体1(p62)蛋白表达量.该研究表明,灵芝酸X通过诱导自噬进而抑制肝母细胞瘤细胞的增殖、迁移和诱导凋亡,并显著抑制肿瘤生长,是一种有希望的癌症辅助治疗药物.

目的 观察补肾健脾方对环磷酰胺诱导的卵巢储备功能减退大鼠模型卵巢功能的影响,并基于肿瘤坏死因子诱导相关细胞凋亡途径探讨补肾健脾方调控大鼠卵巢储备功能减退的机制研究.方法 60只动情周期正常的健康雌性SD大鼠,随机分成正常组 10只和造模组 50 只,造模组采用环磷酰胺 75 mg/kg单次腹腔注射造模.造模成功的大鼠再随机分为模型组、西药组[戊酸雌二醇 0.103 mg/(kg·d)+黄体酮胶囊 2.575 mg/(kg·d)]、补肾健脾方低剂量组[3.21 g/(kg·d)]、补肾健脾方中剂量组[6.43 g/(kg·d)]、补肾健脾方高剂量组[12.85 g/(kg·d)],每组 10只.正常组及模型组均予等体积蒸馏水灌胃,每组干预 1次/d,干预 14 d.检测各组大鼠动情周期、体质量、卵巢脏器指数、子宫脏器指数;ELISA法检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)含量;免疫荧光法检测大鼠卵巢颗粒细胞内B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2 相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)蛋白表达情况;HE染色检测卵巢组织病理情况;Western blot法检测卵巢磷酸化蛋白激酶B(posphorylated-proteinkinase B,p-AKT)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、自噬蛋白苄氯素-1(Beclin-1)表达情况.结果 与正常组比较,模型组大鼠动情周期紊乱,可见卵巢结构紊乱、各级卵泡数量不同程度的减少、未见成熟卵泡,卵巢间质中见到明显炎细胞浸润;大鼠体质量、卵巢脏器指数和子宫脏器指数无明显变化;血清TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.05,P<0.01);卵巢颗粒细胞Bcl-2、Bax、Beclin-1 蛋白表达水平升高(P<0.05,P<0.01),p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平降低(P<0.01).与模型组比较,西药组及补肾健脾方低、中剂量组血清TNF-α、IFN-γ水平降低(P<0.05,P<0.01);补肾健脾方中剂量组Bax蛋白表达水平降低(P<0.05);补肾健脾方高剂量组Bcl-2 蛋白阳性表达升高(P<0.05);西药组、补肾健脾方低剂量组Beclin-1 蛋白表达水平降低(P<0.05,P<0.01),p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平升高(P<0.01).与西药组比较,补肾健脾方高剂量组TNF-α水平升高(P<0.01);补肾健脾方低、高剂量组IFN-γ水平降低(P<0.05);补肾健脾方低剂量组Bax蛋白表达水平升高(P<0.05),补肾健脾方中剂量组Bcl-2 蛋白水平表达升高(P<0.05);补肾健脾方中、高剂量组Beclin-1 蛋白表达水平升高(P<0.05,P<0.01),p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平降低(P<0.01).结论 补肾健脾方可改善卵巢病理变化、提高卵巢储备功能,其机制可能通过抑制肿瘤坏死因子TNF-α、IFN-γ表达,增强Bcl-2 蛋白表达水平,降低Bax蛋白表达水平,激活mTOR通路抑制大鼠卵巢颗粒细胞的自噬与凋亡,从而改善环磷酰胺造模所致的大鼠卵巢储备功能减退的影响.

目的:观察人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）对2型糖尿病（T2DM）小鼠胰岛功能的影响及其对NOD样受体家族核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）炎性体和自噬过程的调节作用。方法:实验研究。选取20只8周龄雄性C57BL/6J小鼠，分为正常对照组（ n=5）和高脂喂养建模组（ n=15）；T2DM建模成功的小鼠进一步分为糖尿病组（ n=7）和UC-MSCs治疗组（ n=7）。UC-MSCs治疗组每周给予1次UC-MSCs（1×10 6/0.2 ml磷酸盐缓冲液）尾静脉输注治疗，共治疗4周；糖尿病组注射等量生理盐水，正常对照组不予处理。治疗结束后1周各组小鼠行腹腔糖耐量和胰岛素耐量试验检测糖耐量和胰岛素敏感性变化；采用免疫荧光染色法观察胰岛结构改变并检测胰岛中白细胞介素1β（IL-1β）和胰十二指肠同源框因子1（PDX-1）的表达。体外用脂多糖和三磷酸腺苷对小鼠骨髓诱导的原代巨噬细胞进行刺激（处理组）后，与UC-MSCs进行Transwell共培养实验24 h（治疗组），采用酶联免疫吸附法检测各组上清液中IL-1β的分泌水平，采用免疫荧光染色检测NLRP3炎性体和自噬相关蛋白的表达。统计学分析采用单因素方差分析及重复测量方差分析。 结果:体内实验表明，与糖尿病组相比，UC-MSCs治疗组小鼠胰岛结构部分修复，糖耐量和胰岛素敏感性均改善（均 P<0.05），共聚焦显微镜下观察胰岛中PDX-1表达增高，IL-1β的表达水平降低。体外实验表明，相较于处理组，治疗组中巨噬细胞分泌的IL-1β水平降低［（85.9±74.6）比（883.4±446.2）pg/ml， P=0.001］，共聚焦显微镜下观察NLRP3炎性体的表达降低，自噬底物蛋白P62表达降低，微管相关蛋白轻链β3（LC3B）、自噬效应蛋白Beclin-1表达增高。 结论:UC-MSCs可降低T2DM小鼠胰岛炎症水平，保护胰岛功能，可能与UC-MSCs抑制巨噬细胞NLRP3炎性体的活性，增强自噬水平有关。

目的:评价胰高血糖素样肽-1和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽双受体激动剂DA-JC4对老龄大鼠术后神经炎症反应的影响。方法:清洁级健康SD大鼠45只，雌雄不拘，21～23月龄，体重530～630 g，采用随机数字表法分为3组( n＝15)：假手术组(S组)、外科手术组(O组)和DA-JC4组(G组)。O组和G组水合氯醛麻醉下行剖腹探查术。G组分别于术毕即刻、术后24和48 h时腹腔注射DA-JC4 10 nmol/kg(溶于1 ml无菌生理盐水)。术后第3天采用Western blot法测定海马Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、IL-1β和TNF-α的表达水平。术后第14-18天行Morris水迷宫实验测试认知功能。 结果:与S组比较，O组术后第15-18天、G组术后第18天逃离潜伏期延长，O组和G组穿越原平台次数减少，目标象限停留时间缩短，海马活化的caspase-3、Bax、LC3Ⅱ、HMGB1、IL-1β和TNF-α表达上调，Bcl-2、LC3Ⅱ和Beclin-1表达下调( P<0.05)；与O组比较，G组术后第15-18天逃离潜伏期缩短，穿越原平台次数增加，目标象限停留时间延长，海马活化的caspase-3、Bax、HMGB1、IL-1β和TNF-α表达下调，Bcl-2、LC3Ⅱ和Beclin-1表达上调( P<0.05)。 结论:DA-JC4减轻老龄大鼠术后认知功能障碍的机制可能与抑制神经炎症反应有关。

目的:研究mTOR信号通路介导的自噬在镉抑制人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）成骨分化中的作用。方法:根据氯化镉的染毒剂量，分为0、2.5和5.0 μmol/L染毒组，每组细胞均处理1 d、4 d和（或）7 d，检测ALP活力、成骨标志物（ALP，RUNX2和OSTERIX）mRNA和蛋白质表达水平、自噬相关蛋白（LC3和Beclin-1）和mTOR信号通路相关蛋白（mTOR，p-mTOR和p-p70S6K）表达情况，碱性磷酸酶染色和茜素红染色情况。选择MHY 1485为信号通路激活剂，设置对照组、氯化镉组（5.0 μmol/L）、MHY 1485组和氯化镉+MHY 1485联合处理组，处理7 d后分别检测各组hBMSCs的自噬相关蛋白和mTOR信号通路相关蛋白表达水平。结果:在第1天和第4天，0、2.5和5.0 μmol/L组之间的ALP活力差异无统计学意义（ P值均>0.05）；在第7天，与0 μmol/L组相比，2.5、5.0 μmol/L组的ALP活力、成骨标志物ALP、RUNX2和OSTERIX表达水平和mTOR信号通路相关蛋白mTOR、p-mTOR、p-p70S6K表达水平均降低（ P值均<0.05），5.0 μmol/L组的自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达均有所增加（ P值均<0.05）。与0 μmol/L组相比，2.5、5.0 μmol/L组的染色变浅，ALP和矿化结节生成减少。与氯化镉组相比，氯化镉与MHY 1485联合处理组的自噬相关蛋白表达下降，mTOR信号通路相关蛋白表达增加，差异具有统计学意义（ P值均<0.05）。 结论:镉抑制hBMSCs成骨分化可能与mTOR信号通路介导的自噬有关。

目的:研究亚砷酸钠（NaAsO 2）对人肝星状细胞（LX-2细胞）自噬蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）、Beclin-1的影响。 方法:体外培养LX-2细胞，使用红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-LC3（RFP-GFP-LC3）慢病毒稳定感染LX-2细胞，流式细胞术进行筛选和感染率测定。采用成组设计，用不同浓度NaAsO 2[μmol/L：5.00（感染+高砷剂量组）、0.50（感染+中砷剂量组）、0.05（感染+低砷剂量组）、0.00（感染组）]孵育稳定感染LX-2细胞，构建体外肝纤维化模型，同时设立空白组。采用CCK-8法检测NaAsO 2对LX-2细胞活性的影响；采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测LC3、Beclin-1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA和蛋白表达水平。 结果:RFP-GFP-LC3慢病毒稳定感染LX-2细胞后，流式细胞术测定RFP、GFP荧光，感染率在70%左右，荧光显微镜下观测RFP和GFP的荧光强度无显著性差异，稳定感染细胞株建立成功。NaAsO 2处理24、48、72 h，与空白组比较，感染组细胞活性差异无统计学意义（ P均> 0.05），其余各剂量组细胞活性均下降（ P均< 0.05）。各组间LC3、Beclin-1、α-SMA mRNA和蛋白表达水平比较差异有统计学意义（ F = 17.450、11.084，11.294、11.745，31.635、12.130， P均< 0.05）。LC3 mRNA水平，感染组、感染+高砷剂量组、感染+低砷剂量组（20.09 ± 6.50、36.57 ± 9.68、14.19 ± 6.17）高于空白组（1.25 ± 0.21， P均< 0.05），感染+高砷剂量组高于感染组（ P < 0.05）；Beclin-1 mRNA水平，各组（22.46 ± 0.66、13.38 ± 2.27、20.80 ± 6.95、24.31 ± 7.09）高于空白组（1.10 ± 0.53， P均< 0.05）；α-SMA mRNA水平，感染+高砷剂量组、感染+中砷剂量组、感染+低砷剂量组（1.07 ± 0.27、1.65 ± 0.17、1.73 ± 0.26）高于空白组（0.60 ± 0.11）、感染组（0.31 ± 0.09， P均< 0.05）。LC3蛋白表达，感染组、感染+中砷剂量组、感染+低砷剂量组（0.20 ± 0.06、0.15 ± 0.00、0.16 ± 0.01）高于空白组（0.04 ± 0.01， P均< 0.05）；Beclin-1蛋白表达，感染+中砷剂量组、感染+低砷剂量组（0.83 ± 0.03、1.20 ± 0.02）高于空白组（0.25 ± 0.01， P均< 0.05），感染+低砷剂量组高于感染组（0.53 ± 0.03， P < 0.05）；α-SMA蛋白表达，感染+中砷剂量组、感染+低砷剂量组（0.78 ± 0.10、0.68 ± 0.06）高于空白组（0.40 ± 0.07）、感染组（0.48 ± 0.04， P均< 0.05）。 结论:NaAsO 2可能通过促进LX-2细胞自噬水平影响砷致肝纤维化过程。

目的:探讨微小核糖核酸876-5p(micro ribonucleic acid-876-5p, miR-876-5p）通过靶向叉头盒蛋白M1(forkhead box M1，FOXM1）对儿童髓母细胞瘤（medulloblastoma ，MB）细胞增殖的影响。方法:收集2018年1月至2020年10月在湖南省儿童医院进行手术治疗的30例MB患儿临床资料，其中男21例，女9例，年龄为（10.42±2.17）岁，范围为5~14岁。通过qPCR检测肿瘤组织和癌旁组织标本中miR-876-5p和FOXM1、TAp73、Beclin1、Livin、Cyclin D1在mRNA水平的表达情况；通过CCK8和Transwell实验观察过表达miR-876-5p后对MB细胞的增殖和侵袭能力的影响；通过qPCR和WB实验检测过表达miR-876-5p前后，FOXM1、TAp73、Beclin1、Livin、Cyclin D1在蛋白或mRNA水平表达的变化。结果:miR-876-5p在MB中表达显著降低（ P<0.001），过表达miR-876-5p能够显著抑制MB细胞的增殖和侵袭能力（ P<0.01）。FOXM1在MB中表达上调，其表达与miR-876-5p呈负相关（ r=-0.527， P=0.013 ）。在MB细胞中过表达miR-876-5p能够抑制FOXM1的表达。此外，在MB中，miR-876-5p的表达与TAp73和Beclin1呈正相关（ r=0.506， P=0.008； r=0.535， P=0.003），与Livin和Cyclin D1 mRNA呈负相关（ r=-0.496， P= 0.011； r=-0.574 ， P=0.005 ）。与之相反，FOXM1的表达与TAp73和Beclin1呈负相关（ r=-0.554 ， P=0.007 ； r=-0.497， P=0.016 ），与Livin和Cyclin D1呈正相关（ r=0.502， P=0.009 ； r=0.476， P=0. =0.015 ）。此外，miR-876-5p在MB细胞中可以下调Livin和Cyclin D1的表达，上调TAp73在Beclin1的表达。 结论:miR-876-5p具有抑制MB增殖和侵袭的作用，而FOXM1可能促进MB增殖和侵袭。miR-876-5p可能通过靶向调控FOXM1促进机体内抑癌基因的表达并抑制致癌基因表达，最终抑制MB细胞增殖和侵袭。

目的:探讨紫檀芪对人乳头瘤病毒16（HPV16）整合感染宫颈上皮细胞（H8细胞）生长、凋亡和自噬的影响。方法:紫檀芪与H8细胞共培养24 h和48 h，使用CCK8法检测细胞增殖活性，流式细胞仪检测H8细胞凋亡和细胞周期，荧光显微镜观察MDC染色后细胞自噬形态学改变，Western印迹检测各组细胞周期相关蛋白（cyclinD1）、凋亡相关蛋白（caspase3、caspase9）、自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62）、HPV致癌基因蛋白（E6、E7蛋白）的表达。采用单因素方差分析、重复测量方差分析和LSD- t检验分析组间差异。 结果:对照组（0）、25、50、75、100 μmol/L紫檀芪作用H8细胞48 h后，各组细胞相对生长率（100.00% ± 1.56%、99.02% ± 4.97%、93.59% ± 2.01%、81.28% ± 4.90%、69.17% ± 7.56%）差异有统计学有意义（ F = 77.22， P < 0.05），随着浓度增加生长率渐降低，各紫檀芪组与对照组比较，均 P < 0.05。紫檀芪作用H8细胞24 h后，各组细胞G1期、G2期、S期细胞比例差异均有统计学意义（ F = 7 845.00、51.14、266.50，均 P < 0.05），各紫檀芪组G1期、G2期细胞比例均高于对照组，S期细胞比例均低于对照组（均 P < 0.05）。紫檀芪作用48 h后，0 ~ 100 μmol/L组细胞凋亡率分别为11.58% ± 0.50%、14.66% ± 0.22%、13.50% ± 0.49%、14.56% ± 0.19%、15.30% ± 0.76%，各紫檀芪组均高于对照组（均 P < 0.05）。紫檀芪作用24 h后细胞MDC染色显示，对照组中仅有少量H8细胞检测到高亮点状荧光，各紫檀芪组高亮点状荧光的自噬小体较对照组增多。Western印迹显示，紫檀芪作用24 h、48 h后各组细胞cyclinD1、caspase3、caspase9、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62、E6、E7蛋白相对表达水平差异均有统计学意义（均 P < 0.05）。与对照组比较，紫檀芪处理后cyclinD1表达降低，caspase3、caspase9表达升高，Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62升高，E6、E7表达降低（个别浓度组与对照组比较 P > 0.05，多数组间比较 P < 0.05）。 结论:紫檀芪可抑制H8细胞增殖，促进其凋亡和自噬，抑制E6、E7致癌基因的表达。

目的:评价艾司氯胺酮对大鼠脓毒症急性肾损伤(AKI)的影响及自噬在其中的作用。方法:SPF级健康雄性成年SD大鼠40只，体重200~240 g，采用随机数字表法分为5组( n＝8)：对照组(Con组)、艾司氯胺酮组(Con+Ket组)、脓毒症组(LPS组)、脓毒症+艾司氯胺酮组(LPS+Ket组)和脓毒症+艾司氯胺酮+3-甲基腺嘌呤组(LPS+Ket+3MA组)。采用腹腔注射LPS制备脓毒症大鼠AKI模型，Con组腹腔注射生理盐水10 ml/kg；Con+Ket组腹腔注射生理盐水10 ml/kg，30 min后尾静脉注射艾司氯胺酮10 mg/kg；LPS组腹腔注射LPS 10 mg/kg；LPS+Ket组腹腔注射LPS 10 mg/kg，30 min后尾静脉注射艾司氯胺酮10 mg/kg；LPS+Ket+3MA组腹腔注射LPS 10 mg/kg，30 min后尾静脉注射艾司氯胺酮10 mg/kg和3-MA 15 mg/kg。腹腔注射LPS后24 h时麻醉大鼠，随后处死取肾组织，观察病理学结果，采用ELISA法测定核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1、IL-1β和IL-18的含量，采用Western blot法检测LC3、P62和Beclin-1的表达。 结果:与Con组比较，LPS组肾组织病理学损伤评分、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18含量升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，Beclin-1表达下调，P62表达上调( P<0.05)；与LPS组比较，LPS+Ket组肾组织病理学损伤评分、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18含量降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，Beclin-1表达上调，P62表达下调( P<0.05)；与LPS+Ket组比较，LPS+Ket+3MA组肾组织病理学损伤评分、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18含量升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，Beclin-1表达下调，P62表达上调( P<0.05)。 结论:艾司氯胺酮可减轻大鼠脓毒症AKI，自噬参与了这一过程，与抑制NLRP3炎症小体活化，降低炎症反应有关。