目的:探究孕期慢性应激对子代雌性大鼠抑郁行为及海马组织印记基因胰岛素样生长因子-2 (insulin-like growth factor-2，IGF-2)/长链非编码RNA(lncRNA)H19甲基化的影响。方法:32只SPF级雌性SD大鼠按照随机数字表法分为模型组和对照组，模型组大鼠采用慢性不可预知性温和应激(chronic unpredictable mild stress model，CUMS)方法建立抑郁模型，对照组正常饲养。应激刺激第7天时，雌雄鼠合笼交配。在应激刺激前1 d和应激刺激第1、7、14、21、28天对两组母鼠行内眦静脉采血，测定血浆皮质酮浓度；在雌性仔鼠出生后第28天和出生后第42天时，每组随机抽取8只，行内眦静脉采血后测定血浆皮质酮浓度；在出生后第42天时，分别通过糖水偏爱实验、悬尾实验和强迫游泳实验测定两组雌性仔鼠的抑郁样行为。采用RT-PCR和Western blot法检测仔鼠海马组织中IGF-2/H19及相关转移酶表达情况。利用Methyl Target技术，对IGF-2差异性甲基化区域(differentially methylated region，DMR)片段2的19个CpG位点，H19印记控制区(imprinting control region，ICR)片段1中8个CpG位点和H19-ICR片段2的15个CpG位点，同时捕获测序，计算每个CpG位点甲基化水平。采用SPSS 26.0，采用重复测量方差分析、 t检验和非参数检验对相关数据进行统计分析。 结果:(1)重复测量方差分析结果显示，母鼠血浆皮质酮的时间与组别的交互效应不显著( F＝2.997， P＝0.066)，时间主效应显著( F＝4.44， P＝0.010)，组别主效应显著( F＝41.40， P＝0.001)。组间因素的单独效应分析，在应激第14、21、28天，模型组母鼠血浆皮质酮浓度均高于对照组母鼠(均 P<0.001)。(2)在糖水偏爱实验中，模型组雌性仔鼠的液体总消耗[11.10(10.38，11.58)mL，13.55(12.00，15.77)mL， Z＝－3.055， P＝0.002]、1%蔗糖水消耗[(5.50±1.30)mL，(8.56±2.04)mL， t＝－3.582， P＝0.003]及1%蔗糖偏爱百分比[(51.35±8.69)%，(62.11±8.05)%， t＝－2.576， P＝0.022]均低于对照组。(3)模型组雌性仔鼠悬尾实验中静止持续时间[(126.95±39.89)s，(54.30±25.00)s， t＝4.375， P＝0.001]和强迫游泳实验中持续不动时间[(7.97±6.66)s，(1.85±2.12)s， t＝2.478， P＝0.037]均长于对照组。(4)模型组雌性仔鼠海马组织IGF-2 mRNA[(0.46±0.24)，(1.00±0.00)， t＝3.821， P＝ 0.019]、H19 mRNA[(0.60±0.25)，(1.00±0.00)， t＝3.574， P＝0.007]表达均低于对照组；模型组雌性仔鼠IGF-2蛋白相对表达低于对照组[(0.77±0.04)，(1.00±0.00)； t＝9.876， P＝0.01)；CCTC结合因子(CCTC-binding factor，CTCF)的mRNA[(1.29±0.12)，(1.00±0.00)， t＝－4.850， P＝0.003]和蛋白相对表达水平[(1.90±0.28)，(1.00±0.00)， t＝－5.513， P＝0.005]均高于对照组。(5)模型组雌性仔鼠海马组织IGF-2 DMR区域3个CpG位点甲基化水平均低于对照组( t＝－3.21，－3.00，－3.34，均 P<0.05)，分别位于chr1215831028、chr1215831055和chr1215831205；IGF-2 DMR片段甲基化水平低于对照组( t＝－3.453， P＝0.048)；模型组雌性仔鼠甲基转移酶DNMT3A mRNA( t＝5.102， P＝0.002)、DNMT3A( t＝10.213， P<0.001)和DNMT3B( t＝4.169， P＝0.014)蛋白相对表达水平均低于对照组。 结论:孕期慢性应激致雌性仔鼠出现抑郁、绝望状态，其机制可能与甲基化转移酶表达降低引起印记基因IGF-2 DMR甲基化水平降低有关。

CCCTC结合因子(CCCTC binding factor, CTCF)是一种转录因子，含有11个高度保守锌指结构，是构建染色体拓扑结构域的主要因子，在细胞增殖分化中发挥重要作用。CTCF结合位点主要分布于染色体拓扑结构域的边界，维持其结构和功能稳定，隔绝结构域内外的编码基因和启动子间的相互作用。近年研究表明CTCF调控基因的时空特异性表达，在哺乳动物的生长发育过程中发挥重要作用。本文就近几年CTCF在哺乳动物多个系统发育过程中的功能研究作一综述。

染色质互作是真核生物基因组组装的基础,并且在调控真核基因细胞特异性表达中发挥重要作用.染色质互作的发生与特定的蛋白质有关,目前已经发现CTCF(CCCTC binding facor,转录阻抑物)和黏连蛋白与染色质互作相关,然而并不清楚是否还有其他蛋白质参与染色质互作.我们将整合高通量染色体构象捕获(Hi-C)和染色质免疫沉淀-测序(ChIP-seq)数据,在GM12878和K562细胞系中挖掘与染色质互作相关的转录因子,并对发现的转录因子做功能分析.我们在频繁发生互作的染色质位点中发现RUNX3、SPI1等转录因子也可能参与染色质互作.另外,通过FP-growth的数据挖掘方法还发现多个转录因子可能协同作用参与染色质互作.研究结果将为染色质互作相关实验的开展提供先验知识.

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)是一类重要的Ⅱ相药物代谢酶,通过葡萄糖醛酸接合反应代谢大量内外源小分子化合物,对机体维持内部动态平衡具有重要意义.UGT基因突变或表达异常会造成高胆红素血症等多种疾病、影响药物疗效或减弱代谢药物能力,因此探索UGT表达调控机制将会为人类疾病的预防和个体化医疗以及精准医学提供科学依据.脊椎动物UGT分为UGT1和UGT2两个亚家族,UGT1基因簇结构与原钙粘蛋白(protocadherin,Pcdh)、免疫球蛋白或B细胞受体(immunoglobulin or B-cell receptor)、T细胞受体(T-cell receptor)基因簇类似,但与UGT2结构不同,分为可变区和恒定区,可变区包含成串排列的外显子,任意一个外显子都可以被可变剪接到下游同一套恒定区外显子上,形成9种UGT1信使RNA并翻译成不同UGT1葡醛酸转移酶亚型.本实验室前期工作发现,染色质架构蛋白CTCF结合DNA的方向性在染色质三维结构构建中发挥重要作用.基于此,为了进一步解析UGT1复杂基因簇的三维转录调控机制,本研究分析和比较了人和小鼠UGT1基因簇的CTCF结合位点(CTCF binding site,CBS)的方向性分布,发现人和小鼠的UGT1基因簇中CBS分布差异很大.以人肺癌细胞系A549为模型,通过RNAi敲低细胞中CTCF和SMC3(cohesin亚基),证明了CTCF和cohesin蛋白参与调控人UGT1基因簇的转录表达.进一步采用CRISPR介导的DNA片段编辑技术对hCBS1进行了原位反转(in situ inversion)和删除,并通过RNA-seq分析技术发现hCBS1删除能够显著降低UGT1A6、UGT1A7和UGT1A9的表达水平,然而hCBS1反转仅仅显著降低UGT1A7的表达水平.上述研究表明hCBS1参与UGT1A6、UGT1A7和UGT1A9的转录调节,是人UGT1基因簇的潜在转录调控元件.本研究为未来进一步探索UGT1基因簇的三维基因转录调控机制提供了实验基础.

目的 利用生物信息学技术分析及预测人丝裂原活化蛋白激酶相关蛋白1(MAPKAP1)基因表达有关的转录调控机制,为深入研究人MAPKAP1基因与肝癌的关系提供基础.方法 从美国国家生物技术信息中心在线核苷酸数据库(Gene Bank)检索人MAPKAP1基因,获得其基因启动子区序列;通过在线软件预测分析启动子区转录因子结合位点,应用在线基因数据库Liveratlas提取肝癌组织中表达上调的基因,取交集获得目标转录因子.通过TCGA数据库提取筛选出的转录因子与MAPKAP1的肝癌基因芯片表达结果 ,采用GraphPad Prism 5统计软件行相关性分析.结果人MAPKAP1基因在肝脏及肝癌中转录本全长1689 bp,位于转录起始位点-1470 bp至+218 bp.取交集获得目标转录因子共有13个,即C/EBP、CNBP、CTCF、DBP、IRF2、LEF1、NF1、NFKB1、PAX8、SMAD4、Sp3、SRF、YY1.相关性分析显示,转录因子C/EBP、DBP、LEF1与MAPKAP1表达呈正相关(r分别为0.1513、0.2356、0.1553,P均﹤0.01),CNBP、CTCF、IRF2、NF1、NFKB1、PAX8、SMAD4、Sp3、SRF、YY1与MAP-KAP1表达无明显相关(P均﹥0.05).结论 通过生物信息学技术分析及预测,在人肝癌中C/EBP、DBP、LEF1与MAPKAP1表达呈正相关,这些转录因子可能参与MAPKAP1基因表达的转录调控.

[背景]人细小病毒B19是可以感染并引起人类疾病的两种细小病毒科成员之一.B19病毒的唯一启动子p6负责病毒RNA的转录.研究表明p6启动子活性与其转录因子结合位点以及B19病毒NS1蛋白的调节有关.但是,关于其他重要位点和B19病毒蛋白是否也具有影响p6启动子活性的作用还未有报道.[目的]探究影响p6启动子活性的重要因素,并明确B19病毒11kD蛋白与p6启动子及细胞因子启动子的调控关系.[方法]通过生物信息方法预测分析p6启动子转录结合位点及其CpG位点,利用体外甲基化分析CpG位点对p6启动子活性的影响.同时,利用增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和荧光素酶报告系统分析影响p6启动子活性的转录因子结合区域以及11kD蛋白对p6启动子和细胞因子启动子的影响.[结果]p6启动子在不同非敏感细胞系中均有较高活性,并且其302-479区段的转录结合位点CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)、阴阳因子(Yin Yang 1,YY1)、信号传导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、Sp1/3和E2F转录调节因子7(E2F transcription factor 7,E2F7)对维持启动子活性很重要.同时,p6启动子活性可被其CpG位点的甲基化修饰所抑制,但不被11 kD蛋白所调控.然而11kD蛋白却能显著上调肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素6(interleukin 6,IL6)、STAT3启动子的活性.[结论]本研究明晰了B19病毒p6启动子的潜在转录因子结合位点和CpG位点对维持其启动子活性的重要性,并进一步揭示了非结构蛋白11kD与p6启动子以及细胞内因子启动子的关系,推测11kD蛋白可能通过影响细胞内相关因子的表达,进而在B19病毒与细胞相互作用过程中扮演重要角色.

基因的表达调控与基因组在细胞核内的三维空间架构相辅相成,原钙粘蛋白(protocadherin,Pcdh)基因簇在大脑发育中起到关键作用,可以作为研究基因表达调控机制的模式基因.转录因子RFX5(regulatory factor x 5)是翼螺旋家族(winged HLH family)的成员,其蛋白由寡聚化结构域、DNA结合域、螺旋结构域和激活域组成,在调控免疫系统的主要组织相容性复合物II类(major histocompatibility complex class II,MHC II)的表达中起着至关重要的作用.本研究发现RFX5与CTCF在全基因组上结合的位点有部分重叠,利用CRISPR/Cas9 DNA大片段编辑技术,构建了RFX5基因缺失的HEC-1-B细胞系.通过RNA-seq实验,发现RFX5敲除能够显著升高Pcdhα6、Pcdhα12、Pcdhαc2的表达水平.通过ChIP-nexus实验,发现敲除RFX5导致染色质架构蛋白CTCF和cohesin在原钙粘蛋白 α 基因簇处的结合增加.最后,染色质构象捕获QHR-4C实验发现Pcdhα6、Pcdhα12启动子与远端增强子HS5-1的染色质远距离相互作用增强.上述研究表明RFX5蛋白可能通过调控染色质高级结构影响原钙粘蛋白α基因簇的表达,为未来进一步探索RFX5的功能提供了参考.

目的 探讨lncRNA DLEU2转录调控因子的结构特征及其与lncRNA DLEU2结合位点.方法 利用生物信息学工具分析lncRNA DLEU2转录调控因子的理化性质、结构、跨膜区、信号肽和亚细胞定位,预测转录因子与lncRNA DLEU2的结合位点.结果 等电点分析表明转录调控因子CTCF、MAX、ELF1、YY1、USF1等电点小于7.0,POLR2A、FOXA1、BHLHE40、CEBPB、ATF3等电点大于7.0;脂溶指数分析显示,上述10个转录调控因子的脂溶指数均小于100,均为疏水性蛋白;不稳定指数分析结果显示,本研究中10个转录调控因子的不稳定指数大于40,均为不稳定蛋白;上述所有转录调控因子二级结构均由α-螺旋、无规则卷曲和扩展链结构3种形式组成;上述转录调控因子中并未发现跨膜蛋白和信号肽结构;亚细胞定位分析发现,除YY1定位为细胞质中,其他转录因子均位于细胞核;同时预测出上述10个转录调控因子与lncRNA DLEU2的结合位点.结论 lncRNA DLEU2转录调控因子呈现多样性特征,可能有助于对lncRNA DLEU2转录表达调控机制的深入研究,研究结果将有助于开展基于lncRNA DLEU2相关癌症治疗药物的筛选.

印记位点调节物兄弟因子BORIS,在脊椎动物的进化过程中从羊膜动物开始出现.人正常生理状态下,该蛋白仅在男性睾丸中高表达.雄性小鼠中BORIS的表达时序与精子发生时序高度一致,BORIS基因敲除小鼠雄性不育,而雌性生长发育正常.BORIS诱导生殖细胞中特定基因的表达,在精子发生中起重要作用.BORIS在正常生理条件下特异性地调控精子发生.本文在综述近年来BORIS转基因小鼠、BORIS基因敲除小鼠、睾丸中BORIS的表达和机制研究的基础上,总结了BORIS的表达定位、BORIS对精子发生的作用机制、BORIS功能研究和靶向药物研究,为针对BORIS的分子靶向治疗提供新的参考依据.

CTCF(CCCTC-binding factor)是一种重要的染色质架构蛋白,其与绝缘子的方向性结合在哺乳动物基因组三维空间结构形成和维持中起着至关重要的作用.正向–反向相对方向的CTCF结合位点(简称CTCF位点)可以在染色质黏连蛋白(cohesin)的协助下,形成染色质环,介导远距离DNA元件之间的相互作用;而在染色质拓扑结构域边界区域的CTCF位点呈现反向–正向相背方向分布,发挥绝缘子的功能.为进一步研究CTCF介导染色质环的形成与其绝缘功能之间的关系,本研究采用DNA片段编辑方法通过设计成对sgRNA(dual sgRNA)构建了一系列HOXD基因簇区域CTCF位点反转的单细胞克隆.定量高分辨率染色质构象捕获实验显示边界区域CTCF位点反转会改变原有的染色质环方向,通过环挤出模型(loop extrusion)形成新的染色质环,引起染色质拓扑结构域边界漂移至新形成的一对反向–正向CTCF位点处.此外,串联排列的CTCF位点可以通过阻碍反方向渗透的黏连蛋白继续滑动发挥绝缘子的功能.RNA-seq实验发现CTCF位点反转引起的局部基因组空间结构变化会进一步影响基因的表达.上述研究表明相邻两个染色质拓扑结构域边界区域的反向-正向CTCF位点可以通过与各自所在拓扑结构域内相向的CTCF位点形成染色质环,阻碍黏连蛋白滑动,该发现为进一步研究CTCF的绝缘功能和其对基因组拓扑结构的影响提供了参考.