目的:了解滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物斑点热群立克次体（spotted fever group Rickettsiae，SFGR）和莫氏立克次体（ Rickettsia mooseri， R.mooseri）感染情况。 方法:应用磁珠法提取2015-2016年自滇西梁河县、剑川县和玉龙县鼠疫疫源地捕获的2 512只野外鼠形动物肝脏样本DNA，选用热休克蛋白groEL基因引物进行巢式PCR扩增。分别采用DNAStar 7.1软件和美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank进行基因序列剪切、拼接和Blast同源性比对分析，同时采用DNAStar 7.1软件和MEGA 6.0软件构建系统发育树。结果:感染SFGR的野外鼠形动物有锡金小鼠、斯氏家鼠、灰麝鼩和臭鼩鼱（各1只），总感染率为0.16%（4/2 512）；未检出 R.mooseri感染。梁河县和剑川县鼠疫疫源地野外鼠形动物SFGR感染率分别为0.49%（3/611）和0.10%（1/1 029），玉龙县鼠疫疫源地野外鼠形动物未检出SFGR感染。同源性分析显示，SFGR阳性样本的基因序列与参考序列同源性为95.45%~100.00%；4份阳性样本间groEL基因部分序列高度相似，同源性达89.60%~97.40%。序列进化分析显示，梁河县鼠疫疫源地的3个SFGR阳性样本序列聚在同一分支，同源性达94.40%~97.40%；剑川县鼠疫疫源地的1个阳性样本序列单独为1个分支。 结论:滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物SFGR感染率较低，未发现 R.mooseri感染。

目的:建立及优化检测立克次体目中7种重要病原菌的TaqMan-探针实时荧光定量PCR（qPCR）方法，可同步检测并明确感染类型。方法:根据普氏立克次体、莫氏立克次体和斑点热群立克次体 ompB基因、恙虫病东方体 groEL基因、查菲埃立克体16S rRNA基因、嗜吞噬细胞无形体 gltA基因和贝氏柯克斯体 com1基因序列合成引物和探针，优化反应体系及反应程序至同一方案，对该方法灵敏度、特异性和重复性等进行评价，并使用该方法对模拟样本和实际样本进行检测。 结果:7种病原菌标准曲线的 Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系（均 R2>0.990 0），所建立方法最低检测限均为1×10拷贝数/μl且具有良好的特异性。96份蜱虫核酸提取物样本中，1份样本检出贝氏柯克斯体，3份样本检出斑点热群立克次体；80份不明原因发热患者血标本DNA中，1份样本检出恙虫病东方体，2份样本检出斑点热群立克次体。 结论:本研究基于TaqMan-探针qPCR方法，将7种病原菌反应体系及反应程序优化至同一方案，克服目前不同立克次体目病原菌采用不同的反应体系和反应程序的缺点，可将临床样本中立克次体目的7种重要病原菌精确定位检测至种，明确感染病原菌类型并缩短检测时间，有助于对患者的精准诊治。

目的:研究海南牛体表蜱虫的种类及蜱携带无形体属病原体的情况.方法:本研究选取海南中北部9个县市为样本采集点,从牛体表采集蜱虫样本.通过形态学观察和分子生物学技术进行蜱种鉴定,并以16S rRNA、groEL和gltA为靶基因,利用PCR方法检测蜱虫携带无形体属病原体情况.并进一步采用系统发育分析方法,揭示海南牛体表蜱虫携带的无形体属病原体种间关系.结果:本研究共采集335只蜱虫,包括血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)44只、微小扇头蜱(Rhipicephalus microplus)291只.PCR检测结果表明,该地区蜱中存在候选博莱无形体(Candidatus Anaplasma boleense)、边缘无形体(Anaplasma marginale),阳性率分别为0.60%(2/335),0.90%(3/335).系统发育分析结果表明,本实验获得的无形体与已知的无形体同源性较高.结论:海南中北部地区牛体表的优势蜱种为微小扇头蜱,并且蜱虫携带无形体属病原体,本研究为该地区无形体病的预防和治疗提供了重要的数据支撑.

目的 了解辽宁省2021-2022年食品中蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)污染状况、携带的毒力因子及药物敏感性的特征.方法 对辽宁省2021-2022年分离自15个监测点4大样品种类共620份样品,应用GB4789.14-2014进行分离鉴定蜡样芽胞杆菌,并用PCR方法进行菌群特异性基因groEL和gyrB及11种毒力基因检测;采用微量肉汤稀释法检测菌株对抗生素的敏感性.结果 79株蜡样芽胞杆菌都检出了蜡样芽胞杆菌毒力基因,占比较大的分别是非溶血性的肠毒素nheC、nheA和nheB,检出率分别是100.0％(79/79)、93.3％(74/79)和83.5％(66/79),肠毒素entFM基因检出率98.7％(78/79).79株餐饮食品中蜡样芽胞杆菌携带19种毒力基因模式,基因模式中Ⅸ和ⅩⅦ比例最多占到16.5％(13/79).79株蜡样芽胞杆菌对氨苄西林、青霉素耐药率均为100.0％,对氯霉素、庆大霉素耐药率均为0;对其他6种抗菌药物的耐药率分别为:复方磺胺甲恶唑65.8％(52/79)、亚胺培南10.1％(8/79)、红霉素73.4％(58/79)、克林霉素60.8％(48/79)、环丙沙星75.9％(60/79)、四环素耐药率70.9％(56/79).结论 辽宁省餐饮食品存在蜡样芽胞杆菌污染,分离株至少携带4种以上毒力基因,约100％的菌株对氨苄西林、青霉素具有耐药性,对氯霉素、庆大霉素抗菌药物敏感性高,应加强主动监测,及时针对性的防控干预,为日后的溯源研究提供理论依据.

目的 克隆、表达和纯化结核分枝杆菌H37Ra株GroEL2蛋白,并进行生物信息学分析.方法 以结核分枝杆菌H37Ra株基因组DNA为模板,PCR扩增GroEL2基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组pET-28a-GroEL2载体,将其转化至BL21(DE3)菌株中,在异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达后,利用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酷胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳分析表达产物,镇-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱纯化重组GroEL2蛋白,Western blot鉴定GroEL2的表达效果.利用生物信息学方法对GroEL2蛋白的理化性质、蛋白结构、抗原表位等进行预测.结果 成功构建重组pET-28a-GroEL2表达载体,在大肠杆菌中以可溶形式表达GroEL2蛋白.Ni-IDA亲和层析柱纯化重组GroEL2蛋白,纯度达90％以上.生物信息学分析显示其能与多种蛋白相互作用,且存在多个潜在的T细胞、B细胞抗原表位.结论 重组GroEL2蛋白具有良好的免疫反应性,可能是结核病新型疫苗和诊断方法开发的新靶点.

目的 调查广东省广州市鼠形动物携带新埃立克体的情况,并分析其分子特征.方法 使用夹夜法和笼夜法在广州市9个区捕获鼠形动物,解剖获得鼠脾,通过巢式聚合酶链式反应(PCR)扩增16S rRNA和groEL基因,纯化、测序后进行序列比对和同源性分析.结果 捕获广州市鼠形动物1 104只,其中29只新埃立克体检测阳性,总阳性率2.63％.2019、2020、2021年捕鼠数分别为510、307、287只,阳性率分别是0.39％、0.98％、8.36％.阳性鼠形动物集中于广州市从化区(9.00％)、增城区(3.23％)、白云区(0.86％).调查的6种鼠形动物中,以黄胸鼠(7.69％)检出率最高,其次为褐家鼠(2.87％)、黄毛鼠(1.11％).系统进化分析显示广州市新埃立克体的groEL与16S rRNA基因序列均高度同源,属于Cluster Ⅳ这一进化支.结论 广州市鼠形动物存在一定比例的新埃立克体检出,且检出阳性的区域集中,基因序列高度同源,可能存在新埃立克体的潜在爆发风险,需进一步加强其分子流行病学监测工作.

目的 了解我国内蒙古自治区(内蒙古)森林革蜱感染立克次体、无形体及埃立克体等病原体情况,并研究其遗传多样性.方法 在内蒙古乌兰察布市四子王旗、呼和浩特市土默特左旗家畜体表采集寄生婢成蜱76只,经形态学和分子生物学鉴定后,用针对16S rRNA基因和柠檬酸合成酶基因(gltA)保守区域的引物同时检测立克次体,用针对16SrRNA基因的属特异性引物检测埃立克体、无形体.对检出的阳性样本,使用巢式PCR扩增获得gltA和热休克蛋白基因(groEL).用PhyML 3.0软件进行最大似然法进化树构建.结果 采获蜱经鉴定均为森林革婢.从上述采集蜱中检出立克次体阳性8份,其中四子王旗6份(6/35,17.14％),土默特左旗2份(2/41,4.88％),测序结果显示均为劳氏立克次体.对3个基因序列的进化分析,上述菌株分成2个不同的分支,当地流行的劳氏立克次体有一定遗传多样性.未检出埃立克体和无形体.结论 内蒙古的革蜱中存在劳氏立克次体的流行,且存在一定遗传多样性.劳氏立克次体为人类病原体,在内蒙古局部地区较高的阳性率提示可能存在感染人的风险.

目的 对云南省永善县恙虫病开展流行病学调查.方法 应用胶体金免疫试验对发热患者血清进行恙虫病东方体(Orientia tsutsugamsushi)IgG和 IgM抗体检测,采用夜夹法诱捕调查地区鼠类,用巢氏 PCR方法对鼠脾脏做groEL 基因片段扩增和基因序列分析.结果 2015年5-10月在永善县发现恙虫病患者34例,其中实验室确诊病例21例,临床诊断病例13例;主要发病于8月,占总病例数的32.35%;40—49岁年龄组发病最多,占总病例数的32.35%;农民发病数最多,占总病例数的79.41%;有焦痂或溃疡的病例占总病例数的94.12%,其中位于腹股沟最多(占有焦痂或溃疡患者的31.25%);有皮疹的病例占总病例数的50.00%.在捕获的39 份黄胸鼠(Rattus flavipectus)脾组织样品中,恙虫病东方体groEL基因片段扩增阳性 9 份(阳性率 23.08%).groEL基因片段序列进化树分析显示本次检测到的 YSP30 株与的 HSB1、FAR1、UAP4 等Saitama型菌株的遗传进化关系最密切,检测到的其余8株与 UT213、UT221、SH205等 Karp 型菌株的遗传进化关系最密切.结论 血清学和分子生物学方法证实了永善县存在恙虫病疫源地,当地存在 Karp 和 Saitama相关的2种基因型恙虫病东方体.

目的 了解浙江中部啮齿动物中恙虫病东方体的自然感染状况及其分子生物学特性.方法 2015年3—11月在义乌地区3个自然村的野外和居住地捕获啮齿动物687只;取肝脾行PCR检测恙虫病东方体groEL基因并测序;采用MEGA7.0软件最大似然法进行系统发生聚类分析,采用RelTime方法生成的时间树比较义乌菌株序列与祖先分歧的发生时间.结果 687只啮齿动物检出恙虫病东方体感染26只,总体感染率为3.78％,其中3—7月捕获的352只groEL基因均阴性,8—11月份捕获的335只中有26只阳性.9—10月份感染率较高,分别为11.32％(6/53)和10.00％(9/90).感染率总体呈上升趋势(x2趋势=25.85,P<0.01).4个优势鼠种黑线姬鼠、黑腹绒鼠、针毛鼠和臭鼩鼱存在恙虫病东方体感染,黑线姬鼠感染率最高为8.67％(13/150).26只阳性动物中,25只捕获于野外,25只捕获于大陈镇.系统发生分析表明义乌地区啮齿动物中恙虫病东方体groEL基因变异较大,可能存在Kato、Boryong、O3和其他尚不能确定的基因型,时间树分析显示义乌不同菌株出现的时间不一致.结论 浙江中部啮齿动物中存在恙虫病东方体感染,其groEL基因分布在不同支系.

目的 研究分子伴侣共表达对重组牛成纤维细胞生长因子-2(recombinant bovine fibroblast growth factor-2,rbFGF-2)表达水平及生物活性的影响.方法 根据大肠埃希菌密码子使用偏好性,设计合成rbFGF-2核苷酸序列全长,构建表达rbFGF-2的载体pET-15b-rbFGF-2.将编码伴侣蛋白GroES-GroEL的质粒pGro7和载体pET-15b-rbFGF-2先后转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中进行共表达.表达产物进行Western blot鉴定,经Ni-Agarose亲和层析纯化后,MTS法测定其生物学活性.结果 酶切鉴定和测序结果证实,rbFGF-2基因序列与设计序列相同,且在Nde I和BamH I位点连入表达载体.表达的rbFGF-2蛋白相对分子质量约21 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的37.8％,可与牛FGF-2单克隆抗体特异性结合;纯化后,SDS-PAGE检测其纯度超过95％.含有共表达系统的大肠埃希菌中rbFGF-2蛋白表达量为仅含表达载体的大肠埃希菌的2.28倍.在6.25 ng/ml浓度时,rbFGF-2蛋白具有显著的促细胞增殖作用.结论 分子伴侣GroES-GroEL共表达能够显著提高rbFGF-2蛋白的表达水平及其生物活性.