目的 探究糖尿病小鼠来源的骨髓间充质干细胞及其旁分泌作用在诱发胰岛素抵抗(IR)中扮演的角色.方法 建立小鼠糖尿病模型,提取并培养骨髓间充质干细胞(BMSC),收集培养上清液(M-BMSC-CS).①细胞实验:将HepG2肝细胞分为正常低糖培养组[用低糖DMEM(5.55 mmol·L-1)进行培养]、M-BMSC-CS实验组(M-BMSC-CS 75 μL)、高糖高脂对照组(给予25 mmol·L-1高糖DMEM+0.25 mmol·L-1棕榈酸).②动物实验:小鼠分为正常小鼠组(腹腔注射等体积0.9％NaCl)和M-BMSC-CS-m组(M-BMSC-CS通过腹腔注射给予正常小鼠,注射剂量0.2 mI/10 g).用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖摄取量,用免疫荧光法检测Glut2蛋白荧光强度,用蛋白质印迹法检测胰岛素信号通路蛋白表达;检测口服葡萄糖耐量(OGTT)和胰岛素耐量(ITT).结果 正常低糖培养组、M-BMSC-CS实验组和高糖高脂对照组的葡萄糖摄取量分别为(2.96±0.05)、(1.64±0.28)和(1.42±0.32)mmol·L-1,葡萄糖转运蛋白 2(Glut2)荧光表达分别为53.21±2.70、30.95±3.39 和 34.96±7.60,磷酸化胰岛素受体底物1-ser307(p-IRS-1ser307)表达蛋白相对水平分别为0.46±0.21、1.09±0.24和0.91±0.16,磷酸化蛋白激酶(p-AKT)蛋白相对表达水平分别为0.94±0.05、0.59±0.06和0.53±0.05,Glut2蛋白表达水平分别为 1.08±0.14、0.58±0.14 和 0.62±0.09;M-BMSC-CS 实验组的上述指标与正常低糖培养组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).正常小鼠组和 M-BMSC-CS-m 组空腹血糖分别为(5.23±0.57)和(9.30±1.14)mmol·L-1,p-AKT蛋白相对表达水平分别为1.27±0.21和0.51±0.19,Glut2蛋白相对表达水平分别为1.17±0.17和0.79±0.09;M-BMSC-CS-m组的上述各指标与正常小鼠组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 糖尿病小鼠来源的BMSC培养上清液在体外引起正常HepG2肝细胞胰岛素抵抗,在体内诱发正常小鼠胰岛素抵抗.

目的 金芪降糖片改善 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠肝脏胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)作用及作用机制.方法 高脂饲料喂养联合链脲佐菌素注射建立T2DM IR模型.T2DM大鼠随机分为模型组、二甲双胍组、金芪降糖片组,干预 7 周.观察各组大鼠体质量、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血红蛋白(hemoglobin a1c,HbA1c)、空腹胰岛素(fasting blood insulin,FINS)、血脂[总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)]、血清氧化应激指标[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)]、肝功能[谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)]、胰岛素抵抗指数(homeostatic model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)变化.用苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察胰腺、肝组织形态病理学,肝糖原染色(periodic acid schiff,PAS)观察肝糖原含量.免疫蛋白印迹法检测肝组织腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、p-AMPK(Thr172)、还 原 型 辅 酶 Ⅱ 氧 化 酶-4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase type 4,NOX4)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS1)、p-IRS-1(Ser307)蛋白表达情况.结果 与空白对照组比较,模型组大鼠体质量明显下降(P<0.05),FBG及 HbA1c、FINS、HOMA-IR、TC、TG显著升高(P<0.05);SOD、GSH 明显降低而MDA明显升高(P<0.05);ALT、AST无统计学差异(P>0.05);p-AMPK(Thr172)蛋白表达下调而NOX4、p-IRS-1(Ser307)蛋白表达上调(P<0.05).与对照组比较,模型组大鼠胰岛数目减少,分布稀疏,部分胰岛组织萎缩;肝细胞索排列紊乱,肝细胞多数肿胀,出现中到重度脂肪变性、空泡变性;胞质内糖原颗粒分布明显减少,部分肝细胞甚至出现糖原颗粒缺失.与模型组比较,金芪降糖片组大鼠体质量无明显变化(P>0.05);金芪降糖片、二甲双胍组大鼠FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR水平均明显降低(P<0.05),两给药组间无统计学差异(P>0.05);金芪降糖片组SOD、GSH显著升高且MDA明显降低(P<0.05),二甲双胍组MDA明显下降(P<0.05),SOD、GSH与模型组无统计学差异(P>0.05);各组ALT、AST比较无统计学差异(P>0.05);金芪降糖组TC、TG明显低于模型组(P<0.05),而LDL-C、HDL-C与模型组比较无统计学差异(P>0.05),二甲双胍组血脂与模型组比较无统计学差异(P>0.05);金芪降糖片组、二甲双胍组p-AMPK(Thr172)蛋白表达上调而NOX4、p-IRS-1(Ser307)蛋白表达下调(P<0.05).与模型组比较,各药物干预组大鼠胰岛数目及胰岛内细胞数目增加,胰岛萎缩好转;肝细胞排列较为均匀有序,细胞水肿及脂肪变性明显减轻;肝细胞糖原颗粒均呈增加趋势.结论 金芪降糖片可显著改善T2DM大鼠肝脏IR,减轻氧化应激损伤,作用机制可能与激活AMPK/NOX4/IRS1 信号通路有关.

目的:探讨小檗碱对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)所致人肝癌细胞株HepG2胰岛素抵抗的缓解作用及分子机制.方法:采用10ng/mL TNF-α诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗,同时以1 μmol/L小檗碱处理细胞,通过Western blotting检测胰岛素通路信号分子(IRS1、AKT)和TNF-α通路信号分子(Traf2、MEKK1、MEK1/2、ERK1/2)的蛋白表达.此外,通过过表达或抑制TNF-α通路的信号分子(MEK1、ERK2)进一步探讨小檗碱靶点.结果:TNF-α抑制HepG2细胞AKT(Thr308、Ser473位点)和IRS1(酪氨酸位点)的磷酸化(＜0.05),促进IRS1 (Ser307位点)和ERK1/2的磷酸化(P＜0.05),而这一作用能够被小檗碱所逆转(P＜0.05).同时,TNF-α对AKT活性的抑制作用能够被ERK1/2或MEK1/2的抑制剂拮抗(P＜0.05).此外,小檗碱并不能改善持续激活型ERK2 (CA)或MEK1 (CA)对胰岛素通路的抑制作用(P＞0.05),但是能阻碍Traf2与MEKK1的相互作用(P＜0.05).结论:小檗碱通过抑制Traf2-MEKK1-MEK-ERK通路改善TNT-α诱导的胰岛素抵抗.

目的 探讨御唐丸对糖尿病大鼠胰腺组织胰岛素受体底物-1(IRS-1)基因表达和蛋白磷酸化的影响.方法 将150只SD大鼠按体重分层随机分为空白组(20只)及造模组(130只).用高脂饲料连续喂养造模组大鼠10周制备2型糖尿病大鼠模型,按随机数字表法分为模型组、糖尿乐组、御唐丸高剂量组、御唐丸低剂量组及格华止组,每组20只.按大鼠与成人等效剂量折算,御唐丸高剂量组给予御唐丸2.70 g/(kg·d),御唐丸低剂量组给予御唐丸1.35 g/(kg·d),糖尿乐组给予糖尿乐2.43 g/(kg·d),格华止组给予格华止0.09 g/(kg·d),模型组及空白组给予生理盐水2 mL/d.连续灌胃给药8周后取大鼠胰腺组织,用Real-time PCR方法检测IRS-1 mRNA表达水平,用Western blot法检测IRS-1蛋白表达及磷酸化水平.结果 与模型组比较,格华止组、糖尿乐组、御唐丸低剂量组及御唐丸高剂量组IRS-1 mRNA的相对表达量均有所增加(P＜ 0.05或P＜0.01),且御唐丸高剂量组IRS-1 mRNA的相对表达量高于御唐丸低剂量组(P＜0.05);与模型组比较,格华止组、糖尿乐组、御唐丸低剂量组及御唐丸高剂量组IRS-1 ser307蛋白磷酸化水平均显著降低(P＜0.01),且御唐丸高剂量组IRS-1 ser307蛋白磷酸化水平显著低于御唐丸低剂量组,差异有高度统计学意义(P＜0.01).结论 御唐丸能通过影响IRS-1mRNA相对表达量、抑制IRS-1 ser307蛋白磷酸化进程从而减轻胰岛素抵抗,进而对2型糖尿病起到治疗作用.

目的:探讨小檗碱(BBR)对胰岛素抵抗的HepG2细胞(IR-HepG2)中miR-29a-3p和胰岛素受体信号通路的调控机制.方法:建立胰岛素(100nm)诱导的IR-HepG2模型.生物信息学算法预测miR-29a-3p靶基因.通过RT-PCR检测miR-29a-3p和靶基因的mRNA表达.构建荧光素酶报告质粒,分析荧光素酶活性.将miR-29a-3p模拟物和抑制剂通过lipofectamine2000转染进IR-HepG2细胞.免疫印迹法检测胰岛素受体信号通路的各基因蛋白表达.结果:生物信息学提示IRS1是miR-29a-3p的靶基因.与对照组比较,模型组miR-29a-3p表达显著升高(P＜0.05),IRS1 mRNA表达水平显著降低(P＜0.01);BBR组抑制了这种变化(P＜0.05,P＜0.01).与阴性对照(NC)组比较,miR-29a-3p模拟物可显著抑制与IRS1 3'-UTR融合的荧光素酶报告基因的活性(P＜0.01).WB结果显示,miR-29a-3p下调IRS1蛋白表达,而miR-29a-3p则促进IRS1蛋白的表达.miR-29a-3p模拟物转染组IRS1mRNA表达下调,miR-29a-3p抑制剂转染组表达相反.BBR能够上调转染miR-29a-3p模拟物或抑制剂的IR-HepG2细胞中的IRS1 mRNA表达.在IR-HepG2细胞模型中,转染miR-29a-3p模拟物组的IRS1,pIRS1ser307、Akt、pAktser473和PDK1的蛋白表达均显著降低(P＜0.01),转染miR-29a-3p抑制剂后这些蛋白表达显著增加(P＜0.01).BBR治疗后,上述蛋白表达均显著增加.结论:miR-29a-3p在IR-HepG2细胞中能调控胰岛素受体信号传导通路,BBR能下调或维持miR-29a-3p水平,增加IRS1 mRNA和蛋白表达,调节胰岛素受体信号通路蛋白的表达.

目的 建立糖尿病大鼠模型,并实施十二指肠空肠旁路术(DJB),观察DJB对糖尿病大鼠肠道激素及肝脏内质网应激的影响.方法 选购清洁级SD成年雄性大鼠58只,以高脂饮食喂养联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,对建模成功的大鼠实施DJB(DJB组)及假手术(假手术组),以普通大鼠作为空白对照(空白对照组).分别检测3组大鼠肠道激素、胰岛素.两组术后大鼠肝脏内质网应激指标[p-双链RNA依赖性蛋白激酶样内质网蛋白激酶(p-PERK)、肌醇需求激酶-1(IRE-1)、p-IRE-1]、肝脏组织中[总c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白、p-JNK蛋白]、肝脏组织中胰岛素受体底物-1(IRS-1)蛋白以及p-IRS-1 ser307蛋白的表达变化.结果 灌胃前,3组大鼠胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、抑胃肽(GIP)、胰岛素(INS)水平比较,差异无统计学意义(F=0.04、2.708、0.002,P=0.996、0.079、0.998);灌胃30 min后,DJB组及对照组GLP-1、GIP、INS水平均高于假手术组,差异有统计学意义(F=33.692、18.657、16.393,P=0.000).术后16周DJB组小鼠p-PERK、p-IRE-1、p-JNK、p-IRS-1 ser307与术前比较,差异有统计学意义(t=10.507、12.606、9.163、14.603,P=0.000);IRE-1、JNK、IRS-1与术前比较,差异无统计学意义(t=1.295、1.863、1.675,P=0.205、0.072、0.104);相对于假手术组来说,DJB组改善良好.结论 DJB能够有效改善高脂饮食喂养联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肠道激素及胰岛素水平,缓解内质网应激.

[目的]探讨茵陈二陈汤对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型细胞内IRS-1ser307、PKBser473蛋白表达的影响;[方法]采用游离脂肪酸500 umol/L(棕榈酸:油酸摩尔比例为1∶2)刺激干预HepG2细胞,干预24 h建立细胞模型,采用茵陈二陈汤含药血清干预模型细胞,干预治疗24 h;选用罗格列酮、多烯磷脂酰胆碱含药血清作为治疗观察对照;Western Blot检测茵陈二陈汤对模型细胞内IRS-per307、PKBser473蛋白表达及IRS-1ser307/IRS-1、PKBser473/PKB的影响.与空白组相比,游离脂肪酸刺激24 h后,模型细胞内IRS-1ser307蛋白表达及IRS-1ser307/IRS-1水平明显升高,PKBser473蛋白及PKBser473/PKB水平显著下降;与模型组相比,茵陈二陈汤干预24 h后,模型细胞内IRS-1ser307蛋白表达(P＜0.01)及IRS-1ser307/IRS-1水平(P＜0.01)显著降低,PKBser473蛋白(P＜0.05)及PKBser473/PKB水平(P＜0.05)明显升高,且差异具有统计学意义.[结论]①茵陈二陈汤可通过调节IRS-1ser307、PKBser473蛋白表达,降低肝细胞IRS-1蛋白活化水平,促进PKB磷酸化,从而达到干预治疗作用;②茵陈二陈汤对IRS-1ser307、PKBser473蛋白的影响作用与罗格列酮及多烯磷脂酰胆碱效果相近.

Objective:The aim is to study the effects of metformin on the expression of 70 kDa ribosomal protein S6 kinase (P70S6k), insulin receptor substrate 1 (IRS-1), and IRS-1Ser307 phosphorylation in human luteinized granulosa cells.Methods:Granulosa cells in the experimental group were cultured in M199 medium containing 0.1 mmol/L metformin for 24 h and those in control group were cultured in M199 medium.The expression levels of P70S6k and IRS-1 mRNA were detected by reverse-transcriptiom polymerase chain reaction (RT-PCR) and real-time PCR.P70S6k, IRS-1, p-ser307-IRS-1, and p-thr389-P70S6k protein expression levels were detected by immunofluorescence and western blotting.Results:P70S6k mRNA level was higher and IRS-1 was significantly lower in the experimental group than those in the control group.IRS-1 and p-ser307-IRS-1 were expressed in cell plasma, and P70S6k and p-thr389-P70S6k were expressed in cell nucleus.The results of Western blot analysis indicated that the expression levels ofP70S6k, p-thr389-P70S6k, IRS-1, and p-ser307-IRS-1 proteins had significant difference between the experimental group and the control group.Compared to the control group, the relative intensity illustrated that the expression levels of P70S6K and p-thr389-P70S6k significantly increased in the experimental group;however, those ofIRS-1 and p-ser307-IRS-1 proteins significantly decreased.Conclusion:Metformin can inhibit the P70S6k mRNA and protein expression levels in the granulosa cells and improve insulin sensitivity by regulating IRS-1 expression through Akt/P70S6k/IRS-1-dependent pathway.

目的:研究6-姜烯酚对老年大鼠脂肪组织胰岛素抵抗的作用及机制.方法:将20月龄的SD雄性大鼠随机分为老年对照组、老年6-姜烯酚低剂量组(0.125 mg·kg-1)和高剂量组(0.500 mg·kg-1),取3月龄的SD雄性大鼠为青年对照组.连续灌胃给药7周后,测定血浆葡萄糖、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、游离脂肪酸(NEFA)和胰岛素的含量,并计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和脂肪组织胰岛素抵抗指数(Adipo-IR);Western Blot法检测附睾周围脂肪组织(eWAT)总胰岛素受体底物1(IRS-1)、磷酸化IRS-1(丝氨酸307位点)[p-IRS-1 (ser307)]、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、总蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(丝氨酸473位点)[p-AKT (ser473)]、葡萄糖转运蛋白(GLUT)4、eWAT细胞质膜和细胞质GLUT4的表达.结果:高剂量的6-姜烯酚显著降低禁食血浆葡萄糖、NEFA和胰岛素的含量,降低HOMA-IR和Adipo-IR (P＜ 0.01,P＜0.05),显著升高葡萄糖/胰岛素、NEFA/胰岛素和eWAT p-AKT (ser473) /AKT的比值,显著升高eWAT GLUT4、eWAT细胞质膜和细胞质GLUT4的表达(P＜ 0.01,P＜0.05).结论:6-姜烯酚能改善衰老相关脂肪组织胰岛素抵抗,其机制可能与上调eWAT p-AKT/AKT的比值和GLUT4的表达有关.

目的 探讨高铝暴露对大鼠糖代谢、胰岛素抵抗水平及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路的影响.方法 SPF级Wistar大鼠60只,随机分为高铝暴露组和对照组各30只,高铅暴露组予三氯化铝,对照组予生理盐水尾静脉注射,后进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)及高胰岛素正葡萄糖钳夹(HECT)试验,同时Western印迹法测定肝脏组织胰岛素受体(IR)-β、胰岛素受体底物(IRS)-1及IRS-1 Ser307磷酸化蛋白的表达情况.结果 OGTT结果显示,高铅暴露组30、60、120 min血糖水平均明显高于对照组(P<0.01),曲线下面积(AUC)显著高于对照组(P<0.05).在HCET中,高铅暴露组外周组织葡萄糖输注率(GIR)明显低于对照组(P<0.01).高铅暴露组肝脏中IR-β、IRS-1表达下降,而IRS-1 ser307表达升高(P<0.05).结论 高铝暴露可诱导大鼠糖耐量异常发生,其机制可能与PI3K通路受抑制有关.