目的 探讨氧化应激对人卵巢颗粒细胞生长发育的影响.方法 体外培养人卵巢颗粒细胞KGN,用不同浓度的过氧化氢(H2O2)处理KGN细胞,采用CCK8法检测细胞增殖水平,流式细胞术检测细胞内活性氧族(reactive oxy-gen species,ROS)产生量及细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达水平.结果 随着H2O2浓度的升高,颗粒细胞增殖受到明显抑制,且呈剂量依赖性(F分别为4.906、4.825、4.653、4.614和4.587,P均＜0.001).细胞内ROS水平随着H2O2浓度的增加而升高,同时细胞凋亡率不断升高;加入抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)后,ROS水平恢复,细胞凋亡率下降,表明细胞凋亡与ROS的产生有关.H2O2处理后,KGN细胞中LC3-Ⅱ、cleaved-caspase3蛋白的表达水平显著升高(t分别为4.809和5.789,P均＜0.05),LC3-Ⅰ、BCL-2、P62蛋白的表达水平显著降低(t分别为4.014、3.982和4.415,P均＜0.05),表明H2O2能够诱导KGN细胞的自噬和凋亡.结论 H2O2能够抑制人卵巢颗粒细胞增殖,诱导其自噬凋亡.氧化应激状态抑制人卵巢颗粒细胞的生长发育,降低卵母细胞质量,卵巢储备功能下降.

目的:探究miR-29a-3p/ SGMS2轴对人类卵巢颗粒样肿瘤细胞系（human ovarian granulosa-like tumor cell line，KGN）炎症反应的调控机制。 方法:通过构建并验证过表达和敲低miR-29a-3p及 SGMS2转染KGN细胞模型，双荧光素酶报告基因实验检测 miR-29a-3p与 SGMS2的结合；MTT法检测各组细胞的增殖；免疫荧光法观察增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和Ki67蛋白荧光强度；流式细胞术检测细胞凋亡；酶联免疫吸附法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-6、IL-1β和鞘磷脂的表达；Western blotting检测细胞中Caspase-3、cleaved-Caspase-3、 SGMS2和p-p65蛋白表达。 结果:miR-29a-3p与 SGMS2之间存在位点结合，且能够负向调控 SGMS2的表达水平。KGN细胞中过表达 SGMS2能够增高其吸光度值（ P=0.007），并增强其PCNA和Ki67蛋白的免疫荧光强度（均 P<0.001）；过表达 SGMS2能够降低KGN细胞的凋亡率（ P=0.001），升高炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和鞘磷脂的表达水平（均 P<0.001）。过表达 SGMS2时KGN细胞中cleaved-Caspase-3、p-p65和 SGMS2蛋白表达量升高（ P=0.001， P<0.001， P<0.001）。而敲低 SGMS2时，以上结果具有与过表达 SGMS2相反的变化趋势。 结论:miR-29a-3p与 SGMS2之间存在靶向负向调节关系， SGMS2能够促进KGN细胞的炎症反应，可为多囊卵巢综合征等妇科内分泌疾病的治疗提供靶点。

目的:探究人脐带间充质干细胞来源的外泌体miR-21-5p对人颗粒细胞凋亡的影响。方法:不同浓度（0 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L和100 μmol/L）磷酰胺氮芥作用KGN细胞48 h构建颗粒细胞凋亡模型，采用qPCR和Western blotting分别检测 bax、bcl2的mRNA和蛋白水平，并用流式细胞计数检测凋亡率，以筛选出磷酰胺氮芥构建凋亡模型的最佳浓度。利用hsa-miR-21-5p过表达质粒瞬时转染人脐带间充质干细胞，通过qPCR检测hsa-miR-21-5p表达水平；分离过表达miR-21-5p的外泌体，利用纳米流式和电子显微镜鉴定miR-21-5p外泌体。对磷酰胺氮芥构建成功的KGN细胞凋亡模型中加入不同浓度（5 μg/mL、10 μg/mL和15 μg/mL）的过表达miR-21外泌体，采用qPCR和Western blotting分别检测 bax、 bcl2的mRNA和蛋白水平，采用PKH-26标记外泌体示踪其在颗粒细胞的位置。 结果:60 μmol/L磷酰胺氮芥作用的KGN细胞中 bax mRNA 和蛋白水平均显著高于0 μmol/L磷酰胺氮芥组（均 P<0.001）， bcl2 mRNA和蛋白水平均显著高于0 μmol/L磷酰胺氮芥组（ P=0.005， P<0.001）。60 μmol/L磷酰胺氮芥作用后KGN细胞的凋亡率为（38.10±2.90）%，而30 μmol/L磷酰胺氮芥干预后KGN细胞的凋亡率为（16.75±2.55）%，均显著高于0 μmol/L磷酰胺氮芥组（ P=0.020， P=0.006）。hsa-miR-21-5p瞬时转染人脐带血间充质干细胞，qPCR检测到has-miR-21-5p的表达高于未转染的空白对照组（ P<0.001）。纳米流式检测外泌体表面蛋白CD9阳性率为14.9%，CD63阳性率为16.4%，CD81阳性率为31.4%；透射电子显微镜观察到外泌体呈“茶托型”；PKH-26标记的外泌体共聚焦显示进入颗粒细胞内并发挥生物学效应。5 μg/mL、10 μg/mL和15 μg/mL 空载质粒外泌体组与60 μmol/L磷酰胺氮芥组比较 bax mRNA表达水平差异均无统计学意义（均 P>0.05）。但5 μg/mL、10 μg/mL和15 μg/mL miR-21-5-p外泌体组 bax mRNA表达水平低于60 μmol/L磷酰胺氮芥组（ P=0.008、 P=0.003、 P<0.001），而 bcl2 mRNA表达在各组中差异均无统计学意义（均 P>0.05）。与60 μmol/L 磷酰胺氮芥组比，5 μg/mL、10 μg/mL和15 μg/mL空载外泌体组BAX蛋白表达差异均无统计学意义（均 P>0.05），而5 μg/mL、10 μg/mL和15 μg/mL miR-21-5-p外泌体组与60 μmol/L磷酰胺氮芥组比较BAX蛋白表达量降低，差异均具有统计学意义（均 P<0.001）。而BCL2蛋白在各个干预组表达差异均无统计学意义（均 P>0.05）。 结论:通过脐血间充质干细胞过表达miR-21分泌的外泌体，可以对人颗粒细胞有效地发挥抗凋亡的作用。

目的:探讨多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）颗粒细胞lncRNA H19基因和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1之间的关系及对颗粒细胞增殖和凋亡的影响。 方法:分别以浓度2 μg/L、4 μg/L、10 μg/L TGF-β1处理人类卵巢颗粒细胞株KGN，采用Q-PCR方法检测H19的表达水平，分别构建H19过表达质粒pcDNA3.0-H19和 siH19-1617并转染KGN，采用Western blotting方法检测TGF-β1的表达情况，采用CCK8法检测颗粒细胞增殖情况，采用流式细胞仪检测颗粒细胞凋亡情况。结果:加入TGF-β1后，H19的表达量较未处理的KGN细胞的表达量增加，当TGF-β1浓度≥4 μg/L时H19的表达量显著增多，差异具有统计学意义（ P=0.023）；H19过表达后，TGF-β1表达量显著高于转染空质粒的对照组KGN+pcDNA3.0-NC（ P=0.017），H19沉默后TGF-β1表达量显著低于对照组KGN+NC（ P<0.001）。H19过表达后KGN细胞在48 h和72 h增殖能力增强，凋亡能力减弱；H19沉默后KGN细胞在48 h和72 h增殖能力减弱，凋亡能力增强。 结论:H19可调控下游蛋白TGF-β1的表达，并可促进PCOS卵巢颗粒细胞增殖，抑制细胞凋亡。

目的:研究红景天苷（Salidroside，Sal）对多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）模型小鼠炎症水平的调节作用及其与核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的关系。方法:将28只3周龄C57B/6J雌性小鼠按照计算机随机生成数字的方式分为对照组、Sal组、PCOS组和PCOS+Sal组，每组7只，进行21 d造模及治疗。造模结束行糖耐量测试，取卵巢组织行免疫组织化学染色检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、p-NF-κB p65的表达水平，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunsorbent assay，ELISA）检测小鼠血清性激素和炎症因子表达水平。培养的人卵巢颗粒细胞系（human ovary granulosa cell line，KGN）分为对照组、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（0.5 mg/L）组、Sal（30 μmol/L）组和LPS（0.5 mg/L）+Sal（15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L）组，处理24 h后检测各组炎症因子mRNA的表达水平以及NF-κB相关蛋白的表达水平。结果:与对照组相比，PCOS组小鼠血清睾酮［（2.11±0.60）μg/L］、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）［（2.54±0.27）U/L］、LH/卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）（0.12±0.01）及炎症因子白细胞介素（interleukin，IL）-1β［（107.83±12.05）ng/L］、IL-6［（56.70±7.33）ng/L］和TNF-α［（74.72±14.64）ng/L］水平均显著高于对照组［（0.77±0.06）μg/L、（1.07±0.21）U/L、0.05±0.01、（33.83±4.96）ng/L、（28.91±8.53）ng/L、（37.07±5.48）ng/L，均 P<0.001］，Sal治疗后睾酮［（1.47±0.25）μg/L， P=0.012］、LH［（1.73±0.17）U/L， P<0.001］、LH/FSH（0.08±0.01， P<0.001）、IL-1β［（74.21±10.64）ng/L， P<0.001］、IL-6［（40.90±5.01）ng/L， P=0.002］与TNF-α［（55.42±8.78）ng/L， P=0.017］水平较PCOS组均降低；免疫组织化学结果显示PCOS组小鼠卵巢颗粒细胞中TNF-α和p-NF-κB p65的表达上调，Sal处理后减少。LPS组KGN IL-1β（1.76±0.09）、 IL-6（1.79±0.20）和 TNF-α mRNA（1.56±0.19）水平显著高于对照组［0.50±0.20、0.80±0.10、0.70±0.30，均 P<0.001］，Sal处理（15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L）后， IL-1β（1.09±0.07、1.00±0.02、0.96±0.03，均 P<0.001） 、IL-6（1.47±0.12、0.93±0.18、0.91±0.27，均 P<0.001）和 TNF- α（1.21±0.25、0.94±0.35、0.76±0.07，均 P<0.001）的mRNA水平明显下降；与对照组相比，LPS组p-NF-κB p65（0.49±0.07比0.31±0.03， P=0.013）和p-IκBα（0.48±0.06比0.26±0.04， P=0.012）的蛋白表达水平明显升高，Sal处理后，p-NF-κB p65（0.33±0.05， P=0.024）和p-IκBα（0.31±0.06， P=0.046）的蛋白水平显著下降。 结论:Sal可通过抑制NF-κB通路降低PCOS模型小鼠的炎症水平。

通过研究核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，NRF2）对卵巢颗粒细胞的作用及可能机制，为预防卵巢早衰提供依据。本文为细胞实验研究设计，于2022年1—12月在湖南师范大学附属长沙市妇幼保健院的医学实验中心完成。通过4-乙烯基环己烯二环氧（VCD）处理人卵巢颗粒细胞KGN细胞构建颗粒细胞损伤模型。先以不同浓度的VCD处理KGN细胞，采用细胞计数试剂（CCK-8）检测卵巢细胞增殖情况。CCK8确定半抑制（IC 50）后，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清中雌二醇和孕酮的含量，活性氧（ROS）检测试剂盒检测卵巢细胞中ROS的含量，实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测NRF2的mRNA表达水平，免疫印迹检测NRF2的蛋白表达水平。进一步通过慢病毒转染构建NRF2干扰（siNRF2）和过表达（NRF2-OE）细胞模型，通过检测激素水平、氧化应激指标（ROS、SOD、GSH-Px）和自噬情况（LC3B水平）以分析调控NRF2对VCD处理细胞模型的影响。结果显示，VCD干预后以时间依赖性和剂量依赖性方式抑制卵巢颗粒细胞的增殖（ F>100， P<0.05），24 h的IC 50为1.2 mmol/L。VCD处理后细胞上清中雌二醇由（56.32±10.18）ng/ml降低至（24.59±8.75）ng/ml（ t=5.78， P<0.05）；孕酮由（50.25±7.03）ng/ml降低至（25.13±6.67）ng/ml（ t=6.54， P<0.05）。VCD处理后细胞的SOD由（44.47±7.71）ng/ml降低至（30.92±4.97）ng/ml（ t=3.61， P<0.05）；GSH-Px由（68.51±10.17）ng/ml降低至（35.19±6.59）ng/ml（ t=5.73， P<0.05）。同时伴随自噬的增加和NRF2的下降。成功构建沉默NRF2和过表达NRF2的KGN细胞模型，随后采用VCD处理各组细胞，发现siNRF2组的细胞增殖活性明显减弱（ t=8.37， P<0.05），而NRF2-OE能逆转VCD造成的细胞活性损伤（ t=3.37， P<0.05）。siNRF2组的雌二醇水平最低（ t=5.78， P<0.05），而NRF2-OE能逆转VCD造成的细胞雌二醇水平降低（ t=5.58， P<0.05）。siNRF2组的孕酮水平最低（ t=3.02， P<0.05），而NRF2-OE能逆转VCD造成的细胞孕酮水平降低（ t=2.41， P<0.05）。siNRF2组的ROS水平最高（ t=2.86， P<0.05），NRF2-OE能逆转VCD引起的ROS增加（ t=3.14， P<0.05），siNRF2组的SOD酶含量最低（ t=2.98， P<0.05），NRF2-OE能逆转VCD引起的SOD酶含量降低（ t=4.72， P<0.05）。siNRF2组的GSH-Px酶含量最低（ t=3.67， P<0.05），NRF2-OE能逆转VCD引起的抗氧化酶含量降低（ t=2.71， P<0.05）。siNRF2组的LC3B水平最高（ t=2.45， P<0.05），NRF2-OE能逆转VCD引起的LC3B升高（ t=9.64， P<0.05）。综上，NRF2抑制ROS诱导的自噬性，从而发挥减少卵巢颗粒细胞损伤的作用。

目的:基于网络药理学和分子对接方法探讨黄芪对早发性卵巢功能不全治疗作用的分子机制.方法:在中药系统药理学数据库TCMSP中筛选黄芪有效成分及药物作用靶点;在Genecards数据库中筛选早发性卵巢功能不全疾病靶点;运用Venny在线工具筛选两者的交互基因;通过Cytoscape3.7.2 软件构建"药物-成分-靶点-疾病"网络关系图;采用String数据库获得蛋白互作(PPI)信息,进一步通过CytoNCA 插件构建蛋白质相互作用网络,筛核心靶点蛋白;利用DAVID数据库对交互基因进行GO富集和KEGG通路富集;使用分子对接技术进一步明确其发挥治疗作用的分子;最后,采用血清饥饿法建立POI细胞模型,给予黄芪中的有效化合物槲皮素进行干预,通过Tunel染色、蛋白质印迹实验(western blotting,WB)对网络药理学预测结果进行实验验证.结果:通过TCMSP数据库筛选出黄芪的32个有效化合物及552个基因靶点,从疾病数据库中筛选出730个早发性卵巢功能不全的疾病靶点,两者共62个交集基因,其中黄芪中的主要活性成分包括槲皮素(quercetin)、异鼠李素(isorhamnetin)、山奈酚(kaempferol)、丁子香萜(Mairin)、芒柄花黄素(formononetin)和芒柄花黄素(astragaloside IV),10个POI的潜在核心靶基因为ALB、INS、AKT1、ACTB、TP53、TNF、ESR1、CASP3、STAT3和PTEN;潜在靶点基因主要参与调控JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路;分子对接验证了黄芪主要活性化合物与核心蛋白STAT3和Akt1存在较强的结合作用;细胞实验结果发现,黄芪中的重要活性化合物槲皮素能促进JAK2/STAT3信号通路关键分子JAK2及STAT3的磷酸化水平,改变卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白表达水平.结论:网络药理学和分子对接分析表明中药黄芪能通过调节对雌二醇的反应、抑制凋亡过程以及调控JAK-STAT和PI3K-Akt信号通路治疗早发性卵巢功能不全,其机制可能与激活JAK2/STAT3信号通路,抑制卵巢颗粒细胞凋亡相关.

目的 研究新加苁蓉菟丝子汤对卵巢颗粒细胞线粒体生物合成和线粒体功能的影响.方法 采用雷公藤甲素建立人卵巢颗粒细胞(KGN)损伤模型,将细胞分为对照组、模型组、阳性药调经促孕丸组、新加苁蓉菟丝子汤组、沉默信息调节因子1(Silent mating type information regulator 1,SIRT1)抑制剂组和SIRT1抑制剂+新加苁蓉菟丝子汤组.用雷公藤甲素孵育6 h造成颗粒细胞功能损伤后再予SIRT1抑制剂以及空白或含药血清.干预48 h后采用CCK8法检测细胞活力;流式细胞术检测凋亡率;ELISA试剂盒检测抗苗勒激素(Anti-Müllerian,AMH)、促卵泡生成素(Follicle-stimulating hormone,FSH)和抑制素B(Inhibin B,INHB);生化试剂盒检测三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)酶;JC-1 法检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP);电子显微镜和荧光显微镜观察细胞线粒体形态结构、数量和活性变化;Western blot 检测 SIRT1、p-SIRT1、过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 辅助活化因子 1(Peroxlsomeproliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α,PGC-1α)、核呼吸因子1(Nuclear respiratory factor 1,NRF1)和线粒体转录因子(Mitochondrial transcription factor A,TFAM)的蛋白表达;PCR检测SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM的mRNA表达和线粒体DNA拷贝数(Mitochondrial DNA copy number,mtDNA).结果 中成药调经促孕丸和补肾养血活血复方新加苁蓉菟丝子汤均可提高颗粒细胞活力(P<0.05);降低细胞凋亡率(P<0.05);提高ATP酶活性和MMP(P<0.05);改善线粒体形态结构损伤;增加线粒体数量、活性和mtDNA表达(P<0.01),上调SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM的蛋白和mRNA表达(P<0.05).结论 新加苁蓉菟丝子汤对雷公藤甲素所致卵巢颗粒细胞损伤具有保护作用,其机制可能是通过调控SIRT1/PGC-1α信号通路促进新生线粒体生物合成以改善线粒体功能障碍.

目的 探索去泛素化酶USP22在多囊卵巢综合征(PCOS)发病过程中的作用及机制.方法 利用脱氢表雄酮(DHEA)诱导建立小鼠PCOS模型,免疫组化及Western blot检测USP22在PCOS模型小鼠及对照小鼠卵巢组织中的表达变化;在卵巢颗粒细胞系(KGN)细胞中加入500 nmol/L双氢睾酮(DHT)模拟PCOS颗粒细胞中的高雄状态,并构建靶向USP22的siRNA,敲低KGN细胞中USP22的表达,对照组加入空白siRNA,CCK-8检测各组细胞的增殖变化,RT-PCR检测细胞周期相关分子的mRNA表达水平,Western blot检测细胞周期相关蛋白及信号通路相关蛋白表达情况.结果 USP22蛋白主要定位于卵巢颗粒细胞的细胞核,且在PCOS小鼠卵巢组织中USP22表达显著低于正常小鼠(P＜0.05).细胞实验结果表明:敲低USP22后,KGN细胞的增殖能力显著下降(P＜0.05),RT-PCR及Western Blot结果显示细胞周期相关蛋白Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1的mRNA及蛋白表达水平均显著下降(P＜0.05);而在KGN细胞中敲低USP22的同时加入DHT,KGN细胞增殖能力及相关分子表达下降更为显著(P＜0.05);另外,敲低USP22后,KGN细胞中信号通路相关蛋白p-PI3K和p-AKT的表达水平显著下降(P＜0.05).结论 去泛素化酶USP22可通过PI3K/AKT信号通路调控KGN细胞的增殖,从而影响PCOS的发病.

目的:探究不同浓度雷公藤甲素(TP)对大鼠卵巢和人卵巢颗粒细胞氧化应激及细胞凋亡的影响.方法:将32只SPF级雌性SD大鼠随机分为4组,即空白组、TP低剂量组、TP中剂量组和TP高剂量组,每组8只.TP低、中、高剂量组分别给予60、120、240μg/kg TP腹腔注射,连续14 d.称量大鼠体质量、卵巢湿重并计算卵巢指数,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)水平.苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织形态学,生化试剂盒检测卵巢组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)含量,二氢乙啶(DHE)染色法检测卵巢组织活性氧(ROS)水平,Western blotting检测芳香化酶(CYP19A1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cle-caspase-3)、核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)蛋白表达情况.细胞实验分为空白组、TP低剂量组、TP中剂量组和TP高剂量组,TP低、中、高剂量组人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)分别用20、40、60 nmol/L TP处理.采用CCK8法检测细胞活力,ELISA检测细胞上清E2,显微镜观察明场细胞形态,TUNEL染色法检测DNA断裂情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA探针检测细胞ROS水平,Western blotting检测CYP19A1、Bcl-2、Bax、Cle-caspase-3、Nrf2、HO-1蛋白表达情况.结果:动物实验,与空白组比较,TP中、高剂量组大鼠体质量、卵巢指数明显降低,血清E2和P水平降低,FSH和LH水平升高,闭锁卵泡增多、发育卵泡减少,卵巢组织SOD、CAT酶活力下降,MDA含量增加,卵巢组织ROS水平增加,CYP19A1、Bcl-2、Nrf2、HO-1表达降低,Bax、Cle-caspase-3表达升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).细胞实验,与空白组比较,TP处理组KGN细胞活力明显下降,TP中、高剂量组细胞上清E2含量减少,细胞明显出现皱缩、变圆、体积变小等现象,TUNEL阳性表达细胞数增加,细胞凋亡率明显增加,细胞ROS水平增加,CYP19A1、Bcl-2、Nrf2、HO-1表达降低,Bax、Cle-caspase-3表达升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:TP能引起显著的卵巢毒性,作用机制可能与氧化应激和细胞凋亡有关.