目的:探讨单用不同浓度总丹参酮及联合酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）对人髓系白血病细胞株的增殖抑制和促凋亡作用，并研究其分子机制。方法:K562和Kasumi-1细胞株购自中国科学院上海细胞库，TKIs耐药株K562/T315I细胞株由北京陆道培血液病研究院分子医学研究中心自主构建。取对数生长期细胞，设0、2.19、4.38、8.75、17.50、35.00 μg/ml总丹参酮干预组，按1×10 4个/孔接种于96孔板后，加药处理24 h；另设二甲基亚砜对照组。所有实验独立重复3~5次，CCK-8法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western印迹法检测细胞凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。将经总丹参酮处理和未处理的细胞株进行转录组测序，对差异表达的基因进行基因集富集分析。 结果:8.75 μg/ml总丹参酮作用K562、K562/T315I和Kasumi-1细胞24 h后，半抑制浓度值（IC 50）分别为（4.11±0.02）、（4.95±0.04）和（3.98±0.01）μg/ml。8.75 μg/ml总丹参酮与0.25 μmol/L伊马替尼联合应用时，总丹参酮可增强伊马替尼对K562和K562/T315I细胞株的凋亡诱导作用。分别用4.38、8.75、17.50 μg/ml总丹参酮作用于K562、K562/T315I和Kasumi-1细胞株24 h，与对照组比较，总丹参酮可以上调Bax蛋白表达水平，下调Bcl-2蛋白表达水平，降低Bcl-2/Bax比值（均 P<0.05）。总丹参酮抑制髓系白血病细胞株增殖相关信号通路和DNA损伤修复通路，激活诱导白血病细胞凋亡的信号通路。 结论:不同浓度总丹参酮对K562、Kasumi-1以及TKIs耐药的K562/T315I细胞株有抑制增殖和促进凋亡的作用，与TKIs联合应用时可进一步增强抗白血病作用。

目的:研究RNA结合蛋白核不均一核糖核蛋白U（hnRNP U）在急性髓系白血病（AML）中临床意义及致病机制。方法:基于数据库（GEPIA）和本中心数据比较hnRNP U在AML患者及健康对照者中表达情况；通过Cbioportal数据库下载Beat AML数据集（158例），按照hnRNP U表达水平分为高表达组（89例）和低表达组（69例）并对两组临床特征进行比较；选择hnRNP U高表达的Kasumi-1和MOLM-13细胞系，敲低hnRNP U后通过CCK-8检测细胞增殖能力，利用Annexin Ⅴ-APC/7-AAD抗体检测细胞凋亡情况，通过定量分析DNA含量（PI染色）检测细胞周期变化及克隆形成实验检测细胞集落形成能力等方面研究hnRNP U对人AML细胞系生物学行为的影响；利用Western blot法研究敲低hnRNP U后对DDR（DNA Damage Response）通路蛋白cleaved-PARP、p-H2A.X表达的影响。结果:①泛癌分析发现hnRNP U在AML中高表达，AML患者外周血单个核细胞中hnRNP U mRNA表达水平显著高于健康对照者（0.0315±0.0042对0.0195±0.0006， P<0.01）；②hnRNP U高表达组中位发病年龄为56（2~87）岁，hnRNP U低表达组中位发病年龄为65（8~85）岁，hnRNP U高表达组较低表达组发病年龄更早（ t=-2.681， P=0.007），且合并FLT3突变比例更高（ χ2=4.069， P=0.044）；③敲低hnRNP U后Kasumi-1、MOLM-13细胞增殖受抑，细胞凋亡率增高，集落形成能力减弱，细胞周期阻滞在G 2/M期，与对照组比较，差异均有统计学意义（ P值均<0.05）；④敲低hnRNP U可引起DDR通路上cleaved-PARP、p-H2A.X蛋白表达上调。 结论:hnRNP U在AML中高表达，敲低hnRNP U后可抑制AML的发生发展，其可能是通过激活DDR通路发挥作用。

目的:研究DADS(Diallyl disulfide,DADS)诱导K562细胞焦亡(pyroptosis)及其分子机制.方法:Western Blot 检测 Kasumi、K562、THP-1、HL-60、NB4 细胞的 Gasdermin 家族蛋白 E(Gasdermin E,GSDME)、Gasdermin 家族蛋白 D(Gasdermin D,GSDMD);甲基特异性 PCR(Methylation-specific PCR,MSP)法检测K562及NB4细胞GSDME基因启动子检测区甲基化情况;CCK-8检测DADS对K562细胞增殖活力的影响;Western Blot、LDH 释放实验检测 DADS 处理 K562 细胞后 GSDME、GSDME-N、IL-1β、Cleaved IL-1β蛋白表达水平及乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)释放量变化;慢病毒转染技术构建GSDME敲低的稳转K562细胞株;Western Blot检测下调GSDME对DADS处理K562细胞GSDME-N端蛋白表达水平的影响.结果:Kasumi、K562、THP-1、HL-60、NB4中GSDME、GSDMD的蛋白表达水平存在差异;NB4细胞的GSDME基因启动子检测区甲基化扩增出阳性条带,而非甲基化扩增为阴性;K562细胞GSDME基因启动子检测区甲基化未能扩增出阳性条带,而非甲基化扩增为阳性;DADS处理后K562细胞的LDH释放量、GSDME-N、Cleaved-IL-1β蛋白均显著升高(P＜0.01);与NC组相比,敲低组的K562细胞中mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P＜0.01);DADS处理后,NC组的GSDME-N蛋白水平明显上升(P＜0.001),QD组GSDME-N蛋白的水平无显著差异(P＞0.05);与NC-DADS组相比,经过DADS处理的QD组GSDME-N蛋白水平明显下降(P＜0.001).结论:DADS诱导K562细胞发生细胞焦亡,其分子机制可能与GSDME介导的焦亡通路有关.

目的:探讨核输出蛋白1(XPO1)抑制剂塞利尼索对急性髓系白血病(AML)Kasumi-1细胞增殖与凋亡的影响.方法:用MTS法检测不同浓度塞利尼索(0、2.5、5、10 μmol/L)作用于Kasumi-1细胞不同时间点(24、48、72 h)的增殖抑制率;流式细胞术检测不同浓度塞利尼索作用于Kasumi-1细胞48 h后的细胞凋亡率和细胞周期变化情况.结果:塞利尼索在不同时间点均可抑制Kasumi-1细胞生长,并呈浓度依赖(r24 h=0.7592,r48 h=0.9456,r72 h=0.9425);不同浓度塞利尼索均可抑制Kasumi-1细胞生长,并呈时间依赖(2.5 μmol/L组r=0.9057,5μmol/L组r=0.9897,10 μmol/L组r=0.9994).塞利尼索可诱导Kasumi-1细胞凋亡,且呈浓度依赖(r=0.9732),随着药物浓度的增大,诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用越明显.塞利尼索作用于Kasumi-1细胞48 h后,G0/G1期细胞比例明显上升,S期细胞比例明显下降,并且随着塞利尼索药物浓度的增大,Kasumi-1细胞周期阻滞于G0/G1期的细胞比例增加,细胞合成减少.结论:塞利尼索可抑制Kasumi-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期于G0/G1期,导致肿瘤细胞的死亡.

目的:研究伊利司莫-铜(ES-Cu)对人急性髓系白血病(AML)细胞的增殖抑制和铜死亡的诱导作用.方法:采用CCK-8试剂盒检测ES-Cu诱导的AML细胞存活率以及AML细胞经铜螯合剂TTM预处理后ES-Cu诱导的细胞存活率;Calcein/PI检测试剂盒检测ES-Cu诱导引起的细胞活性与细胞毒性变化;采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧水平;GSH和GSSG检测试剂盒检测细胞内谷胱甘肽(GSH)含量;Western blot检测细胞铜死亡相关蛋白ATP7B、FDX1、DLAT、DPYD的表达.结果:ES-Cu对人急性髓系白血病细胞系Kasumi-1及HL-60的毒性呈现出明显的剂量依赖性(rKasumi4=-0.99,rHL-60=-0.98).随着ES-Cu浓度升高,细胞内活性氧水平随之升高(P＜0.01-0.001).铜螯合剂TTM可以显著逆转ES-Cu对细胞增殖的抑制作用以及对活性氧的促进作用.随着ES-Cu浓度升高,Kasumi-1细胞内GSH含量逐渐降低(r=-0.98),ATP7B、FDX1、DLAT和DPYD蛋白的表达均显著降低(P＜0.05),最终促发铜死亡.结论:ES-Cu能够诱导急性髓系白血病细胞发生铜死亡,这为急性髓系白血病提供了新的治疗思路.

目的:通过MeRIP联合逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术,证明WTAP介导的RNA m6A修饰对伴t(8;21)急性髓系白血病(AML)细胞中KDM4B基因的直接调控作用.方法:采用靶向WTAP或KDM4B基因的短发夹 RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体沉默 t(8;21)AML 细胞系 Kasumi-1 和 SKNO-1 中 WTAP 或KDM4B基因表达,以转染随机打乱序列(scramble)的shRNA的细胞为对照.用超纯RNA提取试剂盒(DNase Ⅰ)提取细胞RNA,Magna MeRIPTM m6A Kit试剂盒富集甲基化修饰片段,并通过RT-qPCR检测m6A甲基化修饰的RNA区域;采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)和逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测细胞中WTAP、KDM4B蛋白和mRNA的表达水平.采用克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力.结果:沉默Kasumi-1细胞中WTAP的表达后,m6A甲基化修饰在KDM4B mRNA 3'UTR的富集程度显著下降(P＜0.01),沉默Kasumi-1和SKNO-1细胞中WTAP的表达可显著抑制KDM4B蛋白(P＜0.001)和mRNA表达水平(Kasumi-1:P＜0.001;SKNO-1:P＜0.01)、细胞体外克隆形成能力下降(Kasumi-1:P＜0.001;SKNO-1:P＜0.01).结论:t(8;21)AML细胞系中,WTAP通过调控KDM4B基因mRNA 3'UTR的m6A修饰调控KDM4B的表达,沉默KDM4B表达可以抑制t(8;21)AML细胞增殖.

目的:了解类芳烃受体核转位蛋白2(BMAL2)在急性髓系白血病(AML)中的表达及与患者预后的关系,分析其对AML细胞有氧糖酵解和增殖的影响.方法:应用实时定量PCR法检测AML患者和正常对照组的骨髓单个核细胞中BMAL2的表达情况.利用美国国家生物技术信息中心公共数据库分析BMAL2表达与AML患者预后的相关性.通过慢病毒系统敲低AML细胞系HL-60和Kasumi-1中BMAL2的表达,葡萄糖摄取实验、乳酸含量实验、CCK-8法、细胞集落形成实验检测其对细胞糖代谢、细胞增殖的影响.结果:BMAL2 mRNA在AML中的表达水平显著高于正常对照组(P＜0.01).BMAL2表达高的AML患者总生存时间较低表达患者明显缩短(P＜0.05).敲低AML细胞系HL-60和Kasumi-1中的BMAL2后,细胞葡萄糖摄取减少,乳酸生成减少.RT-PCR及Western blot检测结果显示,BMAL2通过增强HIF1A的表达来促进AML细胞有氧糖酵解,进而促进细胞增殖.结论:BMAL2高表达于AML中,通过HIF1A增强AML细胞有氧糖酵解从而促进细胞增殖.

目的 通过评估白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物(EAEHDW)对磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/p53 信号通路传导调节作用,探讨其抑制急性髓系白血病M2 型(AML-M2)细胞株Kasumi-1 增殖及诱导凋亡的机制.方法 利用乙酸乙酯从白花蛇舌草中萃取制备得到EAEHDW,高效液相色谱串联质谱装置检测样品纯度.设置空白组,将浓度分别为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的EAEHDW加入对数生长期的Kasumi-1 细胞株,采用MTT法检测不同浓度EAEHDW作用不同时间后Kasumi-1 细胞存活率,采用Annexin V/PI流式细胞术检测不同浓度EAEHDW作用24h后Kasumi-1 细胞凋亡情况,采用Western blot法检测不同浓度EAEHDW(0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL)作用24h后Kasumi-1 细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族蛋白及PI3K/Akt/p53 信号传导通路蛋白表达情况.结果 不同浓度的EAEHDW干预后,细胞存活率较空白组明显降低,细胞凋亡率较空白组明显升高,且细胞存活率随着作用时间的延长和药物浓度的增加而下降越明显,细胞凋亡率随着药物浓度的增加而升高越明显,差异均有统计学意义(P均<0.05);不同浓度的 EAEHDW作用于Ka-sumi-1 细胞后,细胞中多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、细胞色素C(Cyto-C)、p53 蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、鼠双微染色体2(MDM2)、磷酸化MDM2(p-MDM2)蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05).结论 EAEHDW可明显抑制髓系白血病Kasumi-1 细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与影响Caspase家族蛋白表达和抑制PI3K/Akt/p53 信号通路导致p53 激活有关.

目的:研究小分子化合物TIC10对多种白血病细胞的抑制作用及其对MLL-AF9诱发的急性髓系白血病的干预效果.方法:采用MOLM-13、MV4-11、THP-1、Kasumi-1、KG-1和K562细胞,通过CCK-8和细胞计数检测TIC 10对白血病细胞增殖的影响.BrdU和DAPI染色的流式细胞术检测TIC10对白血病细胞周期的影响.Annexin V和PI染色检测TIC10对白血病细胞凋亡的影响.Western blot检测TIC10对白血病细胞凋亡关键蛋白Caspase3表达的影响.构建小鼠MLL-AF9白血病模型以检测TIC10对急性髓系白血病在体进展的干预效果.结果:TIC10处理均显著抑制 MOLM-13、MV4-11、THP-1 和 Kasumi-1 细胞的增殖(P＜0.05).TIC10 处理使 MV4-11 及 Kasumi-1细胞中的BrdU掺入显著减少(P＜0.01),表明TIC10阻碍白血病细胞进入S期.凋亡实验结果显示,TIC10能显著诱导白血病细胞凋亡(P＜0.01).免疫印迹结果表明,TIC10促进多种白血病细胞中Cleaved-Caspase3蛋白水平的增加(P＜0.05).动物实验结果证实TIC10能有效干预小鼠体内白血病的进展.结论:TIC10能有效抑制白血病细胞的增殖并诱导细胞凋亡,对MLL-AF9诱发的急性髓系白血病有一定干预效果,TIC10有望作为白血病治疗的潜在候选药物.

目的:探讨阿魏酸(FA)对人急性髓系白血病(AML)细胞系U937细胞增殖、凋亡及Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响.方法:使用不同浓度的FA(0、10、25、50、100、200 μmol/L)分别处理人AML细胞系Kasumi-1、HL-60、U937细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率,计算各个细胞系的半数抑制浓度(IC50).将 U937 细胞分为对照组、FA 组(50 μmol/L FA)、FA+pcDNA 组(50 μmol/L FA+转染空载质粒)、FA+pcDNA-TLR4组(50 μmol/L FA+转染TLR4过表达质粒).采用流式细胞术检测各组U937细胞周期与细胞凋亡;平板克隆形成实验检测U937细胞克隆形成能力;荧光定量PCR检测U937细胞TLR4、NF-κB p65 mRNA水平;蛋白印迹法检测U937细胞细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞周期蛋白E(CyclinE)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、TLR4、NF-KB p65蛋白表达.结果:随着FA浓度的升高,Kasumi-1、HL-60、U937 细胞存活率逐渐下降(r=-0.919,r=-0.909,r=-0.900),U937 细胞的 IC50为50.25±2.23 pmol/L.与对照组比较,经药物处理U937细胞后,FA组G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05),细胞克隆形成数、S期和G2/M期细胞比例、CyclinD1、CyclinE、Bcl-2蛋白及TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05);与FA组和FA+pcDNA组比较,FA+pcDNA-TLR4组G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05),细胞克隆形成数、S期和G2/M期细胞比例、CyclinD1、CyclinE、Bcl-2蛋白及TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05).结论:FA通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制U937细胞增殖,促进细胞凋亡.