目的 构建稳定表达Cas9蛋白的工具细胞,并利用短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)编辑技术改造1型单纯疱疹病毒(HSV-1),获得ICP34.5基因敲除的oHSV-1/Ecfp重组病毒.方法 利用慢病毒包装体系,将包装Cas9表达质粒的病毒感染HEK293T细胞,然后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞株,通过聚合酶链式反应(PCR)及蛋白质免疫印迹技术检测Cas9基因及蛋白表达情况;利用分子克隆技术构建HSV-1病毒ICP34.5基因敲除的基因编辑质粒(pU6-Ecfp);pU6-Ecfp转染293T-Cas9细胞后感染野生型HSV-1病毒,在胞内通过CRISPR/Cas9技术敲除HSV-1病毒中ICP34.5基因,再利用增强型青色荧光(Ecfp)示踪及极限稀释法进行病毒富集纯化,通过PCR法进行oHSV-1/Ecfp病毒鉴定.结果 PCR扩增、核酸电泳及蛋白质免疫印迹技术结果显示,细胞株293T-Cas9高转录Cas9基因及高表达Cas9蛋白;通过PCR鉴定及荧光示踪结果显示,基因编辑质粒pU6-Ecfp构建成功;Ecfp荧光示踪、PCR扩增及核酸电泳结果显示,Ecfp成功插入ICP34.5基因敲除位点,获得oHSV-1/Ecfp重组病毒.结论 稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞可作为CRISPR/Cas9基因编辑的工具细胞,构建的HSV-1/Ecfp病毒实现了ICP34.5基因敲除及Ecfp示踪蛋白的敲入.

目的 评估晚期肝细胞癌行介入联合靶向及免疫转化治疗后序贯手术切除的临床特征,探讨其安全性及有效性.方法 回顾性收集并分析西安交通大学附属三二○一医院自2021年6月—2023年5月期间收治的10例初始不可切除的晚期肝癌患者的临床数据.结果 10例患者中,8例为男性,2例为女性,中位年龄55(33～72)岁;Child-Pugh分级标准A级6例,B级4例;CNLC分期Ⅱb期4例,Ⅲa期6例;ECOGps评分均≤1分;6例合并肝硬化,4例无肝硬化;合并门静脉癌栓6例,无门静脉癌栓者4例;转化治疗前最大肿瘤直径13 cm,治疗前AFP＞400 ng/mL者7例,AFP＜400 ng/mL者3例;乙肝患者7例,丙肝2例,1例无肝炎;转化治疗方案:TACE+靶向+免疫方案治疗的有5例、HAIC+靶向+免疫方案5例,治疗过程中发生高血压4例、乏力2例、腹泻1例;中位转化时间为4月;转化治疗后术前的肿瘤最大直径为8.8 cm,转化治疗后术前的中位AFP水平17.2 ng/mL,术前影像学评估(mRECIST)CR 4例,PR 3例,SD 3例;术前PS评分均≤1分.转化后行手术切除:3例行肝部分切除,7例行半肝切除;经腹腔镜手术7例,开腹手术3例.中位手术时间240 min,中位术中出血量400 mL,术后中位住院天数为8 d,术后中位拔除引流管的时间为7 d.术后病理结果pCR3例,pPR有7例,MVI分级M0有8例,M1有2例,术后切缘均为阴性.术后出现腹水1例,胆漏1例,余无明显术后并发症.术后中位随访时间8个月,1例出现复发,随访期间无患者死亡.结论 部分晚期肝细胞癌患者行介入等局部治疗联合靶向及免疫转化治疗后序贯手术切除是安全有效的.

目的:本研究旨在检测miR-27a-3p在肺腺癌中的表达水平,及其对肺腺癌细胞恶性生长和迁移的影响及分子机制.方法:整合公共数据分析miR-27a-3p在肺腺癌中的表达水平和预后价值.以肺腺癌细胞为研究对象,通过转染inhibitor降低miR-27a-3p水平,EdU检测细胞增殖活性,Transwell小室检测细胞迁移,实时荧光定量PCR检测miR-27a-3p和其靶基因水平.结果:miR-27a-3p在肺腺癌中呈显著高表达(P＜0.05),且与其他年龄段患者相比,miR-27a-3p在青年肺腺癌患者癌组织中表达水平升高.高表达miR-27a-3p肺腺癌患者预后较差.降低miR-27a-3p水平后,细胞增殖活性降低,细胞迁移能力减弱(均P＜0.05).结合公共数据和细胞实验验证发现,在肺腺癌细胞中RELN、NCALD、FZD4和GATA2可能是miR-27a-3p下游靶基因,且RELN、NCALD、FZD4和GATA2在肺腺癌中均呈显著低表达(均P＜0.05).结论:高表达miR-27a-3p可能通过靶向调控RELN、NCALD、FZD4和GATA2促进肺腺癌细胞恶性生长和转移.

目的:分析热休克蛋白家族 H(Hsp110)成员 1[heat shock protein family H(Hsp110)member 1,HSPH1]在宫颈癌组织中的表达及其与预后的相关性.方法:收集2018年2月至2021年1月首次确诊的60例宫颈癌患者的癌组织和相邻非癌组织.通过qRT-PCR检测HSPH1表达,分析其与肿瘤标志物、宫颈癌病理特征之间的关系,并通过Cox回归模型确定3年生存的独立预后因子.利用时间依赖性受试者工作特征(ROC)曲线评估HSPH1预测1年、2年和3年生存的临床价值,并通过外部数据库和细胞实验验证结果.结果:HSPH1在临床样本和GSE29570数据库宫颈癌组织中均呈高表达(P＜0.05),且与CA125、CA19-9、CEA和SCCA呈正相关(均r＞0,P＜0.05).高表达组(≥1.57)肿瘤大小≥4 cm、FIGOⅢ～Ⅳ期、淋巴结转移及淋巴血管空间侵犯比例均高于低表达组(P＜0.05).TCGA数据库和临床样本分析显示,高表达组患者生存率显著低于低表达组(P＜0.01).多因素Cox回归分析显示,HSPH1＜1.57(HR=0.299,P=0.039)和无淋巴结转移(HR=0.245,P=0.003)是独立预后因子.HSPH1预测1年、2年和3年生存的曲线下面积分别为0.82、0.85和0.88.结论:HSPH1在宫颈癌组织中的高表达与患者较差的预后之间存在显著相关,HSPH1可作为宫颈癌预后评估和治疗靶点的潜在生物标志物.

目的:探究LncRNA HCG18调控CD8+T细胞抗鼻咽癌细胞的功能及机制.方法:qRT-PCR检测鼻咽癌组织及癌旁组织 HCG18表达以及人鼻黏膜上皮细胞 HNEpC和人鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HONE-1、HNE-2 中 HCG18 表达.CNE1 细胞分为 si-HCG18 组、si-NC 组、si-HCG18+PD-L1组,HNE-2细胞分为 HCG18组、Vector组和 HCG18+sh-PD-L1组,上述各组CNE1细胞和 HNE-2细胞分别与 CD8+T 细胞共孵育 24h(si-HCG18+CD8+T 组、si-NC+CD8+T 组、si-HCG18+PD-L1+CD8+T组、HCG18+CD8+T 组、Vector+CD8+T 组和 HCG18+sh-PD-L1+CD8+T 组),酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测共孵育体系中INF-γ、TNF-α、IL-2浓度,细胞毒性试剂 盒检测肿瘤细胞裂解率.Western blot检测PD-L1蛋白表达.双荧光素酶报告基因实验验证HCG18与miR-20b-5p的靶向关系,miR-20b-5p与PD-L1的靶向关系.结果:鼻咽癌组织中HCG18表达显著高于癌旁组织,CNE1、CNE2、HONE-1、HNE-2细胞中HCG18表达均显著高于 HNEpC细胞(P＜0.05).si-HCG18组CNE1细胞中PD-L1表达显著低于si-NC 组(P＜0.05),HCG18组 HNE-2细胞PD-L1表达显著高于 Vector 组(P＜0.05),相比于 si-NC+CD8+T 组,si-HCG18+CD8+T 组共孵育体系中 INF-y、TNF-α、IL-2浓度显著增加(P＜0.05),CNE1细胞裂解率显著增加(P＜0.05),相比于si-HCG18+CD8+T组,si-HCG18+PD-L1+CD8+T 组共孵育体系中 INF-γ、TNF-α、IL-2 浓度显著降低(P＜0.05),CNE1 细胞裂解率显著降低(P＜0.05).相比于Vector+CD8+T组,HCG18+CD8+T组共孵育体系中INF-γ、TNF-α、IL-2浓度显著降低(P＜0.05),HNE-2细胞裂解率显著降低(P＜0.05),相比于HCG18+CD8+T组,HCG18+sh-PD-L1+CD8+T组共孵育体系中INF-γ、TNF-α、IL-2浓度显著增加(P＜0.05),HNE-2细胞裂解率显著增加(P＜0.05).miR-20b-5p 为 HCG18 靶基因,PD-L1 为 miR-20b-5p 靶基因.结论:HCG18 上调鼻咽癌细胞PD-L1表达并且抑制CD8+T细胞的抗肿瘤活性.

目的:探究circ-NDRG1 在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及其通过靶向miR-1271 对口腔鳞状细胞癌HSC-3 细胞恶性生物学行为的影响.方法:利用TCGA数据库分析口腔鳞状细胞癌组织中circ-NDRG1 的表达水平,分析circ-NDRG1 表达与患者预后生存期的相关性.实时荧光定量PCR(qPCR)检测circ-NDRG1 在永生化口腔角质细胞(HOK)和口腔鳞状细胞癌HSC-3、SCC-25、CAL-27、Tca-8113 细胞中的表达水平.利用Lipofectamine 2000 将NC inhibitor、circ-NDRG1 inhibitor分别转染HSC-3 细胞,分别为Anti-NC组和Anti-circ-NDRG1 组.MTT法和Transwell小室实验分别检测各组HSC-3 细胞增殖和侵袭能力.Western blot检测各组HSC-3 细胞增殖蛋白(CDK3、Cyclin C)和上皮间质转化(EMT)蛋白(ZLF8、Notch、SIX1)表达.利用TCGA数据库分析口腔鳞状细胞癌组织中circ-NDRG1 与miR-1271 表达的关系.双荧光素酶报告实验验证circ-NDRG1 和miR-1271 的靶向关系.qPCR检测各组HSC-3 细胞中miR-1271 的表达.结果:TCGA数据库显示口腔鳞状细胞癌组织中circ-NDRG1 的表达高于癌旁组织(P<0.01).口腔鳞状细胞癌患者预后生存期与circ-NDRG1 表达水平呈负相关(P<0.01).与HOK细胞相比,HSC-3、SCC-25、CAL-27、Tca-8113 细胞中circ-NDRG1 呈高表达(P<0.01).与 Anti-NC组相比,低表达 circ-NDRG1 能够抑制HSC-3 细胞的增殖能力(P<0.05)和侵袭能力(P<0.01).与Anti-NC组相比,低表达circ-NDRG1 能够下调HSC-3 细胞中CDK3、Cyclin C、ZLF8、Notch、SIX1 蛋白的表达(P<0.01).口腔鳞状细胞癌组织中circ-NDRG1 表达水平与miR-1271 表达水平呈负相关(P<0.01).circ-NDRG1 能够靶向结合miR-1271(P<0.01).与Anti-NC组相比,低表达circ-NDRG1能够上调HSC-3 细胞中miR-1271 的表达(P<0.01).结论:口腔鳞状细胞癌组织中circ-NDRG1 呈高表达,沉默circ-NDRG1 通过靶向调控miR-1271 表达抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭和EMT进程.

目的 基于网络药理学和实验研究探讨青光安Ⅱ号方对青光眼视神经的保护作用机制.方法 通过TCMSP数据库筛选青光安Ⅱ号方成分靶点,在GeneCards、Disgenet、CTD数据库挖掘青光眼相关靶点,进而筛选青光安Ⅱ号方作用于青光眼的靶点;制作蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络取其交集,并通过GO分析和KEGG富集分析.建立自发性慢性高眼压DBA/2J青光眼小鼠模型,将C57BL/6J小鼠设置为空白组(等体积蒸馏水),DBA/2J小鼠随机分为模型组(等体积蒸馏水)、益脉康组[0.31 g/(kg·d)]、青光安Ⅱ号方低浓度组[0.85 g/(kg·d)]、青光安Ⅱ号方中浓度组[1.7 g/(kg·d)]、青光安Ⅱ号方高浓度组[3.4 g/(kg·d)],每组 8只,每日灌胃 1 次.干预 4周后,触式眼压笔监测小鼠眼压;HE染色观察小鼠视网膜形态结构;Western blot检测沉默信息调节因子-1(silent information regulator type-1,SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(peroxisome proliferation-activated receptor-γ-coactivator 1α,PGC-1α)的蛋白表达水平;qRT-PCR检测SIRT1、PGC-1α的mRNA表达水平.结果 从青光安Ⅱ号方共筛选得到 101 个活性成分和 245 个相关靶点,2 412个青光眼疾病相关基因靶点;药物-活性成分-靶点相互作用最强的 5个靶点分别是前列腺素内过氧化物合成酶 2、核受体共激活因子 2、胃蛋白酶原Ⅱ、前列腺素内过氧化物合成酶 1 以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG);PPI网络显示较强的靶点是SIRT1、PPARG;GO分析和KEGG富集分析得到细胞衰老、IL-17 等信号通路.与给药前相比,给药后用药组眼压显著降低(P<0.01).给药后,与空白组相比,模型组眼压显著升高(P<0.01),视网膜中SIRT1、PGC-1α mRNA表达量和蛋白表达量均显著降低(P<0.01);与模型组相比,用药组眼压显著降低(P<0.01),SIRT1、PGC-1α mRNA表达量和蛋白表达量均显著升高(P<0.01).与益脉康组和青光安Ⅱ号方低浓度组相比,青光安Ⅱ号方中、高浓度组SIRT1、PGC-1α mRNA表达量和SIRT1蛋白表达量显著升高(P<0.01);与青光安Ⅱ号方低浓度组相比,青光安Ⅱ号方高浓度组PGC-1α蛋白表达量均显著上升(P<0.01).与青光安Ⅱ号方中浓度组相比,青光安Ⅱ号方高浓度组PGC-1α mRNA表达量和蛋白表达量显著升高(P<0.01).结论 青光安Ⅱ号方可有效调控SIRT1/PGC-1α信号通路,抑制RGC的丢失,主要在氧化应激、细胞衰老等方面对青光眼视神经发挥保护作用.

目的:探讨去氧鬼臼毒素（DPPT）是否通过调控长链非编码RNA ZFPM2-AS1（LncRNA ZFPM2-AS1）/微小RNA-515-5p（miR-515-5p）分子轴而抑制结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭。方法:体外培养人结肠癌LoVo细胞，随机分为Control组、DPPT-L组、DPPT-M组、DPPT-H组。甲基噻唑基四唑（MTT）检测细胞增殖；Transwell小室实验检测迁移及侵袭；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测ZFPM2-AS1、miR-515-5p的表达水平；LoVo细胞中转染pcDNA-ZFPM2-AS1，采用上述方法检测细胞增殖、迁移及侵袭；双荧光素酶报告实验验证ZFPM2-AS1、miR-515-5p的靶向关系；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞周期蛋白1（CyclinD1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、P21的表达量。结果:与Control组比较，DPPT-L组、DPPT-M组、DPPT-H组细胞存活率降低（ P<0.05），迁移细胞数、侵袭细胞数减少（ P<0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低（ P<0.05），P21蛋白水平升高（ P<0.05），ZFPM2-AS1表达水平降低（ P<0.05），miR-515-5p表达水平升高（ P<0.05），且DPPT-L组、DPPT-M组、DPPT-H组上述指标比较，差异均有统计学意义（ P<0.05）；ZFPM2-AS1可靶向结合miR-515-5p；与DPPT-H+pcDNA组比较，DPPT-H+pcDNA-ZFPM2-AS1组细胞存活率升高（ P<0.05），迁移细胞数、侵袭细胞数增多（ P<0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高（ P<0.05），P21蛋白水平降低（ P<0.05）。 结论:DPPT可能通过下调ZFPM2-AS1的表达及上调miR-515-5p的表达从而抑制结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭。

目的:了解青海省玉树藏族自治州（简称玉树州）鼠疫耶尔森菌（简称鼠疫菌）规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）的基因分型，探讨其遗传特征。方法:选取1963 - 2007年分离自玉树州鼠疫自然疫源地的44株代表性鼠疫菌，提取DNA，针对CRISPR的3个位点（YPa、YPb和YPc）设计引物，进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序及分析，鉴定CRISPR间区序列（spacer），确定CRISPR基因型和类群。结果:44株鼠疫菌在CRISPR 3个位点上共有23种spacer，YPa位点14种、YPb位点6种、YPc位点3种，其中有2种新spacer，a106和a107。根据spacer阵列形式，44株鼠疫菌被分为15个CRISPR基因型、6个CRISPR类群，6个类群分别为Cb4、Cc3′、Ca7、Ca7′、Ca△5′和Ca35′，其中Ca7为主要流行类群（34株）。结论:玉树州鼠疫菌CRISPR位点具有多种基因型，遗传多态性较高，种群结构复杂。

目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。