目的 基于网络药理学方法和动物实验探讨桔梗白散治疗肺腺癌的作用靶点及机制.方法 借助TCMSP数据库及GeneCards、PharmGKB、DrugBank、TTD、OMIM数据库检索桔梗白散有效成分相关靶点及肺腺癌相关靶点,获取二者交集靶点,运用Cytoscape3.8.0软件构建交集靶点蛋白相互作用(PPI)网络和中药活性成分-靶点网络,筛选关键成分及核心靶点.对交集靶点进行GO和KEGG富集分析.运用PyMOL、AutoDockTools1.5.6软件对关键成分与核心靶点进行分子对接.建立肺癌小鼠模型,将小鼠随机分为空白组、模型组、顺铂组、桔梗白散联合顺铂组及桔梗白散低、中、高剂量组,给药组分别予相应药物干预14 d,计算抑瘤率,HE染色观察肿瘤组织形态,RT-qPCR及Western blot检测肿瘤组织PI3K、PTEN、Akt、mTOR基因及蛋白表达.结果 网络药理学方法筛选出桔梗白散治疗肺腺癌的TP53、CASP3、BCL2L1、AKT1等核心靶点,富集的关键通路有PI3K-Akt信号通路等.桔梗白散能有效抑制模型小鼠肿瘤生长;与模型组比较,桔梗白散中、高剂量组PI3K、Akt、mTOR mRNA表达降低,PTEN mRNA表达升高,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值降低,PTEN蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01).结论 桔梗白散治疗肺腺癌具有多层次、多靶点的特点,可能通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进肿瘤细胞凋亡与自噬,从而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用.

目的:探讨微小RNA(miRNA，miR)-494在脊髓损伤中的作用及其意义。方法:应用脊髓表面挫伤的方法建立大鼠脊髓损伤模型。分为1个假损伤对照组和5个脊髓损伤组，每组5只大鼠(购自复旦大学实验动物中心)。用miRNA芯片分析脊髓损伤后不同时间miRNA的表达。用agomiR-494鞘内治疗后，评定大鼠运动功能。正态性采用Shapiro-Wilk正态检验，组间差异采用单因素方差分析和双侧 t检验。 结果:与假损伤对照组比较，有14个miRNA上调，有46个miRNA下调2倍，而miR-494是最显著下调的miRNA之一。与单纯SCI组比较，agomiR-494鞘内治疗后的SCI＋agomiR-494组，大鼠运动功能明显改善，剩余组织(甲酚紫染色评估)增多，TUNEL阳性细胞减少。agomiR-494对miR-494的上调可促进脊髓损伤后大鼠的功能恢复，减小病变大小并抑制凋亡细胞。脊髓组织中miR-494的表达与第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)的表达呈负相关( r＝－0.834， P<0.05)。此外，miR-494通过直接靶向BV-2细胞中的3’端非编码区(3’UTR)来抑制蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径的负调节剂PTEN。 结论:在大鼠脊髓损伤模型中miR-494的过表达通过抑制PTEN的表达来激活Akt/mTOR信号通路，对脊髓损伤具有保护作用。

目的:通过体外培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)观察微小RNA(miRNA)-29a与第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)的调节对神经细胞增殖和轴突生长的作用。方法:通过上海中科院细胞库购买的SH-SY5Y细胞经过体外培养(4×10 4/ml)分别转染miRNA-29a的激动剂和抑制剂(40 nmol/L)，构建miRNA-29a不同表达水平的细胞。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测细胞转染效果(转染24 h)和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因表达水平(转染48 h)。转染72 h后通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测不同细胞中PTEN、Akt和mTOR蛋白的表达和磷酸化水平，通过神经形态学和二苯基四氮唑溴盐比色法(MTT)检测细胞的增殖和轴突长度。通过单因素方差分析及LSD- t法检验比较各组数据。 结果:转染miRNA-29a激动剂组的miRNA-29a表达水平明显高于miRNA-29a抑制组(9.03±0.12比0.31±0.03， t＝241.70， P<0.05)，而激动组PTEN基因和蛋白的表达水平明显低于抑制组(0.31±0.02比3.26±0.23、0.30±0.06比3.36±0.15， t＝45.09、58.79， P<0.05)。miRNA-29a激动组中Akt、mTOR蛋白的磷酸化水平明显高于抑制组(3.26±0.13比0.42±0.03、2.57±0.13比0.31±0.04， t＝71.45、51.55， P<0.05)。在miRNA-29a激动组中，SH-SY5Y细胞增殖活性和轴突长度明显高于miRNA-29a抑制组[0.86±0.07比0.44±0.03、(157.56±11.13) μm比(43.48±4.92) μm， t＝13.89、31.11， P<0.05]。 结论:miRNA-29a可以通过干预PTEN表达，调节磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt/mTOR信号通路中Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平，促进SH-SY5Y细胞增殖和轴突生长。

目的:探讨长链非编码RNA LINC01235在胃癌中的表达及其作用机制。方法:肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库检测LINC01235在胃癌及癌旁组织的表达；分析LINC01235对胃癌患者预后的价值；收集新鲜胃癌及癌旁组织验证生物信息学结果。调控人胃癌细胞株MGC-803、SGC-7901中LINC01235表达，检测细胞增殖、侵袭和转移能力；蛋白质印迹法(Western blot)检测调控LINC01235的表达对磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。应用SAS 9.4软件进行统计学分析， t检验分析实验结果。 结果:TCGA数据分析表明与癌旁组织比较，LINC01235在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织(6.340±1.705比3.115±1.558， Z＝10.026， P<0.05)，且LINC01235高表达的患者预后较差( χ2＝6.902， P<0.05)。临床标本验证结果与生物信息学结果相符。蛋白质印迹结果显示，胃癌组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路中磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化雷帕霉素靶(p-mTOR)的表达水平高于癌旁组织(p-Akt为1.154±0.459比0.326±0.150， t＝9.392， P<0.01；p-mTOR为0.665±0.310比0.270±0.121， t＝6.501， P<0.01)。在MGC-803细胞中上调LINC01235后细胞的增殖能力显著比对照组增强(24 h为0.203±0.027比0.142±0.042， t＝2.993， P<0.05；48 h为0.503±0.106比0.247±0.064， t＝5.064， P<0.01；72 h为0.917±0.118比0.55±0.11， t＝5.573， P<0.01)、侵袭和转移能力显著比对照组增强(139.333±22.151比57.833±15.639， t＝-7.362， P<0.01；111.667±15.016比73.667±14.024， t＝-4.530， P<0.01)；在SGC-7901细胞中抑制LINC01235的表达后细胞的增殖能力显著比对照组降低(48 h为0.425±0.133比0.667±0.091， t＝-3.678， P<0.01；72 h为0.565±0.157比0.945±0.200， t＝-3.661， P<0.01)、侵袭和转移能力显著比对照组降低(50.667±13.231比141.167±15.224， t＝ 10.991， P<0.01；57.667±14.348比166.167±25.631， t＝ 9.048， P<0.01)。在MGC-803细胞中上调LINC01235表达后p-Akt、p-mTOR、细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)表达比对照组增强(p-Akt为0.851±0.138比0.366±0.138， t＝-4.304， P<0.05；p-mTOR为0.830±0.177比0.128±0.020， t＝-6.826， P<0.01；Cyclin E1为0.745±0.122比0.436±0.137， t＝-2.917， P<0.05)，而人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)表达则比对照组减弱(0.256±0.098比0.725±0.108， t＝5.570， P<0.01)；在SGC7901细胞中抑制LINC01235表达后p-Akt、p-mTOR、Cyclin E1表达比对照组减弱(p-Akt为0.544±0.146比1.370±0.209， t＝ 5.612， P<0.01；p-mTOR为0.740±0.108比1.249±0.119， t＝5.486， P<0.01；Cyclin E1为0.744±0.085比1.040±0.148， t＝3.004， P<0.05)，而PTEN表达则比对照组增强(1.021±0.184比0.338±0.134， t＝-5.197， P<0.01)。 结论:LINC01235在胃癌组织中表达增强且与患者预后有关，LINC01235可能通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性参与胃癌的进展。

目的 观察归脾汤对心脾两虚型孤独症谱系障碍大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达情况的影响,探讨归脾汤可能的作用机制.方法 取20只受孕SD大鼠,随机选择16只给予心脾两虚型孤独症谱系障碍患儿粪便配制的液体灌胃,其余4只给予等体积生理盐水灌胃作为正常对照组,灌胃持续至分娩后21 d,通过三箱社交实验并结合大鼠体重、摄食量、大便情况、活动量、神态等筛选出心脾两虚型孤独症谱系障碍造模成功的子代大鼠.随机选取造模成功的子代21日龄大鼠40只,然后随机分为模型组、双歧杆菌组和归脾汤低、中、高剂量组,每组8只,另选择正常对照组子代大鼠8只作为正常组.双歧杆菌组给予双歧杆菌0.45 g/kg灌胃,归脾汤低、中、高剂量组分别给予2.2 g/kg、4.4 g/kg、8.8 g/kg的归脾汤灌胃,正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃,均1次/d,连续灌胃14 d.记录大鼠灌胃第7天、第14天时体重,三箱社交实验评估大鼠社交能力、社交新颖性,比色法检测大鼠海马组织中谷氨酸含量,Western blot法检测大鼠海马组织中N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)、磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)、PI3K、Akt、mTOR、p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)蛋白表达情况,RT-qPCR法检测大鼠海马组织中NR2B、PTEN、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K mRNA表达情况.结果 与正常组比较,模型组大鼠体重明显降低,大鼠与空笼接触时间明显延长(P＜0.05),与陌生鼠2接触时间明显缩短(P＜0.05);海马组织中谷氨酸含量和海马组织中NR2B、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K蛋白及mRNA相对表达量均明显升 高(P均＜0.05),海马 组织中PTEN蛋白及mRNA相对表达量均明显降低(P均＜0.05).与模型组比较,归脾汤各组及双歧杆菌组大鼠体重均明显增加(P均＜0.05),大鼠与空笼接触时间明显缩短(P均＜0.05),与陌生鼠2接触时间均明显延长(P均＜0.05),海马组织中谷氨酸含量和海马组织中NR2B、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K蛋白及mRNA相对表达量均明显降低(P均＜0.05),海马组织中PTEN蛋白及mRNA相对表达量均明显升高(P均＜0.05).归脾汤中、高剂量组大鼠体重及海马组织中PTEN蛋白及mRNA相对表达量均明显高于双歧杆菌组(P均＜0.05),海马组织中谷氨酸含量和海马组织中NR2B、PI3K、mTOR、p70S6K蛋白及mRNA相对表达量均明显低于双歧杆菌组(P均＜0.05).结论 归脾汤能有效改善心脾两虚型孤独症谱系障碍大鼠社交能力和社交新颖性,作用机制可能与下调谷氨酸含量、抑制谷氨酸与NR2B受体结合,从而抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活化有关.

探讨红景天苷(salidroside,SAL)抗血小板源性生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)诱导人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells,HASMC)表型转化,并对其药理机制进行探析.应用乳酸脱氢酶释放实验筛选SAL的安全有效浓度.应用 PDGF-BB诱导 HASMC建立细胞表型转化体外模型.分为对照组、模型组、SAL 组.应用CCK-8法检测细胞增殖率,Transwell检测细胞迁移,荧光标记的鬼笔环肽对F-肌动蛋白(fibrous actin,F-actin)染色观察细胞骨架结构,Western blot检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、迁移相关蛋白基质金属蛋白酶 9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)、表型转换标志物α-肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN).由结果可知造模使HASMC增殖明显、迁移增加并促使HASMC由收缩表型转变成分泌表型,使其细胞骨架结构排列紊乱.加入SAL后HASMC增殖、迁移能力减弱,"收缩表型标志物"α-SMA表达增加,"分泌表型标志物"OPN表达减少、细胞骨架结构排列紊乱改善.机制研究细胞信号相关通路Akt、mTOR,以及Akt/mTOR信号通路上下游相关蛋白磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue,PTEN)、血小板源性生长因子受体β(platelet-derived growth factor re-ceptor β,PDGFR-β)及缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达.模型组HASMC信号通路Akt、mTOR蛋白磷酸增加,PTEN、HIF-1α、PDGFR-β相对表达量显著增高.SAL组磷酸化Akt、mTOR表达减少,PTEN、PDGFR-β、HIF-1α蛋白的表达降低.综上所述,SAL对PDGF-BB诱导的HASMC具有保护作用,可能与HASMC的PDGFR-β/Akt/mTOR/HIF-1α信号通路相关.

目的:探讨幽门螺杆菌(H.pylori)诱导的人胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p对巨噬细胞自噬和极化的影响及机制,为进一步阐明H.pylori的致癌机制提供新线索.方法:超高速离心法和试剂盒提取H.pylori刺激组和对照组AGS细胞释放的外泌体,采用透射电镜(TEM)、纳米粒子跟踪分析(NTA)和Western blot对外泌体进行鉴定;qRT-PCR检测H.pylori诱导的胃癌细胞AGS源性外泌体中miR-382-5p表达;将miR-382-5p mimic转染至THP-1巨噬细胞,Western blot检测巨噬细胞自噬标志物LC3Ⅱ、P62、Beclin-1的表达,免疫荧光检测自噬小体数量;Western blot检测PTEN蛋白、其下游蛋白PI3K、AKT、mTOR及其磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平;流式细胞术检测巨噬细胞表型分子CD206和HLA-DR表达水平;ELISA检测巨噬细胞上清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和精氨酸酶1表达水平.结果:提取的外泌体符合外泌体形态,且高表达其表面标志蛋白CD9、CD63、TSG101;与空白对照组相比,H.pylori感染组AGS源性外泌体中miR-382-5p表达显著升高;miR-382-5p mimic转染导致巨噬细胞LC3、Beclin-1表达降低,P62表达升高,自噬小体数量降低;PTEN蛋白表达降低,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达明显增加.转染同时导致巨噬细胞M2型标志蛋白CD206表达增加,M1型标志蛋白HLA-DR表达降低;IL-10和精氨酸酶1表达增加,IL-6和TNF-α表达降低.抑制剂BEZ235预处理可部分逆转miR-382-5p对巨噬细胞自噬和极化的影响.结论:H.pylori诱导的胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p通过靶向PTEN基因,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制巨噬细胞自噬并促进其M2极化.

目的 观察归芪益元膏对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长的抑制作用,探讨归芪益元膏联合顺铂通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路抗肿瘤的分子机制.方法 将60只C57BL/6小鼠随机分为6组,每组10只,除空白组(0.9％NaCl)外,其余均建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型,将荷瘤小鼠随机分为模型组(0.9％NaCl)、对照组(0.9％NaCl,顺铂5 mg·kg-1)和低、中、高剂量实验组(归芪益元膏1.6、3.3、6.6 g·kg-1,顺铂5 mg·kg-1).以流式细胞术检测小鼠骨髓髓源性抑制细胞(MDSCs)水平;以蛋白质印迹法检测肿瘤组织中相关蛋白的表达.结果 对照组和低、中、高剂量实验组的抑瘤率分别为(39.87±4.45)％、(45.74±14.97)％、(57.78±4.70)％和(69.82±11.05)％.空白组、模型组、对照组及低、中、高剂量实验组的骨髓中MDSCs占比分别为(36.13±1.08)％、(68.63±2.94)％、(58.93±2.02)％、(58.00±1.50)％、(50.93±5.06)％和(43.07±2.41)％.模型组、对照组和低、中、高剂量实验组p-PI3K/PI3K蛋白表达分别为0.97±0.03、0.77±0.02、0.72±0.01、0.68±0.03 和 0.53±0.02,PTEN 分别为0.21±0.07、0.65±0.07、0.74±0.06、0.99±0.13 和 1.11±0.13,p-Akt/Akt 分别为 1.01±0.02 和 0.82±0.02、0.77±0.00、0.72±0.03 和 0.52±0.04,p-mTOR/mTOR分别为 1.01±0.01、0.76±0.05、0.69±0.07、0.59±0.06 和0.47±0.06;低、中、高剂量实验组与对照组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 归芪益元膏联合顺铂能明显改善小鼠生存质量及抑制肿瘤生长,其机制可能是抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,增强肿瘤细胞凋亡及自噬.

目的·研究F-box蛋白38(F-box only protein 38,FBXO38)对眼部黑色素瘤增殖的作用以及潜在的调控通路.方法·使用FBXO38短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)和FBXO38过表达质粒构建FBXO38敲低以及过表达的人皮肤黑色素瘤A375和葡萄膜黑色素瘤OMM2.3细胞系,并通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Western blotting在转录和蛋白水平验证FBXO38的敲低和过表达效率.通过克隆形成实验、BrdU免疫荧光染色和CCK8细胞增殖实验,探究FBXO38对黑色素瘤细胞增殖的影响.使用肿瘤基因组图谱计划数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA),分析FBXO38高表达和低表达组中的差异表达基因,并进行京都基因与基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes,KEGG)通路富集,揭示与FBXO38相关的信号通路.进一步通过CCK8细胞增殖实验检测信号通路抑制剂对不同FBXO38表达量细胞的抑制率.同时通过qRT-PCR和Western blotting,验证在敲低FBXO38之后该通路是否激活.结果·qRT-PCR和Western blotting验证A375和OMM2.3细胞系中的FBXO38的mRNA及蛋白质表达水平,发现与对照组相比敲低组的FBXO38表达水平下降,与野生型相比过表达组的FBXO38的表达水平提高(P＜0.05).克隆形成实验、BrdU免疫荧光染色和CCK8细胞增殖实验显示,敲低FBXO38显著增强A375和OMM2.3细胞的增殖能力(P＜0.05),反之过表达FBXO38抑制A375和OMM2.3细胞增殖(P＜0.05).KEGG通路富集分析显示,在皮肤黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤中,FBXO38的表达影响磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K-Akt)通路激活.与对照组相比,PI3K抑制剂LY294002和mTORl抑制剂Everolimus对FBXO38敲低组的抑制率显著提升(P＜0.05),对FBXO38过表达组的抑制率则显著下降(P＜0.05).Western blotting结果显示,敲低FBXO38之后,与PI3K-Akt通路相关的PTEN、P21和P53蛋白水平下降,而MDM2蛋白水平上升.qRT-PCR结果显示在FBXO38敲低细胞中P53转录水平显著下降(P＜0.05),而MDM2转录水平显著上升(P＜0.05).结论·FBXO38通过PI3K-Akt信号通路参与调控眼部黑色素瘤细胞的增殖.

目的 探讨威灵仙总皂苷通过调控微小RNA(miRNA)-410-3p对胶质瘤细胞生物学活性的影响以及对第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromo-some ten/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PTEN/Akt/mTOR)信号通路的调节作用.方法 用不同浓度威灵仙总皂苷处理U87细胞后,用CCK-8法检测细胞存活率.将对数生长期U87细胞随机分为对照组、NC组(转染miR-410-3p NC)、inhibitor 组(转染 miR-410-3p inhibitor)以及 inhibitor 联合威灵仙总皂苷组(转染 miR-410-3p inhibitor 24 h 后,40 μmol·L-1 威灵仙总皂苷处理),依次检测miR-410-3p表达水平、细胞存活率、细胞迁移和侵袭力,miR-410-3p与PTEN的靶向关系和PTEN、p-Akt、Akt、p-mTOR以及mTOR蛋白的相对表达量.结果 细胞存活率随威灵仙总皂苷浓度的升高而降低(P＜0.05);与NC组比较,inhibitor组划痕愈合率、侵袭细胞数量、p-Akt和p-mTOR蛋白的相对表达量升高,miR-410-3p表达水平以及PTEN蛋白的相对表达量降低(P＜0.05);与inhibitor组比较,inhibitor联合威灵仙总皂苷组细胞存活率、划痕愈合率、侵袭细胞数量、p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量降低,miR-410-3p表达水平以及PTEN蛋白相对表达量升高(P＜0.05).结论 威灵仙总皂苷可抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为,其可能是通过上调miR-410-3p表达,进而调控PTEN/Akt/mTOR信号通路发挥作用.