目的:初步探究微小RNA-203（miR-203）调控锌指蛋白281（ZNF281）对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响。方法:常规培养人血管内皮细胞系ECV304、人黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2，实时荧光定量PCR检测各细胞系中miR-203表达情况，Western免疫印迹法检测各细胞系中ZNF281蛋白水平。A375、M14细胞分别分为5组：对照组（细胞正常培养）、miR-203模拟物对照组（加入miR-203模拟物阴性对照）、miR-203抑制剂对照组（加入miR-203抑制剂阴性对照）、miR-203模拟物组（加入miR-203模拟物）、miR-203抑制剂组（加入miR-203抑制剂）。实时荧光定量PCR检测各组A375、M14细胞中miR-203的表达，CCK8法检测各组A375、M14细胞增殖活性，Transwell实验检测各组A375、M14细胞迁移数量，Western免疫印迹法检测各组A375、M14细胞中ZNF281蛋白的表达。双荧光素酶验证miR-203与ZNF281的靶向关系。多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK- q法。 结果:与血管内皮细胞系ECV304相比，黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2中miR-203表达水平较低（均 P < 0.05），ZNF281蛋白水平较高（均 P < 0.05）。与对照组、miR-203模拟物对照组、miR-203抑制剂对照组相比，miR-203模拟物组A375、M14细胞中miR-203水平均显著升高（ F = 487.632、68.454，均 P < 0.05），细胞迁移数量均显著降低（均 P < 0.05），ZNF281蛋白表达均显著降低（均 P < 0.05）；miR-203抑制剂组A375、M14细胞中miR-203表达均显著降低（均 P < 0.05），细胞迁移数量均显著增加（均 P < 0.05），A375细胞中ZNF281蛋白表达显著升高（均 P < 0.05），36、48、60、72 h A375细胞增殖活性显著升高（均 P < 0.05），24、36、48、60、72 h M14细胞增殖活性均显著升高（均 P < 0.05）。miR-203与ZNF281之间存在靶位点。 结论:上调miR-203表达可抑制黑素瘤细胞增殖、迁移，下调miR-203表达可促进黑素瘤细胞增殖、迁移，可能通过调控ZNF281的表达实现。

Objective::SOX4, a transcription factor, has been found to contribute to tumorigenesis in several cancers. This study was performed to determine whether SOX4 mediates BRAF inhibitor resistance in melanoma.Methods::Melanoma cell lines with acquired resistance to BRAF inhibitor (SK-MEL-5R, SK-MEL-28R, and A375R) were generated by adding escalating concentrations of PLX4032 into parental SK-MEL-5, SK-MEL-28, and A375 cells for >6 months. The expression of SOX4 and insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) was measured by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blotting. The downstream signaling of IGF-1R was detected by Western blotting. SOX4 and IGF-1R overexpression or knockdown was conducted by lentivirus transfection. Cell viability and apoptosis were demonstrated by MTT and flow cytometry, respectively. The binding ability of SOX4 to IGF-1R promoter was determined by chromatin immunoprecipitation quantitative PCR assay.Results::SOX4 was upregulated in BRAF inhibitor-resistant melanoma cells as compared with parental cells (SK-MEL-5 group, 1.02 vs. 6.33; SK-MEL-28 group, 1.03 vs. 3.22; A375 group, 1.00 vs. 1.86; t=°7.069, 29.26, and 5.291, respectively; all P < 0.01), and PLX4032 treatment could not alter the expression of SOX4 in resistant cells. SOX4 overexpression attenuated the response of parental cells to PLX4032 (for cell viability, SK-MEL-5 group: 77.76% vs. 104.28%, F= 91.50; SK-MEL-28 group: 60.59% vs. 93.13%, F= 171.8; A375 group: 62.50% vs. 80.87%, F= 47.15. For apoptosis rates, SK-MEL-5 group: 34.90% vs. 14.31%, F= 4.781; SK-MEL-28 group, 40.8% vs. 29.4%, F= 13.32, P= 0.063; A375 group: 40.20% vs. 17.09%, F= 11.39; all P < 0.05, otherwise indicated). While SOX4 knockdown enhanced the response of resistant cells to PLX4032 (for cell viability, SK-MEL-5R group: 93.75% vs. 69.53%, F= 94.45, SK-MEL-28R group: 95.60% vs. 66.79%, F= 30.41, A375R group: 95.51% vs. 59.98%, F= 111.6; for apoptosis rates, SK-MEL-5R group: 16.2% vs. 44.4%, F= 25.67, SK-MEL-28R group: 26.59% vs. 44.20%, F= 158.0, A375R group: 5.98% vs. 31.51 %, F= 14.35, and all P < 0.01). Chromatin immunoprecipitation quantitative PCR assay demonstrated that SOX4 binded to the promoter of IGF-1R (1.04 vs. 1.94 [-1044 to -920 bp] and 0.110 vs. 0.139 [GAPDH], F= 534.5, P < 0.01). In addition, SOX4 overexpression increased IGF-1R and its downstream phosphorylated ERK, phosphorylated AKT, and phosphorylated STAT3 expression, while SOX4 knockdown exerted the opposite effects. Moreover, IGF-1R knockdown overcame SOX4 overexpression-induced PLX4032 resistance (cell viability: 35.85% vs. 52.79% vs. 37.84% [A375 group, negative control group vs. SOX4 overexpressing group vs. SOX4 overexpressing + sh-IGF-1R group]; apoptosis rates: 25.30% vs. 9.56% vs. 22.26 [A375 group, negative control group vs. SOX4 overexpressing group vs. SOX4 overexpressing+ sh-IGF-1R group]; F= 13.01 and 41.87, respectively; all P < 0.01), while IGF-1R overexpression abrogated SOX4 knockdown-induced response enhancement to PLX4032 for comparison of negative control group, sh-SOX4 group and sh-SOX4 + IGF-1R overexpressing group (cell viability: 96.62% vs. 86.86% vs. 97.26% (A375R), 98.15% vs. 81.63% vs. 98.49% [SK-MEL-5R]; apoptosis rates: 13.81% vs. 32.00% vs. 12.16 [A375R], 29.70% vs. 41.40% vs. 26.10% [SK-MEL-5R]; F= 13.56, 12.86, 38.81, and 39.85, respectively; all P < 0.01). Conclusion::SOX4 mediates BRAF inhibitor resistance in melanoma through regulation of IGF-1R signaling. SOX4 might serve as a potential target for the treatment of BRAF inhibitor-resistant melanoma.

目的:探讨钠钙交换体（NCX）抑制剂苄普地尔对黑色素瘤细胞增殖、迁移及凋亡的影响及可能的调控机制。方法:收集2023年1 - 12月就诊于中国医学科学院皮肤病医院且组织病理学诊断为色素痣及黑色素瘤患者的组织蜡块各3份，采用免疫组化染色检测组织中NCX1的表达，Western印迹验证NCX1在原代黑色素细胞及黑色素瘤细胞系A375、A875、SK-MEL-28、M14、MV3及SK-MEL-5细胞中的表达情况。采用细胞计数试剂盒8（CCK8）检测不同浓度苄普地尔对黑色素瘤细胞活力的影响，绘制增殖曲线并计算半数抑制浓度（IC50）。采用IC50浓度苄普地尔处理A375及SK-MEL-28细胞后，使用Fluo-4钙离子检测试剂盒检测细胞内钙离子水平，Transwell法和流式细胞仪分别检测黑色素瘤细胞A375、SK-MEL-28及A2058细胞迁移能力及凋亡情况。通过转录组测序、基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析苄普地尔处理对A375细胞中基因表达及通路的影响。采用流式细胞仪检测苄普地尔处理后黑色素瘤细胞内活性氧含量，Western印迹检测内质网应激及线粒体凋亡通路相关分子的表达。两组间比较采用 t检验。 结果:免疫组化检测显示，黑色素瘤组织中NCX1的表达（0.320 ± 0.020）高于色素痣组织（0.235 ± 0.008， t = 4.04， P = 0.016）；Western印迹实验显示，各黑色素瘤细胞系中NCX1蛋白条带灰度均深于原代黑色素细胞中NCX1蛋白条带。CCK8实验显示，随苄普地尔浓度增加黑色素瘤细胞活力逐渐降低。采用IC50浓度（25 μmol/L）的苄普地尔处理后，A375和SK-MEL-28细胞荧光强度（64.82 ± 2.98、75.84 ± 2.07）均高于相应对照组（37.10 ± 2.33、66.54 ± 1.47，均 P < 0.05），A375、SK-MEL-28和A2058细胞的迁移能力（103.00 ± 9.07、67.33 ± 7.22、61.33 ± 1.76）均低于相应对照组（400.00 ± 25.17、276.70 ± 14.63、116.00 ± 10.69，均 P < 0.05），其细胞凋亡率（5.72% ± 0.06%、13.58% ± 0.86%、25.76% ± 1.95%）均高于相应对照组（3.99% ± 0.50%、6.47% ± 0.88%、8.01% ± 0.36%，均 P < 0.05）。转录组测序显示，苄普地尔处理A375细胞后119个基因上调，164个基因下调，其中差异表达基因主要与代谢相关通路、内质网应激、肿瘤相关通路有关。活性氧检测显示，苄普地尔处理A375、SK-MEL-28及A2058后活性氧水平（1 907 ± 33、7 607 ± 535、3 380 ± 300）均高于对照组（1 646 ± 16、4 386 ± 163、2 110 ± 66，均 P < 0.05）。Western印迹实验显示，苄普地尔处理A375及SK-MEL-28后，C/EBP同源蛋白（CHOP）、活化转录因子4（ATF4）的表达高于对照组；采用苄普地尔及钙离子拮抗剂BAPTA处理A375和SK-MEL-28后，细胞内CHOP及ATF4的表达低于单独使用苄普地尔组。 结论:NCX抑制剂苄普地尔可增加黑色素瘤细胞内Ca 2+含量，抑制黑色素瘤细胞增殖及迁移，促进黑色素瘤细胞凋亡，该过程可能与内质网应激等生物学过程密切相关。

目的:探究溶质载体家族24成员5（SLC24A5）的表达与皮肤黑色素瘤（SKCM）细胞增殖和侵袭的关系，对SLC24A5作为SKCM的潜在生物标志物和治疗靶点的可能性进行初步探讨。方法:利用生物信息学的方法搜集相关信息，随后建立敲低SLC24A5的MEL-526和SK-HEL-5黑色素瘤细胞模型，通过Western blot与实时定量聚合酶链式反应（qPCR）实验验证SLC24A5的敲低效率，并探讨敲低SLC24A5对SKCM细胞增殖和侵袭的影响。结果:SLC24A5在SKCM组织中的表达显著高于癌旁正常组织，高表达SLC24A5的患者的预后更差。敲低SLC24A5后，MEL-526和SK-HEL-5细胞的增殖受到抑制。结论:SLC24A5在SKCM的进展中扮演着重要角色，有成为SKCM的治疗靶点和生物标志物的潜力。

目的 探讨在黑素瘤组织中miR-122-5p的表达情况,同时研究miR-122-5p对人黑素瘤细胞株SK-MEL-110和A375细胞增殖、细胞周期及凋亡的调控效应.方法 荧光定量PCR检测miR-122-5p在黑素瘤和色素痣组织中的表达;培养SK-MEL-110和A375细胞,瞬时转染miR-122-5p inhibitor及阴性对照inhibitor后,荧光定量PCR检测miR-122-5p的表达,MTT及流式细胞仪方法检测对细胞增殖、周期和凋亡的影响,荧光定量PCR和Western Blot法检测NOP14的mRNA和蛋白水平;应用双荧光素酶基因报告法进一步验证NOP14是否为miR-122-5p的靶基因.结果 miR-122-5p在人色素痣和黑素瘤组织中的相对表达量分别为1.23±0.270和7.65±1.37.转染miR-122-5p inhibitor后,miR-122-5p在SK-MEL-110和A375细胞中的相对表达量分别为0.21±0.08和0.17±0.05.miR-122-5p inhibitor可以显著抑制黑素瘤细胞株SK-MEL-110和A-375细胞的增殖能力,明显增加G1期细胞的比例,但对SK-MEL-110和A-375细胞的凋亡没有明显影响.转染miR-122-5p inhibitor对NOP14 mRNA水平没有明显的影响,但可以显著提高NOP14的蛋白水平表达.荧光素酶报告基因检测显示,共转染miR-122-5p mimics和野生型psi-CHECK2-3′UTR质粒组相对荧光素酶活性为0.21±0.14,较NC和野生型psi-CHECK2-3′UTR质粒转染组(0.56±0.1)显著下降(P<0.01).结论 miR-122-5p在黑素瘤组织中高表达,提示miR-122-5p可能参与黑素瘤的发生发展过程.miR-122-5p可能通过NOP14影响SK-MEL-110和A-375细胞的周期,进而抑制细胞的增殖.

目的 探讨miR-148a-3p靶向PTEN在黑色素瘤中的表达及其对黑色素瘤增殖、迁移及凋亡的影响.方法 收集90例黑色素瘤癌组织及距肿瘤边缘5 cm的正常组织标本,记录患者临床病理资料,检测黑色素瘤组织及癌旁组织中miR-148a-3p、PTEN的表达水平;将miR-148a-3p、PTEN的siRNA转染人黑色素瘤SK-MEL-3细胞系,分别采用CCK8法、Transwell法和流式细胞术检测转染后细胞增殖水平、迁移能力、侵袭能力和凋亡情况.结果 与癌旁正常组织相比,黑色素瘤组织中miR-148a-3p表达明显上调,PTEN表达明显下调(P<0.05).miR-148a-3p表达水平与黑色素瘤淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05),PTEN表达与黑色素瘤淋巴结转移、肿瘤分化程度、TNM分期显著相关(P<0.05).miR-148a-3p siRNA组PTEN基因的表达水平显著上调,细胞生长和迁移能力明显受到抑制,凋亡水平显著增加(P<0.05);miR-148a-3p siRNA+PTEN siRNA组细胞生长和迁移能力明显增强,细胞凋亡受到抑制(P<0.05).结论 miR-148a-3p能负向调控PTEN的表达,从而促进黑色素瘤细胞的生长和迁移,并抑制其凋亡.

Eukaryotic elongation factor-2 kinase (eEF-2K),a negative regulator of protein synthesis,has been shown to play an important role in modulating autophagy and apoptosis in tumor cells under various stresses.In this study,we investigated the regulatory role of eEF-2K in pyroptosis (a new form of programmed necrosis) in doxorubicin-treated human melanoma cells.We found that doxorubicin (0.5-5 μmol/L) induced pyroptosis in melanoma cell lines SK-MEL-5,SK-MEL-28,and A-375 with high expression of DFNA5,but not in human breast cancer cell line MCF-7 with little expression of DFNA5.On the other hand,doxorubicin treatment activated autophagy in the melanoma cells;inhibition of autophagy by transfecting the cells with siRNA targeting Beclin1 or by pretreatment with chloroquine (20 μmol/L) significantly augmented pyroptosis,thus sensitizing the melanoma cells to doxorubicin.We further demonstrated that doxorubicin treatment activated eEF-2K in the melanoma cells,and silencing of eEF-2K blunted autophagic responses,but promoted doxorubicin-induced pyroptotic cell death.Taken together,the above results demonstrate that eEF-2K dictates the cross-talk between pyroptosis and autophagy in doxorubicin-treated human melanoma cells;suppression of eEF-2K results in inhibiting autophagy and augmenting pyroptosis,thus modulating the sensitivity of melanoma cells to doxorubicin,suggesting that targeting eEF-2K may reinforce the antitumor efficacy of doxorubicin,offering a new insight into tumor chemotherapy.

目的 分析核蛋白14 (NOP14)对黑素瘤血管形成的影响.方法 收集2016年1月至2018年12月在广州市第一人民医院经病理确诊的40例黑素瘤患者的黑素瘤组织,免疫组化检测NOP14和CD31[以微血管密度(MVD)表示]的表达.将黑素瘤细胞A375和SK-MEL-1细胞分别分为4组,分别转染空载体(空载体组)、NOP14过表达载体(NOP14组)、靶向NOP14的siRNA(siNOP14组)和阴性对照siRNA(siNC组).荧光定量PCR和Western印迹检测各组NOP14 mRNA和蛋白的表达,Western印迹和ELISA检测细胞及其培养基中血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)的表达.利用Transwell小室构建以上各组A375、SK-MEL-1细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养模型,利用CCK8、Transwell小室和Matrigel血管拟态实验检测共培养后各组HUVEC的增殖、迁移、侵袭和管腔形成能力.采用线性回归模型分析黑素瘤组织中NOP14表达水平与MVD的关系,多因素方差分析检验细胞增殖活性的差异,其余实验指标的两组之间比较采用独立样本t检验.结果 NOP14高表达组(20例)黑素瘤组织MVD为44±13,中表达组(17例)为58± 16,低表达组(3例)为62± 11,且NOP14表达和MVD呈负相关(r=-0.525,P=0.017).与空载体组相比,NOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著降低(P＜0.05).与siNC组相比,siNOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著升高(P＜0.05).在A375与HUVEC共培养模型中,与空载体共组相比,NOP14组HUVEC的增殖活性(F=131.85,P＜0.05)和迁移细胞数[22±5比63±8,t=7.07,P=0.002)、侵袭细胞数(14±5比45±10,t=4.94,P=0.008)及分支节点数(8±2比14±3,t=5.06,P＜0.001)均显著下降;与siNC组相比,siNOP14组HUVEC的增殖活性(F=79.92,P＜ 0.01)和迁移细胞数(152±30比59±4,t=5.36,P=0.006)、侵袭细胞数(134±21比50±8,t=6.40,P＜0.001)及分支节点数(27±3比15±4,t=6.10,P＜ 0.001)显著升高.在SK-MEL-1细胞与HUVEC共培养模型中,各组HUVEC的增殖、迁移和侵袭活性以及管腔形成能力和与各组A375细胞共培养的HUVEC变化趋势一致.结论 黑素瘤组织中NOP14表达和MVD呈负相关,NOP14具有抑制黑素瘤血管新生的作用.

目的 以泊洛沙姆188 (P188)为稳定剂制备高载药量的雷公藤红素纳米混悬剂(Cel-NSps),提高药物的溶解度、释放度和抗肿瘤药效.方法 采用微型化介质研磨法和沉淀法制备Cel-NSps,通过动态光散射法、透射电子显微镜和X射线衍射(XRD)法对粒径、形貌和晶型进行表征并考察其稳定性,透析袋法考察体外释放情况;MTT法评价其对小鼠乳腺癌细胞4T1、人肝癌细胞HepG2、人皮肤恶性黑色素瘤细胞SK-MEL-28、人乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性.结果 微型介质研磨法制备的Cel-NSps平均粒径为(215.7±0.7) nm,多分散指数(PDI)为0.17±0.02,Zeta电位为(-18.0±0.6)mV,平均载药量为(87.62±1.02)％,形状不规则,药物在纳米混悬剂中以晶形态存在;在磷酸盐缓冲液(PBS)、0.9％ NaC1、5％葡萄糖、血浆和人工肠液中能稳定存在,但在人工胃液中不稳定;沉淀法制备的Cel-NSps平均粒径为(133.1±0.8) nm,PDI为0.13±0.02,Zeta电位为(-16.9±1.2)mV,平均载药量为(86.39±0.21)％,近乎球形,药物在纳米混悬剂中以无定形态存在,在各种生理介质中都能稳定存在,可用于口服或静脉注射给药.微型化介质研磨法制备的Cel-NSps呈匀速缓慢的释放,144 h累积释放54.40％;沉淀法制备的纳米混悬剂呈两相释放,前48 h快速均匀释放,之后非常缓慢释放,144h累积释放73.12％,而原料药144 h仅释放11.09％.MTT实验表明,Cel-NSps对4T1、HepG2、SK-MEL-28、MCF-7细胞具有显著的生长抑制作用且呈剂量依赖性,对4种细胞的IC50在0.92～1.96 μg/mL.结论 以P188为稳定剂用2种不同方法制备了小粒径、高载药量的Cel-NSps,成功解决了溶解度差和释放度低的难题,且制备方法简单,易于工业化生产,为雷公藤红素的新药研发奠定了基础.

目的:探讨细胞周期蛋白依赖性激酶4/6 (cyclin-dependentkinases 4/6,CDK4/6)抑制剂哌柏西利对人恶性黑素瘤SK-MEL-5和A375细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.方法:体外培养人黑素瘤A2058、SK-MEL-5和A375细胞,以耐药A2058细胞作为阴性对照.用不同浓度的哌柏西利处理细胞24和48 h后,采用CellTiter-Glo(R)发光法检测哌柏西利对A2058、SK-MEL-5和A375细胞增殖的影响.碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色后检测哌柏西利对A2058、SK-MEL-5和A375细胞周期的影响,蛋白质印迹法检测哌柏西利对SK-MEL-5和A375细胞中细胞周期相关蛋白[CDK4、CDK6、细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)、视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,Rb)和磷酸化Rb (phospho-Rb,p-Rb)]表达的影响.Annexin V-FITC/PI双染法检测哌柏西利对A2058、SK-MEL-5和A375细胞凋亡的影响.采用NOD/SCID小鼠建立A2058、SK-MEL-5和A375细胞的皮下移植瘤模型,将小鼠分为2组[哌柏西利(80 mg/kg)处理组和乳酸钠缓冲液处理组],通过体内实验验证哌柏西利的安全性和疗效.结果:与阴性对照A2058细胞相比,哌柏西利对SK-MEL-5和A375细胞的增殖具有明显抑制作用(P值均＜0.001).哌柏西利能够引起SK-MEL-5和A375细胞中G1期细胞所占比例增高(P值均＜0.05);蛋白质印迹法检测发现哌柏西利能够使SK-MEL-5和A375细胞中细胞周期G1/S期检查点关键蛋白CDK4、CDK6、cyclin D1以及p-Rb的表达水平明显下调(P值均＜0.001).哌柏西利对A2058、SK-MEL-5和A375细胞均未见明显的促凋亡作用(P值均＞ 0.05).在荷瘤小鼠模型中,哌柏西利安全性高,对小鼠移植瘤的生长具有明显的抑制作用[对SK-MEL-5细胞移植瘤的抑制率为(64.6±9.8)％,对A375细胞移植瘤的抑制率为(76.3±6.6)％](P值均＜0.001).结论:哌柏西利对黑素瘤SK-MEL-5和A375细胞的增殖具有明显抑制作用,可引起细胞周期G1期阻滞.