目的:探索原核表达新型冠状病毒受体结合蛋白（RBD）的制备方法，并对其在小鼠体内的免疫原性进行评价。方法:用大肠埃希菌表达重组新型冠状病毒RBD，进行纯化、透析复性，比较了RBD复性前后的结构表征和抗原活性变化，最后将制备所得重组RBD免疫Babl/c小鼠，检测免疫小鼠体内的体液免疫和细胞免疫变化情况。结果:完成了大肠埃希菌表达的新型冠状病毒重组RBD的制备。复性前后，RBD的自发荧光波长发生蓝移现象，从（363.33±0.47）nm蓝移至（333.00±0.82）nm，蛋白形状从无序状态折叠为（9.55±0.39）nm的颗粒，复性后RBD与ACE-2的结合活性是复性前的128倍。活病毒中和抗体检测结果显示：血清对原型株的滴度几何平均数为136.70，对贝塔株为101.59，两者无统计学差异( t=0.41， P=0.700)。试验组小鼠脾淋巴细胞产生的分泌特异性IFN-γ的效应T细胞为(308.50±144.11)个斑点形成细胞/5×10 5个细胞，低于对照组[(3.75±3.11)个斑点形成细胞/5×10 5个细胞]，差异有统计学差异( t=4.72， P=0.010)。 结论:成功制备原核表达的新型冠状病毒重组RBD，通过体外复性折叠，能够产生良好、全面的免疫原性。

目的:克隆幽门螺杆菌(Hp)hp0169基因并进行晶体学研究,分析其二级结构和三维结构.方法:由UniProt数据库中检索Hp NCTC26695菌株hp0169基因及其编码蛋白序列,采用生物信息学方法分析Hp重组胶原蛋白酶(HpPrtC)蛋白理化性质,SOPMA和DNAStrar软件预测HpPrtC蛋白二级结构特征,SWISS-MOPEL软件构建HpPrtC蛋白三维结构,IEDB和ABCpred软件预测HpPrtC蛋白B淋巴细胞抗原表位,SYFPEITHI网站预测T淋巴细胞抗原表位,专家库(EP)算法和随机森林(RF)算法预测HpPrtC蛋白可结晶性.原核表达HpPrtC重组蛋白,经Ni2+亲和层析和分子筛技术纯化蛋白,结晶试剂盒筛选HpPrtC的结晶条件.结果:hp0169基因共包含1 269个碱基配对,编码蛋白全长422个氨基酸,理论等电点为7.64,相对分子质量为47 300.HpPrtC蛋白为亲水性、可溶性蛋白.HpPrtC蛋白α螺旋的氨基酸数量占全部氨基酸数量百分率为35.78%,β片层为18.72%,β转角为 6.87%,无规则卷曲为 38.63%.抗原表位分析,HpPrtC蛋白含有B淋巴细胞的 5个优势线性表位和 3个构象表位及多个T淋巴细胞潜在优势抗原表位.同源建模,HpPrtC蛋白呈二聚体,单体由β折叠围成桶状结构,周围被α螺旋和无规则卷曲围绕.HpPrtC蛋白为中等难度结晶,且无信号肽和跨膜螺旋,在 0.2 mol·L-1 氯化镁、0.1 mol·L-1 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3.4 mol·L-1 己二醇和pH 8.5条件下出现细小成簇的针状晶体.结论:HpPrtC是一种亲水型蛋白,呈二聚体构造,在适宜条件下呈细小成簇针状晶体,其具有T淋巴细胞和B淋巴细胞优势抗原表位,可作为Hp疫苗设计的抗原,用于构建多价融合疫苗或多表位疫苗,本研究结果为Hp的防治提供了实验基础.

利用聚合酶链式反应从苦参植物叶片中扩增出热应激蛋白基因hsp编码区序列,并成功构建了pET22b-hsp原核表达载体,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株,在不同温度、时间和不同浓度的IPTG诱导下实现了HSP的体外表达,获得了hsp编码区序列,长度为498 bp,编码166个氨基酸,分子质量约17.8 ku的小分子热应激蛋白(HSP17.8).对此蛋白的物理化学性质、同源进化树、二级结构以及三维结构等生物信息学分析表明:HSP17.8为稳定的亲水性蛋白,其具有多个N-豆蔻酰化位点、磷酸化位点和N-糖基化位点;与羽扇豆应激蛋白HSP的同源性最高,亲缘关系最近;HSP17.8蛋白的结构特点是α螺旋与β折叠依次出现,形成了β1-α1-β2-α2-β3-α3-β4-α4-β5的折叠方式,且同一方向的β折叠被α螺旋包裹在空间结构的内部,构成了立体结构的框架.首次从苦参中成功克隆热应激蛋白基因hsp17.8编码区序列,并在体外得到了其最佳的诱导表达条件,分析了HSP17.8的理化特性、进化关系及结构特点,为该蛋白结构、功能研究奠定了实验基础.

GRNINTERACTING FACTOR (GIF)基因是植物叶发育相关的一类重要调控因子,调节植物叶器官的发育.该研究采用RT-PCR方法从茶树‘龙井43’的叶片cDNA中克隆得到CsGIF1基因,并利用荧光定量PCR分析了高温(38℃)、低温(4℃)、干旱(200 g·L-1 PEG)、盐胁迫(200 mmol·L-1 NaCl)下CsGIF1基因的表达水平,以明确CsGIF1基因对非生物胁迫的应答特性,为茶树CsGIF1基因的逆境调控以及功能研究奠定基础.结果表明:(1) CsGIF1基因长666 bp,编码221个氨基酸,具有高度保守的SNH结构域;CsGIF1蛋白为亲水性蛋白,理论相对分子质量为23 380,理论等电点为6.30;酸性氨基酸、碱性氨基酸、芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸所占比例分别为7％、9％、5％和13％;蛋白质二级结构显示,茶树CsGIF1蛋白由38.01％的α-螺旋、10.41％的β-折叠、12.22％的延伸主链和39.37％的随机卷曲组成.(2)qRT PCR分析显示,茶树CsGIF1基因对于4种非生物胁迫均有响应,但不同处理响应不同.其中在胁迫2h时,高温和低温胁迫下,CsGIF1基因相对表达量显著增加,分别为对照的3.54和5.69倍,且高低温胁迫下,CsGIF1基因响应明显大于干旱和盐胁迫.在高温、低温、干旱、盐等不同胁迫处理下,茶树‘龙井43’中CsGIF1基因的表达水平与对照相比均差异明显.

目的 应用生物信息学技术预测广州管圆线虫钙网蛋白(CRT)的结构和功能,为进一步研究广州管圆线虫提供理论依据.方法 于NCBI PROTEIN数据库中确定广州管圆线虫钙网蛋白的氨基酸残基序列.应用分析工具Blast、Protparam、InterProScan、protscale、SignalP-3.0、PSORTⅡ、BepiPred、TMHMM、VectorNTI Suite 11软件包、Phyre2分别进行该蛋白质的基本性质、结构域、疏水性、信号肽、亚细胞定位、抗原表位、跨膜区及空间结构的预测及分析.结果 Blast预测该蛋白为钙网蛋白,有401个氨基酸残基,理论分子量为46552.67 Da,具有钙网蛋白超家族结构域,为亲水蛋白,具有明显的信号肽和1个跨膜螺旋,具有9个B细胞抗原表位,二级结构含6个α-螺旋和18个β-折叠股.结论 钙网蛋白与广州管圆线虫的感染免疫密切相关,可参与感染过程或宿主免疫应答,具有作为诊断抗原分子的价值和潜在的疫苗候选分子.

目的 克隆日本血吸虫金属β内酰胺酶结构域蛋白1(Metallo-beta-lactamases domain-containing protein 1,MBLAC1)基因,并研究其编码蛋白的生物学特性.方法 以成虫虫体cDNA为模板,利用PCR技术扩增Sj MBLAC1基因,并通过生物信息学技术分析该基因编码蛋白的结构特征.结果 Sj MBLAC1扩增基因片段大小为711 bp,编码236个氨基酸,预测蛋白质分子量约为26 kD,理论等电点为4.84.该蛋白的第7～222位氨基酸为保守结构域,属于MBL超级家族;不存在跨膜结构域及信号肽;具有一个N-糖基化位点,在第186位氨基酸;二级结构中包含α-螺旋8.90％、β-折叠27.97％、无规则卷曲区域63.14％,推测Sj MBLAC1蛋白具有9个优势B细胞抗原表位.结论 成功克隆了Sj MBLAC1基因并对其编码蛋白进行了生物信息学分析,从而为开展该蛋白的生物学功能研究及筛选抗血吸虫病疫苗候选分子提供了基础.

蛋白质是生命活动的执行者,除了催化数千种化学反应,蛋白质还在生物的身体结构、信息传递、生物防卫等方面起不可或缺的作用.不同的生理功能不仅需要不同的蛋白质,还需要蛋白质分子形成各自的结构和形状.而蛋白质分子是由不分支的肽链组成的,从新合成的肽链到具有特定三维结构和有生理功能的蛋白质,需要复杂精细的肽链折叠过程.由于各种折叠方式之间的能量差别甚小,许多因素,包括自身浓度的变化、分子中一部分肽链缺失或者延长、基因突变引起的氨基酸残基改变、环境中酸碱度改变、离子浓度变化、周围的分子环境变化等,都能使肽链的折叠方式发生改变.肽链折叠方式改变的后果之一,就是形成特殊的？？折叠:肽链中彼此平行而又方向相反的区段以氢键联系,形成片状结构,多个分子的这种片状结构还能逐层叠加,形成纤维状的聚合物.不仅如此,这样的“异常”结构还会使“正常”的蛋白也改变折叠方式,变成和自己一样的结构,因此这些“异常”结构的蛋白质具有“传染性”,即能复制自己的结构,统称“传染性蛋白”,词源是从英文的Prion一词意译而来.在许多情况下,这种“折叠错误”的蛋白会丧失原有的生理功能,且其聚合物对细胞有害,引起疾病,包括疯牛病、痒羊病(Scrapie)、人类的克-雅氏病、老年痴呆、帕金森氏症、杭廷顿氏症等中枢神经系统病症.除了这些疾病,折叠错误的蛋白还可沉积在身体各处,引起各种“淀粉样变性病”(Amyloidosis).另一方面,Prion型的蛋白由于其稳定性和特殊结构,又可获得新的生理功能,在生物材料的建造,物质储存、作为黑色素和牙釉质合成时的模板、动物的长期记忆,以及免疫系统的信息传输中发挥重要作用,即一些传染性蛋白也能发挥正常的、甚至不可替代的生理功能.以3个部分分别介绍传染性蛋白被发现的历史和形成机制、传染性蛋白所引起的疾病(负面),以及传染性蛋白执行的正常生理功能(正面).

目的 探讨蛋白酶体抑制剂MG132对乳腺癌细胞株MHC-I类相关分子A (MHC class I-related molecules A, MICA) 蛋白稳定性及NK杀伤活性作用.方法 乳腺癌细胞株MICA全基因检测.构建乳腺癌细胞株MICA等位基因真核表达载体, 转染293T细胞.流式细胞术及Western blot检测乳腺癌细胞株MICA表达.MTT检测MG132对乳腺癌细胞生长抑制.LDH检测NK细胞杀伤活性.结果 MDA-MB-231基因序列为MICA*019/A5, MDA-MB-435S基因序列为MICA*010/A5, 仅在蛋白N端 (膜外区) 第29位氨基酸有差异:MICA*019/A5在该位点为Arg (精氨酸), 而MICA*010/A5在该位点为Pro (脯氨酸), Arg或Pro位点在蛋白结构的一个beta折叠上, 而且是处于偏中间的位置.MG132对转染的293T细胞增殖均有明显抑制作用.MG132处理转染的293T细胞后, MDA-MB-435S MICA基因来源的293T细胞MICA表达降低, 并随作用时间影响更明显, 对NK杀伤敏感下降.MDA-MB-231 MICA基因来源的293T细胞MICA表达无明显改变, 对NK杀伤活性敏感性不受影响.结论 NK杀伤敏感性与乳腺癌细胞MICA表达密切相关, MG132影响MDA-MB-435S MICA稳定性, 所以影响NK杀伤敏感性, MDA-MB-231不受影响.

为克隆鉴定甘蔗泛素结合酶基因 (Sugarcane ubiquitin-conjugating enzyme, ScUBc E2) 并探索其在激素信号通路和甘蔗与黑穗病互作过程中的作用, 选择黑穗病菌胁迫下甘蔗抑制消减杂交文库 (Suppression subtractive hybridization, SSH) 中注释为泛素结合酶的差异表达EST序列为探针, 结合电子克隆技术和RT-PCR技术, 以甘蔗cDNA为模板进行泛素结合酶基因克隆.对克隆获得的序列进行生物信息学分析, 并利用qRT-PCR技术分析该基因在甘蔗根、蔗髓、叶、芽中的组织特异性表达以及在黑穗病菌、茉莉酸甲酯 (Methyl jasmonate, Me JA) 、脱落酸 (Abscisic acid, ABA) 和水杨酸 (Salicylic acid, SA) 胁迫下的表达情况.最终克隆得到一条长度为699 bp的甘蔗泛素结合酶基因 (ScUBc E2;Gen Bank accession number:KJ577594.1), 该基因包含长度为447 bp的完整开放读码框, 编码148个氨基酸.生物信息学分析结果显示, ScUBc E2编码的蛋白分子量 (Mr) 为16.507×103;无信号肽, 为碱性不稳定的亲水蛋白;包含4个α螺旋、4个β折叠和一些无规则卷曲;第15位氨基酸为泛素化位点, 74-89位氨基酸为活性位点;在进化过程中与高粱泛素结合酶基因的亲缘关系最近.qRT-PCR分析结果表明, ScUBc E2基因组成型表达, 但在芽中的表达量最高;其表达在甘蔗感黑穗病基因型ROC22中受到黑穗病菌胁迫的抑制, 在黑穗病抗病基因型YC05-179中则先被抑制, 后被诱导;ScUBc E2基因受MeJA及SA诱导表达, 对ABA胁迫的响应不明显.本研究表明, 甘蔗ScUBc E2基因在抗病基因型和感病基因型甘蔗中存在不同表达模式, 可能参与甘蔗与黑穗病菌的互作过程, 有望为抗病育种分子标记提供潜在基因资源;同时, 该基因受MeJA和SA外源激素胁迫后的表达模式, 可为泛素-蛋白酶体途径及激素调控的信号转导在甘蔗与黑穗病菌互作过程中的作用提供一定的理论依据.

目的 获取树鼩β-淀粉样前体蛋白切割酶BACE1(beta-site APP cleaving enzyme-1)的全长编码序列并进行分子特征分析,为开展AD疾病的机制研究提供依据.方法 提取树鼩大脑及其他脏器组织总RNA,通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)实验得到的序列与中间序列进行拼接得到树鼩BACE1全长编码序列,使用DNAMAN、MEGA 10.0.5、PyMOL等生物信息学软件,对其序列和分子特征进行分析.结果 树鼩BACE1除在脑组织表达外,在外周组织也有表达.树鼩BACE1核酸序列和蛋白质分子整体结构与人类高度相似,树鼩与人类的BACE1蛋白在膜内结构区均存在一个高度保守的DXXLL的ACDL分选内吞基序,两者具有相同的胞外域、跨膜域及胞内域,但树鼩BACE1蛋白质相比人少一个潜在的乙酰基化位点,并且在折叠结构上存在差异.结论 本研究获得树鼩BACE1基因完整编码序列,其蛋白基本结构与人的基本相似,提示树鼩可能是作为研究AD病理改变或药物研究潜在的理想模型.