该研究旨在通过观察苓桂术甘汤(Linggui Zhugan Decoction,LGZGD)含药血清对心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)纤维化及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白分子表达的调控机制.制备空白血清和LGZGD含药血清,胰酶-胶原酶依次消化并结合差速贴壁法分离培养原代CFs,采用免疫荧光标记鉴定原代CFs.设正常对照组,模型组,20％空白血清组,5％、10％、20％LGZGD含药血清组.分别用20％空白血清,5％、10％、20％LGZGD含药血清预处理12 h,除正常对照组,其余5组均加入过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)刺激细胞,建立原代CFs纤维化模型.采用划痕愈合实验观察细胞迁移能力,ELISA法检测Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)含量,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Wnt1、糖原合酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶 3β(phospho synthase kinase 3 beta,p-GSK-3β)、β-catenin 及细胞核β-catenin 的蛋白表达,RT-qPCR 检测 β-catenin、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)的基因表达,免疫荧光技术检测关键蛋白α-SMA、β-catenin的表达及定位.制备Wnt1过表达CFs,采用H2O2处理CFs.设正常对照组、模型组、20％LGZGD含药血清组、空载质粒+20％LGZGD含药血清组、Wnt1过表达+20％LGZGD含药血清组.采用ELISA法检测Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量与其比值,Western blot法检测α-SMA和Wnt1、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及细胞核β-catenin的蛋白表达,RT-qPCR检测β-catenin、MMP9的基因表达.免疫荧光染色显示,心肌成纤维细胞Vimentin表达阳性,呈绿色,胞核为蓝色,纯度大于90％,鉴定是原代CFs.结果显示,与正常对照组相比,模型组CFs 愈合率增强,Col Ⅰ、Col Ⅲ 含量升高,Col Ⅰ/Col Ⅲ 比值增大,α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核β-catenin 蛋白表达上调,GSK-3β蛋白表达降低,β-catenin、MMP9 mRNA表达显著升高,β-catenin、α-SMA荧光强度明显增强,表达量明显增多;与模型组相比,5％、10％、20％LGZGD含药血清能显著抑制细胞迁移能力,减少Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量,降低Col Ⅰ/Col Ⅲ比值,下调α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核 β-catenin 蛋白表达,提高 GSK-3β 表达,减少 β-catenin、MMP9 的 mRNA 表达,降低β-cate-nin、α-SMA荧光强度和表达量;与空载质粒+20％LGZGD含药血清组比,过表达Wnt1后,LGZGD作用被显著逆转.LGZGD能够减少胶原纤维过度沉积,抑制成纤维细胞过度增生,改善心肌纤维化进程.LGZGD改善心肌纤维化的作用与调控Wnt/β-catenin通路,减少胶原沉积,保护心肌细胞有关.

目的:观察miR-217对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肝星状细胞（HSC）活化的影响，观察四氯化碳（CCl 4）诱导小鼠中miR-217过表达产生的效果，阐明miR-217在肝纤维化中的作用。 方法:使用AngⅡ刺激HSC并检测miR-217表达水平的变化情况。将HSC分为对照组、AngⅡ处理组和AngⅡ+miR-217处理组，检测各组中α-平滑肌肌动蛋白，成纤维细胞特异蛋白1和Ⅰ型胶原蛋白（Collagen I）的表达水平。采用TargetScan和双荧光素酶报告基因实验对miR-217的靶基因进行筛选及验证。荧光实时定量PCR和Western blot检测miR-217对转化生长因子β受体Ⅱ （TGFBR2）表达水平的影响。构建CCl 4诱导的小鼠肝纤维化模型，Masson染色和天狼星红染色检测过表达miR-217对CCl 4小鼠肝纤维化进程的影响。2组数据间的比较采用 t检验，多组数据比较采用One-Way ANOVA进行统计分析。 结果:AngⅡ刺激HSC细胞能下调miR-217的表达水平，转染miR-217 mimics能抑制AngⅡ诱导的α-平滑肌肌动蛋白，成纤维细胞特异蛋白1和Collagen I的表达水平。miR-217能特异性结合TGFBR2的3’-UTR，转染miR-217 mimic能抑制HSC中TGFBR2的mRNA和蛋白表达水平。CCl 4小鼠中过表达miR-217能抑制Collagen I和Collagen Ⅲ的表达水平，缓解肝纤维化进程。 结论:miR-217通过靶向调控TGFBR2调节肝纤维化，抑制AngⅡ诱导的HSC活化，减缓CCl 4小鼠的肝纤维化进程，表明miR-217可能具有抑制肝纤维化的功能。

目的:结合生物信息学分析结果研究头蛋白基因(NOG)在博来霉素诱导的A549细胞衰老模型中的作用及分子机制。方法:从GEO数据库下载IPF数据集GSE28042和GSE135893。在GSE28042中，运用R软件进行衰老相关基因的差异表达分析，通过单因素Cox回归初步筛选出与预后相关的基因，利用随机森林和LASSO回归2种算法，筛选出关键基因。采用Kaplan-Meier法绘制NOG高、低表达组患者的生存曲线。应用统一流形逼近与投影算法对GSE135893数据集中的单细胞测序数据降维，分析NOG在Ⅱ型肺泡上皮细胞的差异表达。采用随机数字表法将12只6~8周龄的C57BL/6小鼠随机分为对照组和实验组，每组6只，实验组小鼠气管内滴注博来霉素构建肺纤维化模型，取小鼠肺组织进行免疫组织化学染色和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测NOG的蛋白和mRNA表达水平。将A549细胞分为空白对照组、博来霉素组(5 mg/L)、阴性对照组(博来霉素5 mg/L+空载体慢病毒)以及NOG过表达组(博来霉素5 mg/L+NOG过表达慢病毒)，应用蛋白质印迹法检测各组衰老相关蛋白P16、P21，Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白以及Ⅰα型胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达，并应用SA-β-Gal染色检测各组细胞衰老细胞所占的比例。结果:GSE28042数据集中筛选出95个差异表达的衰老相关基因，其中35个上调，60个下调。结合单因素Cox回归、LASSO回归和随机森林算法，筛选出关键衰老相关基因NOG。高表达NOG的IPF患者总体生存时间较低表达NOG的IPF患者更长( P<0.05)。单细胞测序显示NOG在IPF患者Ⅱ型肺泡上皮细胞的表达量低于正常肺组织( P<0.05)。RT-qPCR及免疫组织化学染色结果提示NOG在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化组织中为低表达( P值均<0.05)。博来霉素组A549细胞中的NOG蛋白表达低于空白对照组和NOG过表达组( P值均<0.05)。博来霉素组A549细胞的衰老相关蛋白、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白以及Ⅰα型胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达水平高于空白对照组和NOG过表达组( P值均<0.05)。SA-β-Gal染色结果提示博来霉素组A549细胞株中衰老细胞的比例明显高于空白对照组和NOG过表达组( P值均<0.05)。 结论:NOG在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化组织内呈低表达，过表达NOG可以通过Wnt/β-catenin信号通路减轻博来霉素诱导的A549细胞衰老，从而抑制肺纤维化的进展。

目的:探讨临床ⅠA期肺腺癌的基因突变特征及其与患者预后的关系，为早期肺腺癌患者的个体化治疗提供依据。方法:收集2007年1月至2012年10月在中国医学科学院肿瘤医院接受手术切除且随访达10年以上或随访期间出现复发或转移的临床ⅠA期肺腺癌患者63例，采用全外显子组测序（WES）技术分析肺癌组织的基因突变谱，采用单因素和多因素Cox回归分析明确患者预后影响因素。结果:在随访期间，63例患者中13例（20.6%）出现复发或转移。WES技术分析显示，肺癌组织中表皮生长因子受体突变频率最高，达65.1%（41/63），其次为肿瘤蛋白p53、异常类脂肪酸1、低密度脂蛋白受体相关蛋白1B、雷帕霉素机械靶点、磷脂酰肌醇4，5-双磷酸3-激酶催化亚单位γ（PIK3CG）及与SWI/SNF相关基质相关的依赖于肌动蛋白的染色质调节因子亚家族A成员4，突变频率分别为30.2%（19/63）、20.6%（13/63）、15.9%（10/63）、15.9%（10/63）、15.9%（10/63）和15.9%（10/63）。多因素Cox回归分析显示，PIK3CG突变（ HR=21.52，95% CI：3.19～145.01）、平滑蛋白（SMO）突变（ HR=35.28，95% CI：3.12～398.39）、β-连环蛋白1（CTNNB1）突变（ HR=332.86，95% CI：15.76～7 029.05）、集落刺激因子1受体（CSF1R）突变（ HR=8 109.60，95% CI：114.19～575 955.17）、v-Raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源B（BRAF）突变（ HR=23.65，95% CI：1.86～300.43）为临床ⅠA期肺腺癌患者预后的独立危险因素。 结论:PIK3CG、SMO、CTNNB1、CSF1R、BRAF基因突变与临床ⅠA期肺腺癌的远期复发和转移密切相关，应给予具有这些基因突变的肺腺癌患者更为密切的临床关注。

目的:使用串联质谱标签(TMT)方法筛选甲状腺相关眼病(TAO)继发限制性斜视患者和共同性斜视患者的眼外肌差异表达蛋白。方法:收集2019年8月至2020年12月于北京大学人民医院眼科诊断为TAO继发限制性斜视并行斜视矫正术5例患者的眼外肌标本，收集同期5例共同性内斜视行斜视矫正术患者的眼外肌作为对照。采用基于TMT的蛋白质组学技术，对TAO组和对照组眼外肌的差异表达蛋白进行筛选及生物信息学分析。设定倍数变化≥1.2或≤0.83且 P值<0.05作为筛选差异表达蛋白的阈值。利用UniProtGOA蛋白数据库和STRING蛋白网络互作数据库分析差异表达蛋白的基因本体(GO)注释、KEGG通路富集和蛋白－蛋白相互作用关系。 结果:TAO组与对照组眼外肌总差异表达蛋白数量为53个，其中表达上调蛋白34个，表达下调蛋白19个。通过GO注释发现，按其生物学过程分类，这些差异表达蛋白主要参与了对刺激的反应过程、多细胞生物过程、代谢过程、发育过程、细胞内信号转导、正向生物调控过程；KEGG通路富集分析发现差异表达蛋白主要参与了局部黏附、紧密连接、细胞骨架调控、凋亡等通路。蛋白－蛋白相互作用分析发现肌球蛋白重链2、肌球蛋白重链7、肌球蛋白调节轻链、α辅肌动蛋白2、纤维蛋白原α链和纤维蛋白原β链6个关键蛋白。结论:TAO继发限制性斜视患者与共同性斜视患者的眼外肌中蛋白表达存在差异，肌球蛋白、辅肌动蛋白、细丝蛋白可能通过参与细胞骨架调控、局部黏附等参与TAO的发病机制。

目的:研究泛Janus激酶(Janus kinase,JAK)抑制剂托法替布(tofacitinib)对转化生长因子-β1(transfor-ming growth factor-beta 1,TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的作用及机制,为临床治疗结缔组织病相关的间质性肺疾病提供理论依据.方法:(1)体外培养人胚胎肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast 1,HFL-1),设立6个组,分别为DMSO空白对照组、TGF-β1诱导组、TGF-β1联合不同浓度托法替布(0.5、1.0、2.0、5.0 μmol/L)药物干预实验组.采用CCK-8法检测细胞活力,划痕愈合实验检测细胞迁移能力.(2)采用实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)、蛋白免疫印迹实验(Western blotting)检测 α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ 型胶原蛋白(collagen Ⅰ,COL1)基因及蛋白的表达水平.应用RT-PCR和酶联免疫吸附试验检测各组白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的基因和细胞培养上清液中的蛋白水平.(3)在不同组的细胞培养基中加入DMSO载体对照,以1.0μmol/L和5.0 μmol/L的托法替布预培养30 min,然后加入TGF-β1处理1 h、6 h和24 h.以Western blotting检测Smad2/3、信号传导和转录激活因子3(sig-nal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的蛋白磷酸化水平.结果:(1)托法替布抑制TGF-β1诱导的HFL-1细胞活力及迁移能力.(2)与空白对照组相比,TGF-β1诱导组HFL-1的α-SMA、COL1A1和FN1基因表达显著上调(P＜0.05).5.0 μmol/L托法替布干预组的α-SMA基因表达与TGF-β1诱导组相比显著下调(P＜0.05)o 0.5～5.0 μmol/L托法替布各干预组与TGF-β1诱导组相比均可抑制FN1基因表达(P＜0.05).各干预组与TGF-β1诱导组相比,COL1A1基因的表达无明显变化.(3)Western blotting结果提示,TGF-(31诱导组细胞α-SMA、FN1蛋白水平较对照组显著增加(P＜0.05),COL1A1表达未见明显差异.托法替布不同浓度干预组与TGF-β1诱导组相比,α-SMA蛋白表达均有下降,其中2.0 μmol/L和5.0 μmol/L干预组与诱导组间的差异有统计学意义(P＜0.05).托法替布不同浓度干预组的FN1蛋白水平均有下降,但与TGF-β1诱导组相比差异无统计学意义.各干预组的COL1A1蛋白表达与TGF-β1诱导组相比差异无统计学意义.(4)TGF-β1诱导48 h,HFL-1细胞中IL-6基因及培养上清液中IL-6的表达水平较对照组显著升高,各浓度托法替布干预组与TGF-β1诱导组相比均有所降低.TGF-β1诱导1 h、6 h和24 h,STAT3蛋白磷酸化水平增加,托法替布预刺激抑制了 6 h时Smad2/3的磷酸化水平,在1 h、6 h和24 h时均抑制了 STAT3的磷酸化水平.结论:托法替布能抑制TGF-β1诱导的HFL-1细胞向肌成纤维细胞方向转化,其机制可能是通过抑制Smad2/3经典通路以及抑制TGF-β1所诱导的STAT3磷酸化,从而对肺纤维化疾病进展发挥保护作用.

目的 探讨YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的新生大鼠原代心肌细胞肥大和凋亡的影响.方法 为探讨AngⅡ刺激下YTHDF2的表达水平,将细胞分为正常组和AngⅡ组.为探讨沉默YTHDF2对心肌细胞肥大与凋亡的影响,将细胞分为4组,空白组[转染阴性对照小干扰RNA(siRNA)+PBS]、siYTHDF2 组[转染 YTHDF2 siRNA(siYTHDF2)+PBS]、模型 组(siRNA+Ang Ⅱ)和实验 组(siYTHDF2+Ang Ⅱ).用 Western blot和逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测YTHDF2基因表达水平,RT-qPCR检测心肌肥厚相关基因心房钠尿肽(ANP)、B型钠尿肽(BNP)和β肌球蛋白重链(β-MHC)及心肌细胞凋亡相关基因Bax、B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)mRNA的表达水平,免疫荧光染色观察心肌细胞表面积,原位末端标记法染色观察心肌细胞凋亡情况,免疫沉淀反应验证YTHDF2和Bcl-2的结合关系.结果 AngⅡ组YTHDF2蛋白表达及mRNA水平显著高于正常组(1.49±0.03 vs 0.97±0.09,1.50±0.08 vs 1.00±0.07,P＜0.05).与空白组比较,模型组心肌细胞表面积增大,细胞凋亡率升高,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显升高,Bcl-2 mRNA表达明显降低(P＜0.05).与模型组比较,实验组心肌细胞表面积减小,细胞凋亡率降低,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显降低,Bcl-2 mRNA表达明显升高(P＜0.05).结论 沉默YTHDF2可以缓解AngⅡ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡,YTHDF2通过与Bcl-2相结合抑制其表达水平.

目的 探讨牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)对转化生长因子β1(TGF-β1)所诱导的心肌成纤维细胞(CFs)活化的作用及相关机制,为TUDCA治疗糖尿病心肌纤维化提供新的治疗目标.方法 提取原代SD乳鼠CFs和心肌细胞,通过免疫荧光法鉴定CFs的纯度.分别将高糖培养下的CFs用不同时间的TGF-β1干预,用Western blot检测内质网应激(ERS)通路相关蛋白和纤维化指标的表达,探讨TGF-β1对CFs活化及ERS相关通路的影响.用Western blot检测CFs和心肌细胞内同型半胱氨酸内质网应激泛素样结构域1(Herpud1)的表达情况.通过沉默Herpud1的表达及用Transwell和Western blot检测沉默Herpud1后CFs纤维化指标的表达,探讨Herpud1在TGF-β1诱导的CFs活化中的作用.用CCK-8检测不同浓度的TUDCA处理下CFs的活力.用免疫荧光和Western blot检测TUDCA对TGF-β1诱导的CFs中Herpud1、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录激活因子6(ATF6)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)和Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)表达的影响.为进一步明确Herpud1在TUDCA抑制CFs活化中的作用,用Western blot检测过表达Herpud1后相关蛋白的表达情况.结果 在成功构建CFs纤维化模型的基础上,TGF-β1能够诱导CFs活化及ERS通路相关蛋白的表达;Herpud1在CFs中的表达高于心肌细胞;敲除Herpud1可抑制TGF-β1所诱导的CFs活化;TUDCA 能显著降低 TGF-β1 诱导的 CFs 中 GRP78、ATF6、α-SMA、Vimentin 和 Collagen Ⅰ 的表达水平;此外,过表达Herpud1还可逆转TUDCA对TGF-β1诱导的CFs活化的抑制.结论 下调Herpud1基因的表达是TUDCA抑制TGF-β1诱导的CFs纤维化的机制之一.

目的 构建经门静脉直接注射日本血吸虫虫卵诱导血吸虫肝病小鼠模型并评价其效果,为血吸虫肝病研究提供新的动物模型.方法 将15只8周龄的C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组和注射虫卵组,其中对照组5只,注射虫卵组10只.第-14天将5 000个活虫卵注射至小鼠腹腔,第0天麻醉小鼠后剖开腹腔,经门静脉注入5 000个虫卵,对照组注射等体积的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS).分别于第10天、第30天处死虫卵组小鼠各5只,第10天处死对照组小鼠,收集小鼠血清和肝组织,通过进行苏木素-伊红染色(HE染色)、马松染色(Masson染色),微孔板分光光度计法检测丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、肝脏羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量,以及实时荧光定量PCR(qPCR)法检测肝纤维化相关基因、Th1和Th2型免疫反应相关基因,分析肝损伤、虫卵肉芽肿和纤维化以及适应性免疫反应等指标,评价经门静脉注射虫卵诱导血吸虫肝病小鼠模型的效果.结果 经门静脉注射虫卵10d和30d后,小鼠肝脏出现明显的虫卵肉芽肿,第10天组虫卵肉芽肿面积与第30天组相比,差异无统计学意义(t=0.975,P=0.332).Masson染色和肝脏羟脯氨酸含量检测显示肝脏发生明显纤维化.qPCR结果表明,与对照组相比,第10天组小鼠肝组织纤维化标志基因α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-Sma)、Ⅰ 型胶原(collagen type Ⅰ alpha 1,Col1 α1)、转化生长因子 β1(transforming growth factor beta 1,Tgfb1)表达水平显著升高,差异有统计学意义(t=6.380、7.533、5.314,P=0.002、0.001、0.007);在第30天时出明显下降,与对照组相比差异无统计学意义(t=0.940、1.529、1.746,P=0.778、0.543、0.457).同时,Th1型免疫反应相关基因肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,Tnf)、干扰素-γ(interferon gamma,Ifng)和 Th2 型免疫反应相关基因白细胞介素 5(interleu-kin-5,Il5)、白细胞介素 13(interleukin-13,Il13)表达水平在注射虫卵10 d后显著升高,差异有统计学意义(t=6.163、4.589、5.651、5.367,P=0.003、0.018、0.020、0.009).此外,各组小鼠血清中的AST、ALT水平无明显变化,差异无统计学意义(t=0.982、3.450,P=0.771、0.074;t=1.164、0.564,P=0.697、0.917).结论 经门静脉注射虫卵诱导血吸虫肝病小鼠模型构建成,研究结果为血吸虫病肝纤维化的机制研究提供了新的建模方法.

目的 通过体内体外实验探讨结肠癌相关转录本2(colon cancer-associated transcript 2,CCAT2)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞增殖的影响及其调控机制.方法 利用shRNA干扰NSCLC细胞(A549和H1299)CCAT2表达.实时定量PCR (quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR)检测CCAT2表达.肿瘤成球实验和CCK-8实验检测细胞增殖.蛋白印记法检测细胞增殖标记蛋白-细胞增殖核抗原-67(antigen identified by monoclonal antibody,Ki-67)和增殖细胞核抗原(proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA),TGF-β信号通路相关蛋白转化生长因子(transforming growth factor beta,TGF-β),细胞信号转导分子Smad2(suppressor of mothers against decapentaplegic 2)和α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)的表达.结果 NSCLC细胞系(A549、H1299、H1650和H358)中CCAT2的表达显著高于正常肺脏细胞系BEAS-2B(P＜0.01).与对照组相比,转染CCAT2shRNA后A549和H1299细胞中CCAT2的表达显著降低(P＜0.01).A549和H1299细胞中CCAT2shRNA组细胞增殖倍数明显低于对照组(P＜0.05).与对照组相比,A549和H1299细胞中CCAT2shRNA组细胞增殖标记蛋白Ki-67和PCNA表达显著降低(P＜0.01),TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β、Smad2和α-SMA表达显著升高(P＜0.01).与对照组相比,CCAT2shRNA组肿瘤体积显著变小(P＜0.01),肿瘤组织中TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β、Smad2和α-SMA表达显著升高(P＜0.01).结论 CCAT2可通过抑制TGF-β信号通路促进NSCLC细胞增殖和肿瘤生长.